KR102190059B1 - 투미둘린을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 투미둘린(tumidulin)을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 지의류로부터 분리된 투미둘린은 대장암 줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현을 억제하고, 대장암 줄기세포의 사멸을 유도하며, 대장암 줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키는 효과를 나타내므로 종양줄기세포 성장 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물은 항암 보조제로서 기존의 화학적 항암제와 함께 투여하거나, 방사선 치료에 함께 병용하는 경우 대장암 줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종양줄기세포의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다. 아울러, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 약제학적 및 식품 조성물에 매우 안전하게 사용될 수 있다.

Description

투미둘린을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물{Composition for growth inhibition of colorectal cancer stem cells comprising tumidulin}

본 발명은 투미둘린(tumidulin)을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 니에블라(Niebla) 속 지의류로부터 분리된 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것이다.

대장암 (Colorectal cancer, CRC)은 전세계적으로 가장 흔히 진단되는 암 중 하나이며, 높은 사망률로 인해 임상 암 치료에서 우선 순위를 차지하게 되었다. 많은 CRC 환자가 전이성 질환을 앓고 있으며, 5년 생존율은 12.5%에 불과하다. 또한 화학 요법에 대한 내성은 전이성 암 환자의 90%에서 발생하며 지난 10년 동안 CRC를 대상으로 하는 수많은 치료제 개발에도 불구하고 치료 실패의 주요 원인으로 여겨지고 있다(Longley, D., et al., The Journal of pathology 2005, 205, (2), 275-292). Mounting evidence는 암 줄기세포가 항암 화학 요법에 기여한다는 것을 보여 주며, 최근 연구들은 CSCs의 분자적 특성에 의해 제공되는 치료 기회를 이용하여 화학 요법의 효율성을 향상시킬 수 있다고 제안했다(Vidal, S. J., et al., Oncogene 2014, 33, (36), 4451-63). 분화의 클러스터 (CD) 133, CD44, 그리고 류신이 풍부한 반복성 G 단백질 결합 수용체 5 (LGR5)는 결장, 침윤, 전이와 관련된 대장암 CSC 마커이다. 화학 저항 및 알데히드 탈수소효소 (ALDH) 활성은 CSCs에서 화학 저항의 메커니즘과 관련이 있다. 따라서 CSC와 유사한 특성을 대상으로 하는 새로운 치료 전략을 찾는 것이 중요하다. 그러나 아직까지 효과적인 화학 요법 제제를 확인하는 잠재력을 가진 CSC 유사 형질에 기초한 항암 활성을 스크리닝하는 시도는 없었다.

대장암 줄기세포 성장 억제용 치료제를 개시한 특허문헌으로 예를 들어 대한민국 특허등록 제10-1907151호에서는 디아세틸을 포함하는 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 보고한 바 있으며, 대한민국 특허등록 제10-1861160호에서는 지의류인 스틱타위겔리(Sticta weigelii) 추출물, 또는 이로부터 분리된 브레비시드 X (brevicid X)의 종양줄기세포 성장 억제용 조성물을 보고한 바 있다.

이에 본 발명자들은 CRC 세포의 줄기능에 대한 11가지 지의류의 억제활성을 조사하고 표적 치료제의 내화학성을 낮출 수 있는 신규 화합물을 동정하기 위한 저해 활성의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하였으며, 니에블라(Niebla) 속 지의류로부터 분리된 투미둘린(tumidulin)이 대장암 줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현을 억제하고, 대장암 줄기세포의 사멸을 유도하며, 대장암 줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시킬 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 항대장암 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 대장암의 예방 또는 개선용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 투미둘린(tumidulin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물을 제공한다.

상기 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항대장암 보조제를 제공한다.

상기 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

상기 투미둘린은 니에블라(Niebla) 속 지의류로부터 분리되거나 화학적으로 합성될 수 있으며, 하기 화학식 1의 구조식을 가진다.

본 발명의 하나의 구체적인 실시태양에 따르면, 상기 투미둘린은 건조된 지의류 지상체를 아세톤으로 추출한 후 여과하고 건조한 다음 디메틸 술폭시드로 용해시킨 후 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행하여 수득할 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 투미둘린은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 투미둘린을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 포함되는 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량인 0.001 중량% 미만인 경우에는 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 효과가 너무 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하므로 비경제적이다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 니에블라(Niebla) 속 지의류로부터 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 지의류의 대사산물을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 "추출물"은 상기 추출액 뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 대장암 줄기세포 성장억제는 종양줄기세포의 사멸, 종양줄기세포의 자가재생, 암세포로의 분화 억제 및 종양줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현 억제를 포함하는 의미이다. 여기서, 상기 종양줄기세포는 자가재생능력(self-renewal)과 암세포로 분화하는 능력(differenatiaion)을 동시에 가진 미분화세포이다.

한편, 종양줄기세포 표지자(cancer stem cell markers)는 종양줄기세포의 전이, 암세포로의 성장 및 증식 등에 관여하며, 암이 재발한 환자에서 많이 발현하는 단백질이다. 따라서, 상기 종양줄기세포 표지자의 발현 억제는 종양줄기세포의 전이, 암세포로의 성장 및 증식, 암세포의 재생성을 억제할 수 있으므로 암을 치료할 수 있다.

하나의 구체적 예로, ALDH-1(aldehyde dehydrogenase-1)는 생리적 또는 병리적 환경에서 알데히드의 산화를 촉매하는 세포 내 효소로, 두경부암, 대장암, 유방암, 급성백혈병, 폐암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있고, CD133(prominin-1; AC133)은 암세포의 부착 및 이동에 중요한 역할을 하는 대표적 세포부착 분자로, 뇌종양, 대장암, 간암, 폐암, 갑상선암, 난소암, 후두암, 자궁내막 또는 자궁암, 두경부암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있으며, CD44(hyaluronate receptorl P-glycoprotein 1)는 CD133과 유사한 역할을 하는 단백질로, 췌장암, 간암, 전립선암, 난소암, 대장암, 담도암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암 평편 세포암, 위암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있다. Msi-1(RNA-binding protein; musahi-1)은 종양줄기세포의 성장을 돕는 단백질로, 유방암, 위암, 뇌암, 결장암, 피부암 등의 종양줄기세포 및 암세포 표지자로 사용되고 있고, Lgr-5(Wnt targeting gene; APR49)는 Wnt 신호전달의 표적 분자로, 직장암, 대장암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있다.

하나의 구체적 실시에서, 순천대학교 한국지의류센터에서 분양받은 다양한 지의류지의체 추출물들은 인간 대장암 줄기세포에 대하여 세포독성을 나타내었으며, 이중 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 추출물이 가장 우수한 세포독성을 나타냈다. 또한, 인간 대장암 줄기세포(CSC221)에 지의류 추출물 또는 이로부터 분리된 투미둘린을 처리할 경우 사멸된 대장암 줄기세포의 수가 증가하였고, 대장암 줄기세포의 분화 또는 자가재생을 촉진하는 표지자로 알려진 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 BMsi-1의 발현이 감소되었다.

본 발명은 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 투미둘린은 대장암 세포에 대하여 독성을 나타내고, 대장암 조직의 성장속도 및 크기를 감소시키므로 대장암을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 투미둘린을 포함하는 대장암 줄기세포 억제용 조성물은 종래 다른 화학요법과 병용하여 사용될 수 있다.

구체적으로, 기존의 방사선 치료나 항암제 치료와 병행하여 사용함으로써 항암 효과를 극대화시킬 수 있다. 특히, 화학적 항암제 등과 함께 투여함으로써, 종양줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종래의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다.

상기 항암제는 기존에 사용되고 있는 임의의 약물이라면 어느 것이나 사용 가능하다. 예를 들어, 머스타드 가스 유도체류(메클로레타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 및 이포스파미드 등), 에틸렌이민류(티오테파 및 헥사메틸멜라민), 아킬알킬술포네이트류(부술판), 히드라진류 및 트리아진류(알트레타민, 프로카르바진, 다카르바진 및 테모졸로마이드), 니트로스유레아류(카르뮤스틴, 로뮤스틴 및 스트렙토조신 등), 금속염류(카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드류(빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈오렐빈), 탁산류(파클리탁셀 및 도세탁셀), 포도필로톡신류(에토포시드 및 테니소피드), 캄프토테칸 유사체류(이리노테칸 및 토포테칸), 안트라시클린류(독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 이다루비신), 크로모마이신류(닥티노마이신 및 플리카마이신), 항종양 항생제류(미토마이신 및 블레오마이신 등), 엽산 길항제류(메토트렉세이트), 피리미딘 길항제류(5-플루오로우라실, 폭수리딘, 시타라빈, 카페시타빈 및 젬시타빈), 퓨린 길항제류(6-메르캅토퓨린 및 6-티오구아닌), 아데노신 디아미나제 억제제류(클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈 및 펜토스타틴), 토포이소머라제 I 억제제류(이로노테칸 및 토포테칸), 토포이소머라제 II 억제제류(암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드), 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제류(히드록시유레아), 아드레노코르티칼 스테로이드 억제제류(미토탄), 효소류(아스파라기나제 및 페가스파르가제), 항미소관제류(에스트라뮤스틴) 및 레티노이드류(벡사로텐, 이소트레티노인 및 트레티노인(ATRA))로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항대장암 보조제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 항대장암 보조제는 종래 화학적 항암제 등과 함께 병용하여 사용함으로써, 대장암 세포를 사멸시키는 항암제의 효과를 증강시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 항대장암 보조제를 기존의 화학적 항암제 등과 함께 투여함으로써, 종양줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종래의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다.

한편, 본 발명의 상기 투미둘린은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적고, 종양줄기세포의 사멸유도, 종양줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키며, 종래의 화학요법(항암제 및 방사선 치료)과 병용하여 사용하는 경우 암세포의 사멸과 함께 종양줄기세포의 사멸을 함께 유도함으로써 기존의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 항암치료 효과를 증강시키는 효과를 나타내므로 약학적 및 식품 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

하나의 구체적 양태로서, 상기 투미둘린을 약학적 조성물로 사용하는 경우, 투미둘린 이외에 약학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체이다.

상기 약학적 조성물로 적합한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 보다 구체적으로, 치료될 개체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 함량을 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 환자에게 투여되는 조성물의 투여량은 환자 체중의 약 0.5-1,000 ㎎/kg 일 수 있다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 현탁액, 과립제, 정제, 분말제, 에멀젼제 또는 갑셀제 등의 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 투미둘린을 식품 조성물로 사용하는 경우, 투미둘린 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 지투미둘린을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물 또는 항암 보조제는 종래의 화학요법(항암제 및 방사선 치료)과 병용하여 사용함으로써 암세포의 사멸과 함께 종양줄기세포의 사멸을 함께 유도함으로써 기존의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 항암치료 효과를 증강시킬 수 있다. 아울러 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 약학적 및 식품 조성물에 매우 안전하게 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 개체에 투여하여 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 투미둘린을 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물을 개체에 투여하여 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 사멸유도, 대장암 줄기세포의 자가재생 억제, 대장암 세포로의 분화, 성장 및 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 투미둘린을 포함하는 항암 보조제를 종래 다른 화학요법(항암제 및 방사선 치료)과 병용하여 대장암의 재발을 억제시킬 뿐만 아니라 대장암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 투미둘린을 포함하는 항대장암 보조제를 기존의 항암제와 함께 개체에 투여하거나 방사선 치료에 함께 병용하여 종래 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 선택적 타겟팅(targeting)을 통해 암을 원천적으로 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 종양줄기세포 억제용 조성물 또는 항암 보조제를 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개채에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 종양줄기세포 억제용 조성물 또는 항암 보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "억제" 또는 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제, (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명의 상기 방법에 의하여 상술한 개체의 질환 또는 질병은 본 발명의 종양줄기세포 성장 억제용 조성물 또는 항암 보조제의 개체 내 투여에 의하여 억제 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.

본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명의 상기 방법에 의하여 상술한 개체의 질환 또는 질병은 본 발명의 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물 또는 항암 보조제의 개체 내 투여에 의하여 억제 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.

본 발명의 지의류로부터 분리된 투미둘린은 대장암 줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현을 억제하고, 대장암 줄기세포의 사멸을 유도하며, 대장암 줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키는 효과를 나타내므로 종양줄기세포 성장 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물은 항암 보조제로서 기존의 화학적 항암제와 함께 투여하거나, 방사선 치료에 함께 병용하는 경우 대장암 줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종양줄기세포의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다. 아울러, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 약제학적 및 식품 조성물에 매우 안전하게 사용될 수 있다.

도 1은 지의류 아세톤 추출물의 CSC221 세포의 줄기를 감소활성을 나타낸 것이다.
도 2는 니에블라(Niebla) 속의 이차 대사산물인 투미둘린의 CSC221 세포의 줄기세포능 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물 및 투미둘린이 대장암 (CRC) 세포의 구형 형성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물 및 투미둘린이 암 줄기 관련 유전자 발현 및 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물 및 투미둘린이 전사 인자 활성 및 암 줄기와 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 Gli, SMO 및 mTOR 억제제의 존재 하에서 투미둘린이 ALDH1의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 지의류로부터 투미둘린(tumidulin)의 분리 및 동정

칠레 탈카 (Talca) 대학으로부터 지의류 지상체를 수집하였으며, 순천대학교 한국 지의류연구소 (KLRI)의 한국 지의류 및 연합 생물 자원 센터 (KOLABIC)에 중복 시료를 보관하였다. 건조된 지의류 지상체를 아세톤으로 추출한 후 여과하고 회전 진공 증발기에서 45℃로 건조시켰다. 건조 추출물을 디메틸 술폭시드 (DMSO, Sigma-Aldrich, St.Louis, USA)로 용해시켜 추후 실험에 사용하였다.

5 mg/ml 농도의 지의체 추출물의 아세톤 추출물을 완전 엔드 캡 (end-capped) C18 물질 (입자 크기 = 5㎛, 기공 크기 = 12nm)을 함유하는 YMC-Pack ODS 역상 칼럼 A (내경 150 X 4.6mm)가 장착된 Agilent 1260 기기 (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행하였다. 컬럼 온도 40 ℃에서 메탄올 : 물 : 인산 (80 : 20 : 1, v/v/v)의 용매 시스템을 사용하여 1ml/분의 유속으로 용출시켰다. 분리는 190-800 nm의 범위에서 Agilent 1260 Infinity II 가변 파장 검출기 (1260 VWD, Agilent Technology)를 사용하여 모니터링하였다. 관찰된 피크는 254 nm에서 검출되었다. 샘플 주입 부피는 50㎕였다. 지의류에서 분리한 살라진산 (tR = 2.27 ± 0.2 분)을 표준 물질로 사용하였고, 바우처 표본을 순천대학교의 KoLRI에서 KOLABIC 식물 표본관에 보관하였다.

니에블라(Niebla) 속 지의류 (1; CL130494) 추출물을 전술한 바와 같이 HPLC로 분리하고, 투미둘린(tumidulin)으로 확인된 분획을 수집하였다. 원심분리 후 상층액을 건조시키고 칭량한 다음, HPLC 분석을 수행하여 정제된 샘플이 단일 피크를 생성하는지를 확인하였다. 액체 크로마토그래피 - 질량 분석기 (LC-MS;도 2) 및 핵 자기 공명 (NMR) 분석에 의해 하기 화학식 1과 같은 투미둘린의 구조를 확인하였다.

화학식 1

<시험예>

실험방법

(1) 세포 배양 및 시약

본 연구에서는 인간 결장암 세포주인 CSC221 (인간 결직장 선암종-풍부 CSCs)(Cho, Y. C., et al., International journal of molecular sciences 2017, 18, (9), 1888.), DLD1, HT29 (CRC 세포주) 및 HEK293T (인간 배아 신장 세포)를 사용하였다. 배양기에서 37 ℃의 가습된 5 % CO₂ 대기 하에서 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린-스트렙토 마이신 용액이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM)에서 세포를 배양하였다. GDC-0449 (Vismodegib, A10258)는 AdooQ Bioscience (Irvine, CA)에서 구입하였다. GANT61 (G9048) 및 라파마이신 (R8781)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

(2) 리포터 분석

HEK293T 세포를 X-treme GENE 9 DNA 형질전환제 (Roche, Werk Penzberg, Germany)을 사용하여 Gli-luc, TOPFLASH-luc 및 파이어플라이 플라스미드와 접합시킨 Hyp-1과 함께 로 Renilla-luc (pRL-TK) 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 12시간 후 세포를 니에블라(Niebla) 속 지의류 아세톤 조추출물, 투미둘린 또는 0.01 % DMSO로 처리하고 37 ℃, 5 % CO₂ 하에서 48 시간 동안 배양하였다. Renilla 활성에 대해 정규화된 루시퍼라제 활성을 수득하여 Dual-Luciferase 리포터 분석 시스템 (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 형질감염 효율을 결정하였다.

(3) 구형 분석

세포를 트립신 처리한 후 인간 재조합 표피 성장 인자 (hrEGF, 20ng/ml, Biovision, Atlanta, GA, USA) 및 인간 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (hbFGF; 10 ng/ml; Invitrogen)를 갖는 N2-보충 DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 세척하고 초저 부착 24-웰 플레이트 (Corning Inc., Corning, NY, USA)에 1 x 10₄ 세포/웰으로 접종하였다. 배양 14일 후, 역상 대조 현미경 (Nikon, Kawasaki, Japan)에 의해 구형을 정량하였다. IMT iSolution 소프트웨어 (IMT iSolution Inc.)를 사용하여 각 플레이트의 무작위 현미경 구경으로부터 구형 영역의 픽셀 강도를 측정하였다. 구형의 면적분율을 측정하기 위해 구형 영역의 픽셀 수를 정규화하려면 주어진 픽셀에 픽셀 제곱을 곱하면 된다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균으로 제시하였다.

(3) MTT 분석법

세포를 96-웰 플레이트에 2.5 X 10³ 세포/웰의 밀도로 접종하고 밤새 성장시킨 다음 지의류 아세톤 추출물 또는 순수 활성 분획으로 48 시간 동안 처리하였다. 모든 시험 샘플을 DMSO에 용해시키고 DMEM으로 희석하여 지시된 농도를 얻었다. 처리가 완료되면 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)를 첨가하고 4 시간 동안 유지하였다. 배지를 제거한 후 DMSO를 첨가하였다. Gen 5 (2.03.1) 소프트웨어 (BioTek, VT, USA)가 장착된 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

(4) 웨스턴 블랏팅

DMSO로 처리된 세포, 니에블라 속 지의류 (1) 또는 투미둘린을 48 시간 동안 빙냉 인산 완충액 (PBS)으로 2 회 세척하고 용균 완충액에서 용해시켰다. ALDH1, CD44, CD133, Lgr5, Msi1 및 α-투불린에 대한 항체를 이전에 기술된 바와 같이 사용하였다(Cho, Y. C., et al., International journal of molecular sciences 2017, 18, (9), 1888). Gli1 (sc-20687; SANTA CRUZ, Dallas, TX, USA), Gli2 (sc-271786; SANTA CRUZ), Smoothened (SMO, ab72130, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 β-Actin (sc-20177)에 대한 항체 Immobilon Western Chemiluminescent HRP 기질 키트 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 및 Image Quant LAS 4000 미니상에서 발광 이미지 (lumininescence imaging)를 사용하여 서양 고추냉이 퍼옥시다아제-접합 이차 항체 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 검출하였다. 밴드는 Multi-Gauge 3.0 소프트웨어를 사용하여 측정하였으며, 상대 밀도는 각 샘플의 β- 액틴 밴드의 밀도를 기준으로 계산하였다. 값은 신호 강도에 해당하는 임의의 농도계로 표시하였다.

(5) 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR)

모든 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR) 분석은 이전에 기술된 대로 수행되었다 (Yang, Y., et al., Molecules 2017, 22, (3), 453). 간략하게, DMSO로 처리한 CSC221 세포로부터 단리된 RNA (1 mg), 니에블라(Niebla) 속 지의류 RNAi Plus (TaKaRa, Otsu, Shiga 520-2193, Japan)를 사용하여 48시간 동안 M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen) 및 SYBR green (Enzynomics, Seoul, Korea)을 사용하여 cDNA로 전환시켰다. qRT-PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 모든 반응과 분석은 CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.

ALDH1	전방향	5'-tgttagctcatgccgacttg-3'	서열번호: 1
	역방향	5'-ttcttagcccgctcaacact-3'	서열번호: 2
Msi-1	전방향	5'-accaagagatccaggggttt-3'	서열번호: 3
	역방향	5'-tcgttcgagtcaccatcttg-3'	서열번호: 4
Lgr5	전방향	5'-ctcttcctcaaaccgtctgc-3	서열번호: 5
	역방향	5'-gatcggaggctaagcaactg-3'	서열번호: 6
CD44	전방향	5'-tgccgctttgcaggtgtat-3'	서열번호: 7
	역방향	5'-ggcctccgtccgagaga-3'	서열번호: 8
CD133	전방향	5'-ggacccattggcattctc-3'	서열번호: 9
	역방향	5'-caggacacagcatagaataatc-3'	서열번호: 10
GAPDH	전방향	5'-atcaccatcttccaggagcga-3'	서열번호: 11
	역방향	5'-agttgtcatggatgaccttggc-3'	서열번호: 12

(6) 통계 분석

모든 실험은 3회 (n = 3)에서 분석하였다. 결과는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 기록하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 버전 17을 사용하여 수행하였으며, 처리 효과는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA post-hoc analysis)을 사용하여 결정하였다. 유의 수준은 P <0.05로 설정하였다.

결과

(1) 수집된 지의류의 아세톤 추출물은 CRC 세포의 줄기 억제활성 측정

암 줄기세포 (CSCs)의 자가 재생 능력은 표적 치료법에 대한 저항성을 초래할 수 있다. 지의류 2차 대사산물의 억제 물질을 확인하기 위해 Gli 리포터 유전자가 안정적으로 도입된 NIH 3T3 세포주에서 칠레 지의류 지의체의 11개의 아세톤 추출물에 대해 Gli 루시퍼라제 활성을 시험하였다. 이를 위해, 세포 독성이 관찰되지 않은 5 μg/ml 농도의 추출물을 시험하였다.

도 1은 지의류 아세톤 추출물의 CSC221 세포의 줄기를 감소활성을 나타낸 것이다.

도 1a에서 볼 수 있듯이, 니에블라(Niebla) 속 지의류 (1)과 니에블라(Niebla) 속 지의류 (4)는 모두 5㎍/ml의 농도에서 Gli-luc 활성을 억제하였다. 상기 지의류 추출물이 CSC221 세포 (인간 대장암 선암종 풍부-암 줄기세포)의 구형 형성 능력에 대한 저해 활성을 갖는지 더 확인하기 위해, 구형 형성 분석을 혈청 매질을 가지는 초저 부착 24웰 플레이트를 사용하여 수행하였다. 도 1b에서 볼 수 있듯이 아세톤 추출물로 처리한 세포에서 구형 수는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 처리 대조군보다 낮았으며 정량 분석 결과 그 차이가 유의적으로 나타났다 (도 1c). 이 결과는 니에블라(Niebla) 속 지의류 (1)과 니에블라(Niebla)속 지의류 (4)의 아세톤 추출물이 대장암 (CRC) 세포의 줄기 세포주에 대한 저해 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.

(2) 니에블라(Niebla) 속 지의류의 지의류 이차 대사산물인 투미둘린의 CRC 세포 줄기세포능 억제활성 측정

CRC 세포의 줄기에 대한 저해 활성을 갖는 활성 화합물을 조사하기 위해, 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 추출물 (1)을 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석하고, 세 가지 주요 분획을 수집하고 NIH 3T3 세포주를 사용하여 Gli-luc 리포터 분석에서 테스트하였다.

도 2는 니에블라(Niebla) 속의 이차 대사산물인 투미둘린의 CSC221 세포의 줄기세포능 억제 활성을 나타낸 것이다. 분획 II는 조추출물에 필적하는 용량 의존적인 방식으로 Gli-luc 활성을 감소시켰다 (도 2b).

또한, 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS) 및 핵자기 공명 (NMR) 분석 (도 2c)에 의해 활성 정제된 분획은 투미둘린으로 확인되었다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석결과 5 μg/ml 미만의 농도에서 CSC221 세포에서 투미둘린에 의해 세포 생존력이 유의적으로 영향을 받지 않는 것으로 나타났다 (도 2d). 이러한 결과는 투미둘린이 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 추출물에서 CRC 세포의 줄기세포능에 대한 저해 활성을 일으키는 활성 화합물임을 입증할 수 있다.

(3) 투미둘린의 CRC 세포에서 구형(spheroid) 형성 억제 측정

투미둘린의 CRC 세포 줄기세포 저해 활성을 확인하기 위해 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물(1)에 의한 암 줄기의 감소를 다양한 CRC 세포주에서 구형 형성을 측정함으로써 평가하였다.

도 3은 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물 및 투미둘린이 대장암 (CRC) 세포의 구형 형성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 니에블라(Niebla) 속 지의류 조추출물 5㎍/ml 및 다양한 농도의 투미둘린으로 처리한 구형의 수는 CSC221, DLD1 및 HT29 세포를 포함하는 모든 시험 CRC 세포주에 대해 DMSO-처리 대조군 세포보다 현저히 적었다. 그러나 같은 농도에서의 프로파일은 약간의 차이를 보였다. 투미둘린은 1.25㎍/ml에서 CSC221 세포에서 구형 형성을 억제하지 않았지만 다른 두 개의 CRC 세포주 (DLD1과 HT29)에서는 구형 수를 감소시켰다. 정량 분석 결과, 투미둘린은 모든 3 가지 CRC 세포에 대해 용량 의존적으로 구형 형성을 억제함을 확인하였다 (EC₅₀ CSC221 = 2.609 ㎍/ml; EC₅₀ DLD1 = 1.926 ㎍/ml; EC₅₀ HT29 = 1.944 ㎍/ml) (도 3b, c). 세포 생존력은 5 ㎍/ml 농도의 시험된 CRC 세포에서 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 추출물 및 투미둘린에 의해 유의한 영향을 받지 않았으며, 이는 세포 사멸 또는 세포 증식 차단이 이 효과에 관여하지 않음을 시사한다. 종합하면, 이 결과는 투미둘린이 CRC 세포의 줄기를 감소시켰음을 나타낸다.

(4) 투미둘린의 암 줄기 마커 발현 감소활성 측정

ALDH1, CD133, CD44, Lgr5 및 Msi-1은 암 줄기의 획득을 위한 마커이다. 투미둘린이 CRC 세포에서 구형 형성을 억제했으므로 (도 3), 구형 형성이 감소된 화합물 농도에서 CSC 마커의 발현이 하향 조절될 수 있다고 예측할 수 있다. CRC 세포에서 투미둘린이 암 줄기 마커의 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해 qRT-PCR과 웨스턴 블랏팅으로 각각 ALDH1, CD133, CD44, Lgr5 및 Msi-1의 mRNA 발현과 단백질 수준을 측정하였다.

도 4는 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물 및 투미둘린이 암 줄기 관련 유전자 발현 및 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, 투미둘린의 저해 활성은 니에블라(Niebla) 속(1)의 아세톤 조추출물의 저해 활성과 유사하였으며, 2.5 및 5 μg/ml의 농도에서 5개의 모든 암 줄기 마커의 mRNA 발현 및 단백질 수준을 감소시켰다.

(5) 투미둘린의 Gli와 SMO 단백질 생성 감소활성 측정

투미둘린에 의한 암 줄기의 억제에 관여하는 표적 신호 전달 경로를 확인하기 위해, Gli-luc, TOPFLASH-luc 및 파이어플라이 플라스미드와 접합시킨 Hyp-1-luc 유전자로 형질감염된 HEK293T 세포주를 사용하여 리포터 분석을 수행하였다.

도 5는 니에블라(Niebla) 속 지의류의 아세톤 조추출물 및 투미둘린이 전사 인자 활성 및 암 줄기와 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

내부 대조군으로서 Renilla 루시퍼라제로 산술된 상대 값에 기초하여, Gli-luc 활성만이 투여량 - 의존적 방식으로 투미둘린 처리에 의해 유의하게 하향 조절되었다 (도 5a-c). Gli가 sonic hedgehog (SHH) 신호 전달 경로의 주요 전사 인자이기 때문에 이 경로는 투미둘린 치료에 의한 CRC 줄기의 감소와 관련이 있을 것으로 보인다. 이러한 결과는 투미둘린이 CSC 마커의 발현을 하향 조절하고 Gli 전사를 억제함으로써 CRC 암 줄기를 감소시킬 수 있음을 시사한다.

투미둘린의 CRC 줄기세포 감소 활성에 SHH 신호 전달 경로의 관련성을 확인하기 위해 Gli1/2와 smoothened (SMO) 단백질 수준을 측정하였다. 도 5d 및 f에 나타낸 바와 같이, Gli1 및 Gli2 단백질 수준 모두는 CSC221 세포주에서 2.5 또는 5㎍/ml의 농도의 투미둘린에 의해 유의하게 하향 조절되었다. Gli2 단백질은 도 5f에 도시된 정량화 결과에 기초하여 Gli1보다 더 크게 감소되었다. 또한, SMO 단백질 수준도 2.5 또는 5 μg/ml 투미둘린 처리에 의해 감소되었다 (도 5e, g). 이러한 Gli 단백질은 SHH 신호 전달의 말단 작용기이며, SMO는 canonical hedgehog (Hh) 경로의 상류에서 작용하는 전사 조절자이다. 이러한 결과는 투미둘린이 Gli와 SMO를 억제함으로써 Hh 신호 전달 경로를 억제함을 시사한다.

(6) 투미둘린의 Gli 및 SMO 의존성 측정

투미둘린의 줄기세포 저해 작용에 Gli와 SMO가 관여한다는 것을 확인하기 위해 Gli와 SMO 억제제가 있는 상태에서 ALDH1의 mRNA 발현 수준을 측정하였다.

도 6은 Gli, SMO 및 mTOR 억제제의 존재 하에서 투미둘린이 ALDH1의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, Gli 억제제 (GANT61) 및 SMO 억제제 (GDC-0449) 처리는 ALDH1의 mRNA 발현을 감소시켰고, 경로의 하류를 표적으로 하는 GANT61은 GDC-0449보다 mRNA 발현을 감소시켰다. 이러한 억제제가 있는 경우, 투미둘린은 ALDH1 발현을 더 이상 감소시키지 않아서, 투미둘린의 활성이 Gli와 SMO에 의존적임을 시사한다 (도 6). ALDH1 발현의 감소 정도 (도 4)를 감안할 때, 투미둘린은 경로의 상류에서 작용하는 것으로 보인다. 라파마이신(rapamycin)에 의한 mTOR 억제는 췌장암 줄기세포 모집단의 감소로 보고되었다. 그러나 라파마이신의 처리는 CSC221 세포의 ALDH1 발현에 영향을 미치지 않았고, 투미둘린은 라파마이신의 존재 하에서 ALDH1 발현을 감소시켰다 (도 6). 이것은 투미둘린의 활성이 mTOR 경로에 독립적임을 시사한다. 이러한 결과는 지의류 이차 대사산물인 투미둘린이 Hh 신호 전달 경로를 억제하여 CRC 세포의 줄기를 감소시키고 치료제 개발에 큰 잠재력이 있음을 보여준다.

<110> Industry-academic cooperation foundation of sunchon national university <120> Composition for growth inhibition of colorectal cancer stem cells comprising tumidulin <130> PA-18-0285 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH1 forward primer <400> 1 tgttagctca tgccgacttg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH1 reverse primer <400> 2 ttcttagccc gctcaacact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Msi-1 forward primer <400> 3 accaagagat ccaggggttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Msi-1 reverse primer <400> 4 tcgttcgagt caccatcttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lgr5 forward primer <400> 5 ctcttcctca aaccgtctgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lgr5 reverse primer <400> 6 gatcggaggc taagcaactg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 forward primer <400> 7 tgccgctttg caggtgtat 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 reverse primer <400> 8 ggcctccgtc cgagaga 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD133 forward primer <400> 9 ggacccattg gcattctc 18 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD133 reverse primer <400> 10 caggacacag catagaataa tc 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 11 atcaccatct tccaggagcg a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 12 agttgtcatg gatgaccttg gc 22

Claims (3)

1. 투미둘린(tumidulin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 투미둘린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항대장암 보조제.
3. 투미둘린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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