KR102207448B1

KR102207448B1 - 세트라리아 속 지의류로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이의 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물

Info

Publication number: KR102207448B1
Application number: KR1020190101259A
Authority: KR
Inventors: 김항건; 허재선; 양의
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2021-01-27
Also published as: KR20200021893A

Abstract

본 발명은 신규한 지의류 내생 곰팡이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것으로, 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류 로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672 (KACC 83021BP) 추출물은 대장암 줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현을 억제하고, 대장암 줄기세포의 사멸을 유도하며, 대장암 줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키는 효과를 나타내므로 종양줄기세포 성장 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세트라리아 속 지의류로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이의 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물{Composition for growth inhibition of colorectal cancer stem cells comprising extracts of novel endolichenic fungi derived from Cetraria sp. lichen}

본 발명은 신규한 지의류 내생 곰팡이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672 및 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것이다.

암(cancer, 악성종양)은 정상세포가 유전적으로 또는 후천적으로 한 번 이상의 돌연변이를 거쳐 계속적인 분열과 증식에 의해 발생하며, 이 과정에서 이차적인 돌연변이로 형성된 세포의 집단에 의해 종양이 다양한 생물학적 특징을 보인다고 알려져 왔다.

최근에는 종양줄기세포(cancer stem cells)가 암의 원인일 것이라는 가설이 여러 실험 결과에 힘입어 주목받고 있다(G Dontu et al., cell prolif., 2003, 36, 59; M Al-Hajj et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 3983; D Bonnet and JE Dick, Nat. Med, 1997, 3, 730; W Matsui et al., Blood, 2004, 103, 1668; T Reya et al., Nature, 2001, 414, 1051; SK Singh et al., Cancer Res., 2003, 63, 5821; AT Collins et al., Cancer Res., 2003, 63, 5821). 구체적으로, 종양세포에는 자가재생능력(self-renew)과 함께 분화를 통하여 다양한 형질의 암세포를 만들어내는 능력을 가진 종양줄기세포가 존재하며, 이 세포들이 증식하여 악성종양의 성장과 생물학적 특징을 좌우한다고 보고되고 있다. 그러나, 상기 종양줄기세포는 무한적 증식하면서 다양한 생물학적 특징을 가지는 세포로 분화하여 종양세포의 침윤 및 전이를 용이하게 하고, 분화된 종양 세포들에 비하여 화학치료요법(항암제 및 방사선)에 대하여 더 높은 내생을 가져 종양의 재발 등 환자의 예후에 나쁜 영향을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Yu Z, et al., The inter. Jour&biochem. and cell biology, 2012, 44(12):2144-2151; Wu C and Alman BA, Cancer letters, 2008, 268(1): 1-9; Sampieri K and Fodde R, Seminars in cancer biology, 2012, 22(3):187-193; Peitzsch C, et al., Radiotherapy and oncology, 2013, 108(3):378-387). 종양줄기세포의 존재는 급성골수성 백혈병(leukemia)에서 처음 증명되었으며, 최근에는 유방암 등을 포함한 일반 고형종양에서도 종양줄기세포의 존재를 증명함으로써, 고형종양에서도 줄기세포가 존재함을 확인하게 되었다. 따라서, 종양줄기세포 모델은 종양발생의 분자생물학적 특성의 규명, 새로운 진단기술 개발 및 치료 방법을 향상시키는데 큰 도움을 줄 것으로 기대된다.

난치성 질환의 치료 가능성을 제시하면서 줄기세포에 대한 연구가 많은 주목을 받고 있으며, 재생의학(regenerative medicine) 분야뿐만 아니라 암질환의 병태생리의 이해에서부터 치료에 이르기까지 여러 분야에 기여하고 있다.

줄기세포 연구에서 가장 중요한 조건이 특이적인 줄기세포 표지자인데, 최근 장선와의 기저부에 존재하는 장줄기세포 표지자에 대해 lineage-tracing 마우스 실험을 이용한 몇 가지 주요한 발견이 있었다. Leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5 (LGR5)는 장선와 기저부의 Paneth 세포의 사이에 위치한 crypt base columnar 세포(CBC cell)를 표지하는 WNT 신호전달의 표적 분자이고, Blymphoma Mo-MLV insertion region 1 (BMI1)과 telomerase reverse transcriptase (TERT)는 장선와의 +4 LRC 세포에서 발현되는 줄기세포 표지자이다. 이들 장줄기세포 표지자들로 대표되는 장줄기세포들은 위치 및 특성이 서로 다르므로 장줄기세포도 어느 한가지 표지자로 설명할 수 없고 여러 다른 특성의 줄기세포가 혼재되어 있다고 볼 수 있다. 여러 특성상 +4 LRC 세포들이 비활성 상태의 줄기세포, CBC 세포가 활성 상태의 줄기세포로 생각되지만 같은 +4 LRC 세포에서도 BMI1 발현세포와 TERT 발현세포는 또 다른 특성을 보이고 LGR5 세포와의 상하 관계도 다르게 나타나므로 이들 다른 특성의 장줄기세포 간의 상호작용, 상하 관계, 그리고 단클론성 장선와를 형성하게 되는 기전 등에 대해서는 아직 논란이 많다(Lopez-Garcia C, et al., Science 2010;330:822-825; Snippert HJ, et al., Cell 2010;143:134-144).

그 외에도 musashi 1 (Msi-1), OLFM4, ASCL2 등이 오래 전부터 장줄기세 포의 다른 표지자들로 알려져 있고, 최근 CD133 (Prominin-1), CD166, CD44, CD24, aldehyde dehydrogenase-1 (ALDH-1), doublecortin and CAM kinase-like 1 (DCAMKL-1), Ephrin B2 (EphB2), leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain1 (Lrig1), LGR5 등도 주요 장줄기세포 표지자로 보고되었다(Zhu L, et al., Nature 2009;457:603-607; Huang EH, et al., Cancer Res 2009;69:3382-3389; Vaiopoulos AG, et al., Stem Cells 2012;30:363-371; Powell AE, et al., Cell 2012;149:146-158).

암줄기세포를 표적으로 하는 치료는 암의 궁극적 극복을 가능하게 하는 방법 중의 하나가 될 수 있다. 장선와 내에서 정상 줄기세포의 증식과 분화에 관련된 여러 인자 및 신호전달계에 대한 이해를 통해 암줄기세포의 자가 재생 증식을 억제할 방법이 제안되고 있으며, 정상 줄기세포의 유지, 증식 및 분화에서와 유사한 신호전달계가 암줄기세포에서도 작용하므로 WNT, Notch, bone morphogenetic protein (BMP) 등의 신호전달 물질을 조절하고, 미세환경의 영향을 조절함으로써 암줄기세포의 증식을 억제하려는 연구들이 진행되고 있다(Vermeulen L, De Sousa E Melo F, van der Heijden M, et al. Nat Cell Biol 2010;12:468-476).

줄기세포의 유지와 증식 및 분화를 위해서는 매우 복잡한 신호전달체계가 필요하여, 줄기세포 자체에 의한 조절뿐만 아니라 niche 등의 주위 환경으로부터의 신호전달 역시 매우 중요한 역할을 할 것으로 알려져 있다. 정상 장줄기세포 조절에 관여하는 많은 인자 및 신호 전달계가 암줄기세포 조절에서도 주요 인자로서 관여하고 있으므로 정상 장줄기세포 조절인자에 대한 최근의 연구발전은 암줄기세포 조절에 대한 연구에도 많은 공헌을 하고 있다. 현재까지 알려져 있는 장줄기세포 및 장선와 형성 관련 신호전달체계로서 WNT, Hedgehog (Hh), Notch, BMP 등이 알려져 있다.

WNT 신호는 WNT 신호전달계의 하나인 APC 유전자의 변이가 대장암 발생에 중요하게 관여하므로 위장관에서 많이 연구되었으며, 배아 발달, 세포의 항상성 유지 그리고 여러 질환의 발생에 관여하고 있다. 특히 장에서 줄기세포 유지 및 증식과 분화에서 중요한 역할을 한다(Brittan M, et al., Gut 2004;53:899-910).

줄기세포로부터 분화에 이르는 과정은 줄기세포의 분화 프로그램과 주위 환경으로부터의 여러 신호에 의해 결정된다. Notch 신호의 활성화는 hairy/enhancer of split (Hes) 유전자의 발현을 증가시키며, Hes-1 발현 활성화는 분비세포 분화와 관련된 Math-1과 Neu\-rogenin-3와 같은 basic helix-loop-helix (bHLH) 전사인자들의 활성을 억제한다. Notch 신호전달의 중간매개체인 γ-secretase를 억제하면 Hes-1 억제에 의해 장점막내 분비세포 과다 증식을 유발하며, 발생 배아에서 Hes-1이 결손된 마우스는 위와 소장의 내분비 세포의 조기 발달을 보이고 장내 술잔세포와 장세포 수가 증가한다(Milano J, et al., Toxicol Sci 2004;82:341-358; Jensen J, et al., Nat Genet 2000;24:36-44).

Notch 분자는 delta, jagged로 알려진 ligand와 결합하여 활성화되는데, 활성화된 세포는 자신의 Notch ligand를 억제함으로써 주위세포의 Notch 활성화를 억제하게 되며, 이와 같은 기전으로 주위세포의 분화 결정에 기여한다. 장관에서는 Notch 활성화는 흡수장세포와 분비세포 사이의 분화를 결정하여, Notch 신호전달의 억제는 술잔세포의 증식을 유발하고, Notch 활성화는 술잔세포 결손을 유발한다. 또한 WNT 신호와 함께 작용시 세포의 증식을 촉진하고, WNT 신호 없이 단독으로 작용할 때 흡수 장세포로의 분화를 유도 하여 장선와 항상성 유지에 관여한다. 대부분의 대장암종양에서 WNT 신호가 증가되어 있으므로 Notch 신호에 의한 암줄기세포 증식 관련성이 많이 보고되어 있고, Notch 신호 조절에 의한 줄기세포의 분화가 잘 알려져 있으므로, 암줄기세포 억제 및 분화치료에 주요 표적인자가 될 수 있다(Crosnier C, et al., Nat Rev Genet 2006;7:349-359; Fre S, et al., Nature 2005;435:964-968; van Es JH, van Gijn ME, Riccio O, et al. Nature 2005;435:959-963; van Es JH, de Geest N, van de Born M, Clevers H, Hassan BA. Nat Commun 2010;1:18).

Shh은 골격계, 중앙신경계, 얼굴 등과 같은 여러 가지 신체 조직의 발달에서 세포 증식과 형태형성에 매우 중요한 역할을 하며 특히 신경줄기세포의 증식과 분화에 중요한 역할을 하는 인자이다 (Chiang C, et al., Nature. 1996; 383, 407-13). 암의 발생과 배아 발생과정에서 중요한 역할을 수행하는 전사 조절 유전자 Gli는 Shh 신호전달 경로에서 Shh의 신호를 전달하고 실체화하는데 결정적인 역할을 하며, 실제로 정상세포에서 Gli1 유전자를 활성화시키면 세포 성장은 증가하고 세포사멸기전은 억제되어 암이 발생된다(Kawai S, et al., Bone. 2001; 29, 54-61).

한편, 지의류(lichen)는 곰팡이(fungi, mycobionts)와 조류(algae, photobionts)가 복합체가 되어 생활하는 공생생물로서 모양, 크기 및 색깔이 매우 다양하며 주로 바위, 수피 및 토양에서 서식한다. 지의류 내에서는 지의류에 가시적 피해를 유발하지 않으면서 더불어 존재하는 다양한 곰팡이들이 존재하는데 이를 지의류 내생 곰팡이 (endolichenic fungi; ELF)라고 하며 최근에 새로운 생물자원으로 주목을 받고 있다. 이러한 지의류 내생 곰팡이들이 생성하는 2차대사산물들은 항산화, 항균, 항염증 항암 등 다양한 생리활성을 지니고 있는 것으로 알려지고 있다(Kramer et al., 1995). 따라서 다양한 생리활성을 지니면서도 신규성과 희귀성이 높은 물질들을 지의류 내생 곰팡이에서 찾아낼 수 있는 가능성이 매우 높기 때문에 지의류 내생 곰팡이를 이용한 분자생물학적 연구가 활발하게 진행되고 있다(Hwang H.G. et al., The Korean Journal of microbiology, 2011, 47(1), 97-101).

이에 본 발명자들은 독성 및 부작용이 없는 천연물 유래의 대장암 치료제 또는 대장암 성장억제용 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 신규한 지의류 내생 곰팡이를 분리하였고, 이의 추출물은 암세포에 대하여 세포독성을 나타내고, 대장암 줄기세포의 사멸을 유도하며, 특히 대장암 줄기세포의 재생 및 종양세포로의 분화를 억제시킴을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672를 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항대장암 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 추출물을 포함하는 약학적 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 대장암 줄기세포 억제용 조성물을 개체에 투여하여 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 항대장암 보조제를 종래 다른 화학요법과 병용하여 대장암의 재발을 억제시킬 뿐만 아니라 대장암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672로부터 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 지의류 내생 곰팡이의 대사산물을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 "추출물"은 상기 추출액 뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672는 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 분리된 지의류 내생 곰팡이로, 서열번호 3으로 이루어진 ITS를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 여기서, 지의류 내생 곰팡이는 자낭균(lichenized fungi)에 속하는 균류로서 지의류를 형성하는 곰팡이가 아닌 지의체 내에서 특별한 피해를 유발하지 않고 서식하고 있는 곰팡이로서 지의류의 지의체(thallus)로부터 분리한 균류를 말한다.

구체적으로, 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류의 지의체 조직을 완전 표면살균 후에 감자한천배지(potato dextrose agar; PDA)에서 치상, 배양하여 지의류 내생 곰팡이를 분리한 후, 지의류 내생 곰팡이의 ITS 부위 염기서열을 분석한 결과, 새로운 균주를 발견하게 되었고, 그 새로운 균주는 598bp 염기서열로 이루어진 ITS를 포함하는 지의류 내생 곰팡이 EL001672이며, 이를 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agriculural Culture Collection, KACC)에 2018년 9월 20일자로 KACC 83021BP로 기탁하였다.

상기한 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 추출물은 지의류 내생 곰팡이 EL001672를 유기용매로 추출하여 획득한 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 효능을 나타내는 물질을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 유기용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대장암 줄기세포 성장억제는 종양줄기세포의 사멸, 종양줄기세포의 자가재생, 암세포로의 분화 억제 및 종양줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현 억제를 포함하는 의미이다. 여기서, 상기 종양줄기세포는 자가재생능력(self-renewal)과 암세포로 분화하는 능력(differenatiaion)을 동시에 가진 미분화세포이다.

한편, 종양줄기세포 표지자(cancer stem cell markers)는 종양줄기세포의 전이, 암세포로의 성장 및 증식 등에 관여하며, 암이 재발한 환자에서 많이 발현하는 단백질이다. 따라서, 상기 종양줄기세포 표지자의 발현 억제는 종양줄기세포의 전이, 암세포로의 성장 및 증식, 암세포의 재생성을 억제할 수 있으므로 암을 치료할 수 있다.

하나의 구체적 예로, ALDH-1(aldehyde dehydrogenase-1)는 생리적 또는 병리적 환경에서 알데히드의 산화를 촉매하는 세포 내 효소로, 두경부암, 대장암, 유방암, 급성백혈병, 폐암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있고, CD133(prominin-1; AC133)은 암세포의 부착 및 이동에 중요한 역할을 하는 대표적 세포부착 분자로, 뇌종양, 대장암, 간암, 폐암, 갑상선암, 난소암, 후두암, 자궁내막 또는 자궁암, 두경부암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있으며, CD44(hyaluronate receptorl P-glycoprotein 1)는 CD133과 유사한 역할을 하는 단백질로, 췌장암, 간암, 전립선암, 난소암, 대장암, 담도암, 자궁경부암, 두경부암, 유방암 평편 세포암, 위암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있다. Msi-1(RNA-binding protein; musahi-1)은 종양줄기세포의 성장을 돕는 단백질로, 유방암, 위암, 뇌암, 결장암, 피부암 등의 종양줄기세포 및 암세포 표지자로 사용되고 있고, Lgr-5(Wnt targeting gene; APR49)는 Wnt 신호전달의 표적 분자로, 직장암, 대장암 등의 종양줄기세포 표지자로 사용되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 종양줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현을 억제하고, 종양줄기세포의 사멸을 유도하며, 종양줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키므로 종양줄기세포를 선택적으로 타겟하는 화학치료요법이 가능하게 하며, 암의 재발을 막을 수 있는 조성물로 사용될 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 순천대학교 한국지의류센터에서 분양받은 다양한 지의류 내생 곰팡이의 추출물들은 인간 대장암 줄기세포에 대하여 세포독성을 나타내었으며, 이중 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물이 가장 우수한 세포독성을 나타냈다. 또한, 인간 대장암 줄기세포(CSC221)에 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 처리할 경우 사멸된 대장암 줄기세포의 수가 증가하였고, 대장암 줄기세포의 분화 또는 자가재생을 촉진하는 표지자로 알려진 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 BMsi-1의 발현이 감소되었다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 유효성분으로 포함하는 종양줄기세포 성장 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물에 포함되는 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량인 0.001 중량% 미만인 경우에는 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 효과가 너무 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하므로 비경제적이다.

본 발명에 따른 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 대장암 세포에 대하여 독성을 나타내고, 대장암 조직의 성장속도 및 크기를 감소시키므로 대장암을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 사용될 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 지의류 내생 곰팡이 EL001672를 분리하고, 이로부터 추출한 추출물을 대장암 세포(DLD1 및 HT29)에 처리한 경우 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 대장암세포 및 암 줄기세포에 대하여 독성을 나타내었다.

본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 억제용 조성물은 종래 다른 화학요법과 병용하여 사용될 수 있다.

구체적으로, 기존의 방사선 치료나 항암제 치료와 병행하여 사용함으로써 항암 효과를 극대화시킬 수 있다. 특히, 화학적 항암제 등과 함께 투여함으로써, 종양줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종래의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다.

상기 항암제는 기존에 사용되고 있는 임의의 약물이라면 어느 것이나 사용 가능하다. 예를 들어, 머스타드 가스 유도체류(메클로레타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 및 이포스파미드 등), 에틸렌이민류(티오테파 및 헥사메틸멜라민), 아킬알킬술포네이트류(부술판), 히드라진류 및 트리아진류(알트레타민, 프로카르바진, 다카르바진 및 테모졸로마이드), 니트로스유레아류(카르뮤스틴, 로뮤스틴 및 스트렙토조신 등), 금속염류(카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드류(빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈오렐빈), 탁산류(파클리탁셀 및 도세탁셀), 포도필로톡신류(에토포시드 및 테니소피드), 캄프토테칸 유사체류(이리노테칸 및 토포테칸), 안트라시클린류(독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 이다루비신), 크로모마이신류(닥티노마이신 및 플리카마이신), 항종양 항생제류(미토마이신 및 블레오마이신 등), 엽산 길항제류(메토트렉세이트), 피리미딘 길항제류(5-플루오로우라실, 폭수리딘, 시타라빈, 카페시타빈 및 젬시타빈), 퓨린 길항제류(6-메르캅토퓨린 및 6-티오구아닌), 아데노신 디아미나제 억제제류(클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈 및 펜토스타틴), 토포이소머라제 I 억제제류(이로노테칸 및 토포테칸), 토포이소머라제 II 억제제류(암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드), 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제류(히드록시유레아), 아드레노코르티칼 스테로이드 억제제류(미토탄), 효소류(아스파라기나제 및 페가스파르가제), 항미소관제류(에스트라뮤스틴) 및 레티노이드류(벡사로텐, 이소트레티노인 및 트레티노인(ATRA))로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 유효성분으로 포함하는 항대장암 보조제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 항대장암 보조제는 종래 화학적 항암제 등과 함께 병용하여 사용함으로써, 대장암 세포를 사멸시키는 항암제의 효과를 증강시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 항대장암 보조제를 기존의 화학적 항암제 등과 함께 투여함으로써, 종양줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종래의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다.

한편, 본 발명의 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적고, 종양줄기세포의 사멸유도, 종양줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키며, 종래의 화학요법(항암제 및 방사선 치료)과 병용하여 사용하는 경우 암세포의 사멸과 함께 종양줄기세포의 사멸을 함께 유도함으로써 기존의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 항암치료 효과를 증강시키는 효과를 나타내므로 약학적 및 식품 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

하나의 구체적 양태로서, 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 약학적 조성물로 사용하는 경우, 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물 이외에 약학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체이다.

상기 약학적 조성물로 적합한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량인 0.001 중량% 미만인 경우에는 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 효과가 너무 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하므로 비경제적이다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 보다 구체적으로, 치료될 개체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 함량을 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 환자에게 투여되는 조성물의 투여량은 환자 체중의 약 0.5-1,000 ㎎/kg 일 수 있다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 현탁액, 과립제, 정제, 분말제, 에멀젼제 또는 갑셀제 등의 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물 또는 항암 보조제는 종래의 화학요법(항암제 및 방사선 치료)과 병용하여 사용함으로써 암세포의 사멸과 함께 종양줄기세포의 사멸을 함께 유도함으로써 기존의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 항암치료 효과를 증강시킬 수 있다. 아울러 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 약학적 및 식품 조성물에 매우 안전하게 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 개체에 투여하여 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물을 개체에 투여하여 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 사멸유도, 대장암 줄기세포의 자가재생 억제, 대장암 세포로의 분화, 성장 및 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 포함하는 항암 보조제를 종래 다른 화학요법(항암제 및 방사선 치료)과 병용하여 대장암의 재발을 억제시킬 뿐만 아니라 대장암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물을 포함하는 항대장암 보조제를 기존의 항암제와 함께 개체에 투여하거나 방사선 치료에 함께 병용하여 종래 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 개체 내 기관에 존재하는 대장암 줄기세포의 선택적 타겟팅(targeting)을 통해 암을 원천적으로 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 종양줄기세포 억제용 조성물 또는 항암 보조제를 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개채에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 종양줄기세포 억제용 조성물 또는 항암 보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "억제" 또는 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제, (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명의 상기 방법에 의하여 상술한 개체의 질환 또는 질병은 본 발명의 종양줄기세포 성장 억제용 조성물 또는 항암 보조제의 개체 내 투여에 의하여 억제 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.

본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명의 상기 방법에 의하여 상술한 개체의 질환 또는 질병은 본 발명의 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물 또는 항암 보조제의 개체 내 투여에 의하여 억제 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.

본 발명의 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672 추출물은 대장암 줄기세포 표지자인 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr-5 및 Msi-1의 발현을 억제하고, 대장암 줄기세포의 사멸을 유도하며, 대장암 줄기세포의 자가재생 및 암세포로의 분화를 억제시키는 효과를 나타내므로 종양줄기세포 성장 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물은 항암 보조제로서 기존의 화학적 항암제와 함께 투여하거나, 방사선 치료에 함께 병용하는 경우 대장암 줄기세포의 선택적 타겟팅 효과를 통해 종양줄기세포의 항암제 및 방사선 저항성을 감소시켜 암의 재발을 억제할 뿐만 아니라 암을 원천적으로 치료할 수 있게 한다. 아울러, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 약학적 및 식품 조성물에 매우 안전하게 사용될 수 있다.

도 1은 ELF 라이브러리(55종) 추출물의 Gli 프로모터 활성 저해를 나타낸 그래프이다.
도 2는 ELF 추출물의 Wnt/β-catenin 신호전달경로 억제활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 ELF 추출물의 Notch 신호전달경로 억제활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 ELF 추출물의 CSC221 세포에 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 ELF 추출물의 종양줄기세포 마커 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr5 및 Msi-1의 mRNA 발현 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 ELF 추출물의 대장암 세포주 DLD1를 이용한 스페로이드(Spheroid) 형성능 분석결과이다.
도 7은 ELF 추출물의 대장암 세포주 HT29를 이용한 스페로이드(Spheroid) 형성능 분석결과이다.
도 8은 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 분리한 신규 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 ITS 서열을 분석한 결과이다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 지의류 내생 곰팡이 수집 및 이의 추출물 제조

지의류 내생 곰팡이(Endolichenic fungi; ELF) 라이브러리를 순천대학교의 한국 지의류 연구센터(Korean Lichen Research Institute; KoLRI)로부터 분양받았다. 이들 분양받은 지의류 내생 곰팡이의 균사를 감자 덱스트로스 고체배지(Potato dextrose agar medium; PDA, 감자 추출물 24g/L, Agar 10g/L) 에 접종한 후 1달 동안 배양하여 회수하였다. 그 다음 상기 배양된 지의류 내생 곰팡이를 동결건조시킨 후 아세톤을 첨가하여 쏙시렛 추출장치(Soxhlet extractor)로 추출하였다. 그 다음 이들 추출물을 여과하고, 45℃에서 진공 건조시켰다.

상기 제조된 지의류 내생 곰팡이 추출물은 DMSO(dimethylsulfoxide)로 용해한 후 이후의 모든 실험에 사용하였다.

실시예 2: 대장암 줄기세포능(cancer stemness) 억제 활성을 가지는 ELF 추출물 스크리닝

2-1. Gli 프로모터 활성 저해 측정

본 실험에서는 Gli 프로모터 활성을 저하시키는 추출물을 스크리닝하였다. 대조군으로 DMSO를 사용하였다.

암세포 종양줄기세포능 획득 및 유지에 Shh, Wnt, Notch 신호전달경로 등이 중요하게 작용한다고 알려져 있다. 이중 Shh 신호전달경로가 Gli에 의해 Gli-promoter를 활성화시키면, 종양줄기세포능을 발현하는데 필요한 단백질의 전사(transcription)와 번역(translation)이 증가하게 된다.

상기 실시예 1의 ELF 추출물 라이브러리를 이용해 Gli 프로모터의 활성을 억제하는 추출물을 스크리닝하였다. 이때, 대조군으로 DMSO를 사용하였으며, 양성대조군으로 스틱타 위겔리(Sticta weigelii) 추출물(도 1의 2번째 샘플임)을 사용하였다.

구체적으로, Gli 프로모터를 가진 리포터 벡터와 pRL-TK 벡터를 영구적으로 갖게 만든 형질전환된 쥐 섬유모세포(NIH3T3) 세포를 사용하였다. 이때, pRL-TK 벡터는 레닐라 루시퍼라제(renila luciferase)를 발현하는 벡터로서, 각각의 웰에서의 세포생존률을 나타내는 내부 대조군으로 사용하였다.

먼저, 상기 형질전환된 쥐 섬유모세포(NIH3T3) 세포를 24 웰 플레이트에 각각 500 ㎕/웰로 분주한 후 37℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 12시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 실시예 1에서 제조한 54종의 지의류 내생 곰팡이 추출물을 각각 넣어준 다음 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 용해하여 루시퍼라아제 분석 시스템(luciferase reporter assay system, Promega, USA)을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다.

그 결과는 도 1에 나타내었다. 여기서 붉은 색으로 표시된 막대 그래프의 지의류 내생 곰팡이 추출물이 유의적인 Gli 프로모터 활성 저해(75% 미만)를 나타내는 추출물인 것으로 확인하였다.

2-2. Wnt 및 Notch 활성 측정

상기에서 Gli 프로모터 억제활성을 나타낸 추출물에 대하여 각각 Wnt 및 Notch 활성을 측정하는 TOPFLASH 및 HES-Luc을 이용하여 억제활성을 측정하였다.

구체적으로, 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK293T) 세포에 TOPFLASH 리포터 벡터 또는 HES-1 리포터벡터를 형질전환하여 사용하였다. 이때, pRL-TK 벡터는 레닐라 루시퍼라제(renila luciferase)를 발현하는 벡터로서, 형질전환한 각각의 웰에서의 형질전환효율을 나타내는 내부 대조군으로 사용하였다.

먼저, 배양한 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK293T) 세포를 24 웰 플레이트에 각각 500 ㎕/웰로 분주한 후 37℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 12시간 동안 배양하였다. 12시간 배양 후 트랜스펙션 시약(transfection reagent)과 상기 각 군의 벡터가 혼합된 물질을 각 웰에 넣어준 다음 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 후 배지를 조심스럽게 제거하고 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 교체해주면서, 상기 실시예 2-1에서 Gli 프로모터 활성 저해를 나타내는 지의류 내생 곰팡이 추출물 13종을 각각 넣어준 다음 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 용해하여 루시퍼라아제 분석 시스템(luciferase reporter assay system, Promega, USA)을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다.

그 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2은 ELF 추출물의 Wnt 억제활성을 나타낸 그래프이다. 도 3은 ELF 추출물의 Notch 억제활성을 나타낸 그래프이다.

그 결과 Gli 프로모터에 억제활성을 보인 ELF 추출물이 Wnt/β-catenin 신호전달경로와 Notch 신호전달경로에 대해서도 다양한 정도로 억제활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 지의류 내생 곰팡이 추출물의 인간 대장암 줄기세포에 대한 스페로이드(Spheroid) 분석

상기 실시예 2를 통하여 밝혀진 종양줄기세포능(cancer stemness) 억제 활성을 가지는 ELF 추출물의 CSC221(cancer stem cell enriched human colorectal adenocarcinoma cell line) 세포(대장암 줄기세포)에 대한 스페로이드(Spheroid) 분석을 수행하였다(Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1888).

구체적으로, 대장암 줄기세포(CSC221)를 트립신-EDTA를 이용하여 단일 세포로 현탁시켰다. 이후 상기 대장암 줄기세포를 인간 형질전환 상피세포증식인자(hrEGF; 20 ng/mL; Biovision) 및 인간 유래 섬유아세포 증식인자(hbEGF; 10 ng/mL; Invitrogen)가 포함된 질소첨가 DMEM/F12 배양배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 접종하였다. 그 다음 24 웰 플레이트에 1 X 10⁴ 세포/웰이 되게 상기 대장암 줄기세포를 분주한 후 5 ㎍/mL 농도의 지의류 내생 곰팡이 추출물을 첨가하고 10 내지 14일 동안 배양하여 집락형성 정도를 IMT iSolution software(IMT i-Solution Inc., Northampton, NJ, USA)를 이용하여 관찰하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 실험의 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 양성 대조군으로는 0.01% DMSO를 처리한 세포주를 사용하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

상기 표 1의 결과를 토대로 Gli, HES1, 및 TOPFLASH 모두에 억제활성 (1.0 이하)을 가지며 CSC221 세포에 대한 유의적 억제 활성을 나타내는 EL001541, EL001558, EL001609, EL001668 및 EL001672의 지의류 내생 곰팡이 추출물 총 5종을 선택하였다.

실시예 4 : 지의류 내생 곰팡이 추출물의 인간 대장암 줄기세포에 대한 세포독성 측정

CSC221 세포를 10% FBS(fetal bovine serum, Gen Depot, USA), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium, Gen Depot, USA)을 이용하여 배양하였다. 배양은 온도 37℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 이루어졌다.

그 다음 대장암 줄기세포(CSC221)를 96-웰 플레이트에 1 X 10⁴ 세포/웰이 되도록 분주한 후 5% CO₂가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 16시간 배양하였다. 이후 각 웰에 상기 실시예 3에서 CSC221 세포에 대한 유의적 억제활성을 나타내는 5종의 EL001541, EL001558, EL001609, EL001668 및 EL001672 추출물 100 ㎍/mL를 처리한 후 5% CO₂가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 60시간 동안 반응시켰다. 그 다음 각 웰에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 넣고 37℃ 세포 배양기에서 배양시킨 후, 50% DMSO와 20% SDS가 포함되어 있는 세포 용해 용액을 첨가하여 각 세포를 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader, VERSAmax, molecular devices, minnesota, USA)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 다음 세포 성장 억제정도가 50%일 때의 시료 농도를 IC₅₀ 값으로 나타내었다. 상기 세포에 대한 독성 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 세포 독성에 대한 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 여기에서 보듯이, EL001558 추출물을 제외한 나머지 추출물들은 CSC221 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않았다.

이에 따라 유효활성을 가지는 ELF 추출물은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

실시예 5 : 지의류 내생 곰팡이 추출물에 의한 종양줄기세포 마커의 mRNA 양 변화 측정

상기 실시예 4에서 인간 대장암 줄기세포에 대한 세포독성이 없는 ELF 추출물에 대하여 종양줄기세포 마커 Aldh1, CD133, CD44, Lgr5 및 Msi-1의 mRNA 양을 감소시키는지를 확인하였다.

대장암 줄기세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후 5% CO₂가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 각 웰에 5 ㎍/mL 농도의 ELF 추출물을 각각 처리한 후 5% CO₂가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 각각 48시간 동안 반응시켰다. 그 다음 상기 배지를 제거한 후 트리졸(trizol)을 이용하여 RNA를 추출하고, MMLV revese transcriptase kit(invitrigen, Carlsbad, CA, USA)와 SYBR green(Enzynomics, Seoul, Korea)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그 다음 생성된 cDNA와 PCR 반응 완충액 및 ALDH-1, CD133, CD44, Lgr5, Msi-1 및 GAPDH의 프라이머를 첨가하여 증폭하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 실험의 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 대조군으로는 DMSO를 처리한 대장암 줄기세포주를 사용하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. 여기에서 보듯이, EL001668 및 EL001672 추출물이 종양줄기세포 마커 Aldh1, CD133, CD44, Lgr5 및 Msi-1의 mRNA 양을 유의적으로 감소시켰다.

실시예 6: 지의류 내생 곰팡이 추출물의 대장암 세포주 DLD1 및 HT29를 이용한 스페로이드(Spheroid) 분석

상기 실시예 5에서 종양줄기세포 마커의 mRNA의 양을 감소시킨 ELF 추출물에 대하여 대장암 세포주 DLD1 및 HT29를 이용하여 스페로이드(Spheroid) 분석을 수행하였다.

대장암 세포주 DLD-1 및 HT29를 트립신-EDTA를 이용하여 단일 세포로 현탁시켰다. 그 다음 상기 대장암 줄기세포를 인간 형질전환 상피세포증식인자(hrEGF; 20 ng/mL; Biovision) 및 인간 유래 섬유아세포 증식인자(hbEGF; 10 ng/mL; Invitrogen)이 포함된 질소첨가 DMEM/F12 배양배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 접종하였다. 그 다음 24 웰 플레이트에 1 X 10⁴ 세포/웰이 되게 상기 대장암 세포주를 분주한 후 2.5, 5 및 10 ㎍/mL 농도의 EL001668 및 EL001672 추출물을 첨가하고 10 내지 14일 동안 배양하여 집락형성 정도를 IMT iSolution software(IMT i-Solution Inc., Northampton, NJ, USA)를 이용하여 관찰하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 실험의 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 양성 대조군으로는 0.01% DMSO를 처리한 세포주를 사용하였다. 그 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7은 EL001668 및 EL001672 추출물의 대장암 세포주 DLD1 및 HT29를 이용한 스페로이드(Spheroid) 분석 결과이다. 그 결과 EL001668 및 EL001672 추출물은 DLD1 및 HT29의 스페로이드 형성능을 농도의존적으로 억제하였다.

상기 실험 결과를 하기 표 3에 정리하였으며, 이들 결과로부터 지의류 내생 곰팡이 EL001668 및 EL001672는 대장암 종양줄기세포능을 억제하는 유효 활성이 우수하여 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물 및 대장암 예방, 치료 및 개선을 위한 조성물로 유용할 것이다.

실시예 7 : 지의류 내생 곰팡이 동정

상기 실시예 1 내지 6에 의해 유의성이 확인된 지의류 내생 곰팡이 EL001672를 동정하였다.

구체적으로 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 균사를 감자 덱스트로스 고체배지(Potato dextrose agar medium; PDA, BD Difco, Sparks, MD, USA)에 접종하여 25℃에서 배양하였다. 배양된 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 총 DNA를 제작자의 지침서(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 추출하였다. rNDA 유전자의 internal transcribed spacer(ITS) 부위를 universal primers ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3', 서열번호: 1) (Gardes and Bruns 1993) 및 LR5 (5'-ATCCTGAGGGAAACTTC-3', 서열번호: 2) (Vilgalys and Hester 1990)를 이용하여 증폭하였다.

상기 PCR 반응 사이클 조건은 94℃에서 5분 동안 변성단계 이후, 94℃에서 30초 변성(denaturation), 55℃에서 30초 어닐링(annealing) 및 72℃에서 30초 신장(extention)을 한 사이클로 하여 30회 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분 동안 신장단계를 수행하였다. 이어서, 수득된 PCR 산물을 농축하고 PCR 퀵-스핀 PCR 산물 정제 키트(INTRON biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 정제하였다.

실험 결과, 세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 분리한 지의류 내생 곰팡이 EL001672의 ITS 서열은 598bp(서열번호 3)로 종래 지의류 내생 곰팡이의 ITS 서열과 큰 차이를 나타냄을 확인하고(도 8 참조), 신규한 지의류 내생 곰팡이로 분류하였다.

이에 본 발명자는 상기 지의류 내생 곰팡이 EL001672를 2018년 9월 20일자로 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 KACC 83021BP로 기탁하였다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION OF SUNCHON NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for growth inhibition of colorectal cancer stem cells comprising extracts of novel endolichenic fungi derived from Cetraria sp. lichen <130> PA-18-0210 <150> KR 10-2018-0097707 <151> 2018-08-21 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primers ITS1F <400> 1 cttggtcatt tagaggaagt aa 22 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primers LR5 <400> 2 atcctgaggg aaacttc 17 <210> 3 <211> 598 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ITS sequence of endolichenic fungi EL001672 derived from Cetraria sp. lichen <400> 3 tatgatatgc ttaagttcag cgggtattcc tacctaatcc gaggtcaacc actagaaata 60 tagggggttt tacggcaggc agctaaggcg actgcagaag cgagaaaaga tttactacgc 120 tcagagtacg ccataactcc gccactgact ttgaggagct acgctataac cgtaggctcc 180 caacgctaag ctacagggct taatggtcga aatgacgctc gaataggcat gcccactaga 240 atactaatgg gcgcaatgtg cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac 300 attacttatc gcatttcgct gcgttcttca tcgatgccag aaccaagaga tccgttgttg 360 aaagttttaa cttatttttg tttggagcat tcagaaatac actattttaa acagagttta 420 ggggtcctcc ggcgggccgt gagccggcta cagggtagcc gcccgtttta cagggcgggc 480 tacagggtag ccgcagcgag cgccgaggca actggaggta aggttcacat agggtttgga 540 gtttagttta actctgtaat gatccctccg ctggttcacc aacggagacc ttgttacg 598

Claims

세트라리아 속 (Cetraria sp.) 지의류로부터 분리된 신규한 지의류 내생 곰팡이 EL001672 (KACC 83021BP).
지의류 내생 곰팡이 EL001672 (KACC 83021BP)로부터 추출된 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 조성물.
지의류 내생 곰팡이 EL001672 (KACC 83021BP)로부터 추출된 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
지의류 내생 곰팡이 EL001672 (KACC 83021BP)로부터 추출된 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.