KR101248404B1

KR101248404B1 - 아네모네 리불라리스로부터 분리된 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101248404B1
Application number: KR1020120120533A
Authority: KR
Inventors: 나민균
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2013-04-02

Abstract

본 발명은 아네모네 리불라리스로부터 분리된 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B는 인슐린 수용체(insulin receptor) 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates)의 탈인산화를 일으켜 인슐린의 신호전달 기전을 방해함으로써 인슐린 저항성을 야기시키고, 렙틴 수용체 및 Jak에서 일어나는 인산화를 저해함으로써 렙틴 신호전달 기전을 억제하는 역할을 하여 비만을 일으키는 작용을 한다고 알려져 있다. 이에 상기 아네모네 리불라리스 유래의 화합물들은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 억제 활성이 우수하여 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아네모네 리불라리스로부터 분리된 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {A composition comprising saponins isolated from Anemone rivularis for treating or preventing metabolic diseases}

본 발명은 아네모네 리불라리스 유래의 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 아네모네 리불라리스(Anemone rivularis) 유래의 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A, 화합물 1), 프로사포게닌 CP6(prosapogenin CP6, 화합물 2), 후잔고사이드 A(huzhangoside A, 화합물 3) 및 후잔고사이드 C(huzhangoside C, 화합물 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 사포닌 화합물(saponins)을 함유하는 대사성 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에 이르러 삶의 질이 향상되고, 수명이 연장되고 있지만, 수명의 증가와 더불어 암을 비롯한 심혈관 질환, 대사성 질환의 발병도 증가하고 있는 추세이다. 최근 발표된 세계보건기구의 통계를 분석하면, 전 세계적으로 높은 사망률을 차지하는 질환이 각종 암을 비롯하여 심혈관계질환, 대사성질환, 신경정신질환 등인 것으로 보고된 바 있다.

상기 대사성 질환 중에서 당뇨병은 인슐린의 절대적 결핍 또는 저항성으로 인한 당대사 기능이상을 특징으로 하는 만성 소모성 질환으로 전신적인 무기력과 저항성 저하, 혈관장애, 뇌경색, 심근경색 등 기타 다양한 합병증을 유발하는 질병이다. 당뇨병은 그 발병원인과 병태양상에 따라 크게 2가지 유형으로 구분되는데, 임파구의 면역학적 기전에 의한 인슐린 분비세포인 베타세포의 파괴로 유발되는 인슐린 의존성 1형 당뇨병, 인슐린을 분비하는 베타세포의 기능저하와 말초표적장기에서 인슐린에 대한 저항성 증가로 유발되는 인슐린 비의존성인 2형 당뇨병이 있다. 현대 사회의 노령화와 생활습관의 변화로 성인형의 2형 당뇨병이 전체 환자의 90% 이상을 차지하고 있고 그 수도 꾸준히 증가하는 추세이다.

인슐린 저항성이란 일정량의 인슐린 농도에 대한 반응이 정상보다 감소되어 있는 상태를 말하며 일반적으로 유전적, 환경적인 요인으로 발생하며 2형 당뇨병 발병의 주요 원인이며 최근 경구용 당뇨병 치료제 개발은 말초표적장기에서 인슐린 감수성을 개선시키는 것을 주 타겟으로 하고 있다.

현행 약물치료제는 그 치료기전에 따라 몇 가지로 나눌 수 있는데, 설포닐우레아(sulfonylurea)계는 간접적으로 인슐린 분비를 증가시키고 인슐린의 작용을 증강시키는 반면에 저혈당증유발과 인슐린 분비능 상실 등의 부작용이 있을 수 있다. 비구아나이드(biguanide)계는 간에서 당 신생을 억제하고 위장관에서 당의 흡수를 감소시키는 작용을 하지만 위장장애와 신장독성 등의 부작용이 있으며, 알파-글루코시데이즈(α-glucosidase)계 저해제는 소장에서 포도당을 만드는 효소의 작용을 억제하여 혈당의 상승을 억제하여 주는 작용을 하는 반면 설사, 복통 등의 부작용이 있다.

최근에는 인슐린 작용 증가제의 개발이 본격화되고 있는데 대표적으로 PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor γ)를 활성화시키는 티아졸리디네이온(thiazolidinedione, TZD) 계열의 약물들이 있다. PPAR-γ는 핵 호르몬 수용체(nuclear hormone receptor) 중의 하나인 레티노이드 엑스 수용체(retinoid X receptor, RXR)와 결합하여 이종이량체(heterodimer)를 형성한 뒤, 전사인자(transcription factor)로 작용하여 지방세포분화, 탄수화물, 지방대사 등에 중요한 작용을 한다. 특히 PPAR-γ는 주로 지방세포(adipocyte)에 존재하며 지방생성(adipogenesis) 및 당흡수(glucose uptake) 작용을 하기 때문에 PPAR-γ 효능제(PPAR-γ agonist)가 2형 당뇨형 치료제로서 많이 사용되고 있다. 또한 티아졸리디네이온(thiazolidinedione, TZD) 계열의 약물도 2형 당뇨병 치료제로서 많이 사용되고 있다(Diabetes, 1998, 47(4), 507~514).

그러나, 현행 약물치료제의 상황을 보면 당뇨병의 근본적 원인의 치료에 이르지 못하고 있는데다가, 여러 부작용 등이 보고되고 있어 인슐린 저항성을 근본적으로 해결할 수 있는 약물의 개발이 시급한 실정이다.

비만은 단순히 과체중으로 인한 미용적인 영향 및 삶의 질이 낮아진다는 문제가 아닌 주요 사망 원인이 되며, 대사성 질환에서 큰 비중을 차지하는 질환이라는 것으로 인식이 바뀌고 있다. 세계보건기구(WHO)의 통계에 따르면 비만은 그 발병률이 증가하여 2008년 현재 세계 인구의 약 6%인 4억 명 정도가 비만으로 조사되었고 2015년에는 7억 명 이상이 될 것으로 예측하고 있다. 특히 OECD 국가의 경우, 성인 비만인구는 해마다 증가하는 추세이며 미국의 경우 3명 중 1명은 비만인 것으로 조사되었다. 우리나라도 생활환경의 변화로 비만인구가 급증하고 있으며 체질량 지수(body mass index; BMI) 25 이상인 한국 성인 비만인구는 매년 40년만 명씩 늘어 2005년 기준 10명 중 3명은 비만인 것으로 조사되었다. 질병관리본부의 자료에 따르면 1995년 비만인구가 전체 인구의 26.3%이었으나 2001년에는 전체 인구의 30.6%로, 2005년에는 전체 인구의 31.5%로 급증하였으며 계속적인 증가 추세를 보이고 있다.

한편, 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)는 하기 참고도 1에서와 같이, 인슐린 수용체(insulin receptor) 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates)의 탈인산화를 일으켜 인슐린의 신호전달 기전을 방해함으로써 인슐린 저항성을 야기시키는 효소로 알려져 있다. 또한, 상기 단백질 타이로신 탈인산화 효소 1B는 렙틴의 신호전달 과정에서도 렙틴 수용체 및 Jak에서 일어나는 인산화를 저해함으로써 렙틴 신호전달 기전을 억제함(참고도 1 참조)으로써 비만을 일으키는 원인으로 알려져 있다(J. Med. Chem., 2004, 47(17), 4142~4146).

[참고도 1]

비록, 현재 상기 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B에 관한 연구는 상대적으로 초기 단계에 머물러 있기는 하지만, 최근 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 생물학적 기능 및 질환 유발 기전이 밝혀짐에 따라 새로운 약물 개발의 타겟이 되고 있다(Med. Res. Revi., 2012, 32, 459~517). 특히, 당뇨, 비만, 암 등 난치성 질환에 있어서 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 역할이 규명됨에 따라 이 효소 저해를 타겟으로 하는 신약 개발에 많은 투자가 이루어지고 있다. 이에 대한 예로서, 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 유전자를 제거한 쥐에서 인슐린 내성이 제거되어 2형 당뇨병이 유발되지 않았으며 비만이 억제되는 현상이 보고되었으며(Science, 1999, 283, 1544~1548), 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)를 억제하는 물질들이 항당뇨 효과를 보이는 현상이 관찰되고 있다(J. Med. Chem., 2000, 43(5), 995~1010).

한편, 현재까지 임상에 들어간 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B를 비롯한 각종 타이로신 탈인산화효소의 저해제는 하기 참고도 2와 같은데, 대부분 합성 화합물로서, 낮은 생체이용률, 독성 및 다른 부작용으로 인해 임상시험에서 탈락된 경우가 많다. 따라서 안전성이 높은 천연물 유래 저해제 개발이 요구되고 있다(Nat. Rev. Drug Discov., 2002, 1, 696~709).

[참고도 2]

이에 본 발명자들은 숙은노루오줌(Astilbe koreana)(Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 3273~3276), 섬오가피(Acanthopanax koreanum)(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3061~3064), 에리스리나 밀드브래디(Erythrina mildbraedii)(J. Nat. Prod., 2006, 69, 1572~1576 ; Chem. Pharm. Bull., 2008, 56, 85~88) 등으로부터 분리한 화합물이 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 저해활성이 있음을 확인한 바 있으며, 본 발명자들은 상기와 같은 연구를 거듭하던 중, 아네모네 리불라리스(Anemone rivularis) 유래의 사포닌 화합물(saponins) 또한 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 저해활성이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성할 수 있었다.

Spiegelman, B.M., PPAR-gamma: adipogenic regulator and thiazolidinedione receptor., Diabetes, 1998, 47(4), 507~514. Hooft van Huijsduijnen, R. et al. Prospects for inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B as antidiabetic drugs., J. Med. Chem., 2004, 47(17), 4142~4146. Elchebly, M. et al., Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene., Science, 1999, 283(5407), 1544~1548. Malamas, M.S. et al., New azolidinediones as inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B with antihyperglycemic properties., J. Med. Chem., 2000, 43(5), 995~1010. Thareja, S. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors: a molecular level legitimate approach for the management of diabetes mellitus., Med. Res. Revi., 2012, 32, 459~517. Johnson, T.O. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors for diabetes., Nat. Rev. Drug Discov., 2002, 1, 696~709. Na. M. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity of triterpenes isolated from Astilbe koreana., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 3273~3276. Na, M. et al., Inhibition of protein tyrosine phosphatase 1B by diterpenoids isolated from Acanthopanax koreanum., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3061~3064. Na, M. et al., Protein tyrosine phosphatase-1B inhibitory activity of isoprenylated flavonoids isolated from Erythrina mildbraedii., J. Nat. Prod., 2006, 69, 1572~1576. Jang, J. et al., Prenylated flavonoids with PTP1B inhibitory activity from the root bark of Erythrina mildbraedii., Chem. Pharm. Bull., 2008, 56, 85~88. Mizutani K. et al, Saponins from Anemone rivularis., Planta Med. 1984. 50, 327. Cui, L. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors from Morus root bark. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1426.

본 발명의 목적은 아네모네 리불라리스(Anemone rivularis) 유래의 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다. 보다 자세하게는 본 발명의 목적은 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A, 화합물 1), 프로사포게닌 CP6(prosapogenin CP6, 화합물 2), 후잔고사이드 A(huzhangoside A, 화합물 3) 및 후잔고사이드 C(huzhangoside C, 화합물 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 사포닌 화합물(saponins)을 함유하는 대사성 질환의 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 아네모네 리불라리스 유래의 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 하기 화학식 1 및 2의 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A, 화합물 1), 프로사포게닌 CP6(prosapogenin CP6, 화합물 2), 후잔고사이드 A(huzhangoside A, 화합물 3) 및 후잔고사이드 C(huzhangoside C, 화합물 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 사포닌 화합물(saponins)을 함유하는 대사성 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병 중에서 선택되는 질환일 수 있다.

또한, 상기 사포닌 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 1의 신규 화합물 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A)를 제공하며, 아네모네 리불라리스(Anemone rivularis)의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물로부터 하기 화학식 1의 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A)를 분리하는 방법을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 사포닌 화합물은 아네모네 리불라리스(Anemone rivularis)의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물로부터 분리될 수 있다. 또한, 상기 사포닌 화합물은 아네모네 리불라리스의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물을 크로마토그래피로 분획하여 얻을 수 있다.

따라서, 바람직하게는 상기 사포닌 화합물은 아네모네 리불라리스를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 아네모네 리불라리스 추출물을 제조하는 단계; 상기 아네모네 리불라리스 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하는 단계; 및, 상기 각 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 분리하는 단계;를 통해 얻을 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

한편, 본 발명의 사포닌 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.

또한, 본 발명은 사포닌 화합물을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 사포닌 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 사포닌 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 사포닌 화합물을 함유하는 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 사포닌 화합물을 함유하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

도 1은 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1)의 HMBC 스펙트럼을 나타내는 그림이다.
도 2는 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1)의 NOESY 스펙트럼을 나타내는 그림이다.
도 3은 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1)의 HMBC (H→C)와 ¹H-¹H COSY (

) 상관 관계 및 NOE (↔) 상관관계를 나타내는 그림이다.
도 4는 화합물 1~4의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 5는 화합물 1~4의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

< 실시예 1. 아네모네 리불라리스로부터 사포닌 화합물의 분리>

건조된 아네모네 리불라리스(Anemone rivularis) 전체(1.88kg)를 분쇄한 후, 7일간씩, 메탄올 12ℓ(각 회당)로 실온에서 각각 3회 추출하여 감압농축하여 건조물 상태의 메탄올 추출물(150g)을 얻었다. 이 후, 상기 메탄올 추출물 150g을 2ℓ의 물에 현탁한 후, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 순차적으로 분획(3ℓ의 용매로 각각 2회씩 수행)하여 각각 n-헥산 추출물(5.3g), 디클로로메탄 추출물(14.8g), 에틸아세테이트 추출물(43.2g) 및 n-부탄올 추출물(72.1g)을 얻었다.

이 중 에텔아세테이트 분획물(40.2g)을 에틸아세테이트/메탄올/물(50:5:1→20:20:5)의 용매 농도구배 조건의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(60×10㎝)를 이용하여 9개의 소분획물(Fr. EA1 - Fr. EA9) 및 이들의 TLC profile을 얻었다.

이 중 Fr. EA6 소분획물을 메탄올/물(50:50→100:0)의 용매 농도구배 조건의 C18 MPLC (Snap cartridge column KP-C18-HS, 400g, 21×4㎝)을 이용하여 화합물 1(490㎎)을 얻었다. 화합물 2(1.7g)는 Fr. EA5 소분획물을 메탄올/물(40:60→100:0)의 용매 농도구배 조건의 C18 MPLC(Snap cartridge column KP-C18-HS, 400g, 17×8.5㎝)를 이용하여 얻었다. 화합물 3(179.5㎎)은 Fr. EA4 소분획물을 메탄올/물(70:30→100:0)의 용매 농도구배 조건의 C18 MPLC(Snap cartridge column KP-C18-HS 120g, 21×4㎝)를 이용하여 얻었다. 마지막으로, 화합물 4(320㎎)는 Fr. EA9 소분획물을 메탄올/물(55:45→75:25)의 용매 농도구배 조건의 C18 MPLC(Snap cartridge column KP-C18-HS 120g, 21×4㎝)를 이용하여 얻었다.

< 실시예 2. 아네모네 리불라리스 유래 화합물의 물리화학적 구조 확인>

실시예 2-1. 아네모네리불라리사이드 A (화합물 1)

anemonerivulariside A; 3-O-β-D-ribopyranosyl-(1/3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1/2)-α-L-arabinopyranosyl-22α-hydroxyhederagenin

white amorphous powder;

[α]

: -13.65 (c 1.0, MeOH);

ESI-MS/MS (30 eV): 897 [M - H]^-, 765 [(M - H) - rib]^-, 747 [(M - H) rib - OH]^-, 619 [(M - H) - rib - rha]^-, 601 [(M - H) - rib - rha - OH]^-, 487 [aglycone - H]^-;

HRFABMS m/z 921.4827 [M + Na]⁺(Calcd for C₄₆H₇₄O₁₇Na: 921.4824);

상기 화합물 1의 HMBC 스펙트럼, NOESY 스펙트럼, HMBC와 ¹H-¹H COSY의 상관 관계 및 NOE 상관관계는 도 1 내지 3에 나타내었다.

하기 표 1은 화합물 1의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸다.

Position	δ _C	δ _H mult.	Position	δ _C	δ _H mult.
1	39.3	1.54 m, 1.06 m	24	14.4	1.10 s
2	26.7	1.97 m, 2.20 m	25	16.3	0.91 s
3	81.5	4.27 overlapped	26	17.7	1.04 s
4	43.9		27	27.0	1.28 s
5	48.0	1.74 m	28	179.7
6	18.4	1.70 m, 1.30 m	29	33.7	0.98 s
7	33.0	1.65 m, 1.28 m	30	25.5	1.10 s
8	40.3		ara-1'	104.9	5.05 d (J=6.6)
9	48.4	1.63 m	2'	75.6	4.56 overlapped
10	37.1		3'	75.5	4.02 dd (J=3.0, 7.8)
11	24.1	1.90 m, 1.78 m	4'	70.1	4.12 m
12	123.2	5.45 brs	5'	66.6	3.67 d (J=10.8), 4.23 overlapped
13	144.4		rha-1''	101.7	6.30 brs
14	42.8		2''	72.3	4.89 brs
15	28.2	2.44 m, 1.21 m	3''	81.4	4.74 dd (J=2.4, 9.6)
16	17.2	2.65 m, 1.97 m	4''	73.1	4.41 m
17	53.4		5''	70.1	4.69 m
18	43.8	3.30 dd (J= 13.8, 3.0)	6''	18.7	1.54 d (J=6.0)
19	46.2	1.90 m, 1.24 m	rib-1'''	104.9	5.93 d (J=3.6)
20	31.8		2'''	73.1	4.29 overlapped
21	43.5	1.77 m	3'''	70.5	4.14 m
22	71.8	4.55 overlapped	4'''	69.1	4.50 brs
23	64.2	4.26 overlapped, 3.91 d (J=10.2)	5'''	65.5	4.29 m, 4.12 m

실시예 2-2. 프로사포게닌 CP6 (화합물 2)

prosapogenin CP6;

¹³C-NMR (63 MHz, pyridine-d ₅ ): 39.3 (C-1); 26.6 (C-2); 81.4 (C-3); 43.8 (C-4); 48.4 (C-5); 18.7 (C-6); 31.2 (C-7); 40.0 (C-8); 48.0 (C-9); 37.1 (C-10); 23.9 (C-11); 122.9 (C-12); 145.0 (C-13); 42.4 (C-14); 26.6 (C-15); 24.1 (C-16); 46.7 (C-17); 42.2 (C-18); 46.9 (C-19); 28.6 (C-20); 34.5 (C-21); 33.6 (C-22); 64.2 (C-23); 14.4 (C-24); 16.4 (C-25); 17.7 (C-26); 26.4 (C-27); 180.5 (C-28); 33.1 (C-29); 24.1 (C-30); α-L-Rhamnose [101.6 (C-1'), 72.3 (C-2'), 81.4 (C-3'), 73.1 (C-4'), 70.2 (C-5'), 18.7 (C-6')]; β-D-ribose [105.0 (C-1''), 73.1 (C-2''), 70.6 (C-3''), 69.1 (C-4''), 65.5 (C-5'')]; α-L-arabinose (inner) [105.0 (C-1'''), 75.8 (C-2'''), 75.5 (C-3'''), 70.2 (C-4'''), 66.8 (C-5''')];

실시예 2-3. 후잔고사이드 A (화합물 3)

huzhangoside A;

¹³C-NMR (63 MHz, pyridine-d ₅ ): 39.1 (C-1); 27.0 (C-2); 88.9 (C-3); 39.8 (C-4); 56.3 (C-5); 18.7 (C-6); 33.4 (C-7); 39.9 (C-8); 48.2 (C-9); 37.2 (C-10); 24.0 (C-11); 122.7 (C-12); 145.0 (C-13); 42.3 (C-14); 28.5 (C-15); 23.9 (C-16); 46.9 (C-17); 42.1 (C-18); 46.6 (C-19); 31.1 (C-20); 34.4 (C-21); 33.3 (C-22); 28.4 (C-23); 17.4 (C-24); 15.8 (C-25); 17.6 (C-26); 26.4 (C-27); 180.6 (C-28); 33.5 (C-29); 23.9 (C-30); β-D-Xylose[106.3 (C-1'), 79.8 (C-2'), 77.4 (C-3'), 71.7 (C-4'), 67.1 (C-5')]; α-L-rhamnose [101.7 (C-1''), 72.1 (C-2''), 81.4 (C-3''), 73.0 (C-4''), 70.1 (C-5''), 18.8 (C-6'')]; β-D-ribose [104.7 (C-1'''), 73.0 (C-2'''), 70.4 (C-3'''), 69.2 (C-4'''), 65.4 (C-5''')];

실시예 2-4. 후잔고사이드 C (화합물 4)

huzhangoside C;

¹³C-NMR (125 MHz, pyridine-d ₅ ): 39.4 (C-1); 27.2 (C-2); 88.9 (C-3); 40.0 (C-4); 56.5 (C-5); 18.9 (C-6); 33.4 (C-7); 48.4 (C-9); 37.4 (C-10); 24.1 (C-11); 123.2 (C-12); 42.5 (C-14); 28.6 (C-15); 23.7 (C-16); 47.4 (C-17); 42.0 (C-18); 46.6 (C-19); 31.1 (C-20); 34.3 (C-21); 32.9 (C-22); 28.6 (C-23); 17.6 (C-24); 16.0 (C-25); 17.8 (C-26); 26.4 (C-27); 176.9 (C-28); 33.5 (C-29); 24.1 (C-30); β-D-Xylose[106.5 (C-1'), 80.2 (C-2'), 77.5 (C-3'), 71.9 (C-4'), 67.4 (C-5')]; α-L-rhamnose [101.8 (C-1''), 72.4 (C-2''), 81.6 (C-3''), 73.2 (C-4''), 71.2 (C-5''), 18.9 (C-6'')]; β-D-ribose [105.2 (C-1'''), 73.2 (C-2'''), 70.7 (C-3'''), 69.5 (C-4'''), 65.7 (C-5''')]; β-D glucose (inner)[ 96.0 (C-1''''), 74.3 (C-2''''), 79.1 (C-3''''), 70.6 (C-4''''), 77.4 (C-5''''), 69.4 (C-6'''')]; β-D glucose [105.0 (C-1'''''), 75.7 (C-2'''''), 76.9 (C-3'''''), 78.6 (C-4'''''), 78.4 (C-5'''''), 61.6 (C-6''''')]; α-L-rhamnose (terminal) [103.1 (C-1''''''), 72.9 (C-2''''''), 73.1 (C-3''''''), 74.2 (C-4''''''), 70.2 (C-5''''''), 18.9 (C-6'''''')];

※ 상기 화합물 1~4의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 그래프는 도 4 및 도 5에 개시되어 있음

※ 상기 화합물 2~4에 관한 자세한 정보는 [Mizutani K. et al, Saponins from Anemone rivularis., Planta Med. 1984. 50, 327.]에 개시되어 있음

< 실시예 3. 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 활성 측정>

단백질 타이로신 탈인산화효소 1B에 의해 기질인 p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)가 p-nitrophenol(p-NP)로 변화되면 노란색을 나타내므로 405nm에서 흡광도의 변화를 측정함으로써 효소활성을 측정하였다(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1426~1429).

단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(PTP1B, human, recombinant)는 BIOMOL International LP(Plymouth Meeting, PA)에서 구입하였다. 96웰 플레이트(96 wells in a microtiter plate)에 2mM p-NPP와 0.05~0.1㎍의 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B를 넣었으며 각 실험군에는 화합물 1~4를 함께 처리하였다. 이 때 96웰 플레이트 안의 p-NPP, 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 및 화합물 1~4가 처리된 버퍼의 조성은 50mM citrate(pH 6.0), 0.1M NaCl, 1mM EDTA 및 1mM dithiothreitol(DTT)로 구성되어 있으며, 최종 부피는 100㎕가 되게 하였다. 이 후, 상기 혼합 처리물을 37℃에 30분간 둔 후, 10M 수산화나트륨(10M NaOH) 50㎕를 처리하여 반응을 중단시켰으며, 최종 남아있는 p-NPP의 양을 405nm에서 확인하였다. 각 화합물의 활성은 IC₅₀(the half maximal inhibitory concentration)으로 나타내었다. 대조군으로는 타이로신 탈인산화효소의 억제제 중 하나인 RK-682(3-hexadecanoyl-5-hydroxymethyl-tetronic acid)를 사용하였다.

화합물	IC₅₀ (μM)
화합물 1	74.1
화합물 2	70.2
화합물 3	61.0
화합물 4	50.4
RK-682	4.0

상기 표 2의 결과를 참고하면, 본 발명의 사포닌 화합물들이 타이로신 탈인산화효소에 대한 현저한 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4. 독성실험>

실시예 4-1. 급성독성

본 발명의 화합물을 단기간에 과량을 섭취하였을 때의 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스를 20마리를 준비하였고, 각 군별로 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고, 실험군은 대표적으로 본 발명의 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1)를 1.0g/㎏의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 상기 화합물 1을 투여한 실험군에서는 모두 생존하였다.

실시예 4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1)를 1.0g/㎏의 농도로 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

< 사용예 1 : 약학적 제제예 >

1-1. 정제의 제조

본 발명의 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1) 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 아네모네리불라리사이드 A(화합물 1) 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

Claims

아네모네 리불라리스(Anemone rivularis)로부터 분리된 하기 화학식 1 및 2의 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A, 화합물 1), 프로사포게닌 CP6(prosapogenin CP6, 화합물 2), 후잔고사이드 A(huzhangoside A, 화합물 3) 및 후잔고사이드 C(huzhangoside C, 화합물 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 사포닌 화합물(saponins)을 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
제1항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병 중에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 사포닌 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
하기 화학식 1의 신규 화합물 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A).
[화학식 1]
아네모네 리불라리스(Anemone rivularis)를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 아네모네 리불라리스 추출물을 제조하는 단계;
상기 아네모네 리불라리스 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하는 단계; 및,
상기 분획을 통해 얻은 에틸아세테이트 분획물에서 크로마토그래피를 이용하여 하기 화학식 1의 화합물을 분리하는 단계;
를 포함하는 하기 화학식 1의 아네모네리불라리사이드 A(anemonerivulariside A)를 분리하는 방법.
[화학식 1]