KR100786358B1

KR100786358B1 - 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물

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Publication number: KR100786358B1
Application number: KR1020070003601A
Authority: KR
Inventors: 박수영; 이욱재; 정용환; 윤원종; 이정아; 김지영; 오대주
Original assignee: 재단법인 제주하이테크산업진흥원
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2007-12-17

Abstract

본 발명은 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 참그물바탕말 추출물은, 참그물바탕말(Dictyota dichotoma)을 흐르는 물에 세척하여 염분을 제거한 후, 음건하고, 분쇄하여 미세분말로 만들어 80 % 에탄올에 침적하고, 이 에탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출한 다음, 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 물에 현탁시킨 후, 현탁액을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출하여 참그물바탕말 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해 항염활성이 우수한 참그물바탕말 추출물이 제공되며, 참그물바탕말 추출물을 활성성분으로 포함하는 항염활성이 뛰어난 조성물이 제공된다.

항염, 갈조류, 참그물바탕말, 추출, 조성물

Description

항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물{DICTYOTS DICHOTOMA EXTRACTS HAVING ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY}

도 1은 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 mRNA 발현 억제효과를 나타내는 RT-PCR에 의한 결과그래프.

도 2는 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 IL-1β의 mRNA 발현 억제효과를 나타내는 RT-PCR에 의한 결과그래프.

도 3은 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 IL-6의 mRNA 발현 억제효과를 나타내는 RT-PCR에 의한 결과그래프.

도 4는 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 iNOS의 mRNA 발현 억제효과를 나타내는 RT-PCR에 의한 결과그래프.

도 5는 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 COX의 mRNA 발현 억제효과를 나타내는 RT-PCR에 의한 결과그래프.

도 6은 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 단백질 수준에서의 iNOS 생성억제 효과를 나타내는 웨스턴블랏 결과사진.

도 7은 본 발명의 참그물바탕말 디클로로메탄 분획물에 대하여 RAW264.7 세포에서 단백질 수준에서의 iNOS 생성억제 효과를 나타내는 웨스턴블랏 결과사진.

도 8은 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 단백질 수준에서의 COX-2 생성억제 효과를 나타내는 웨스턴블랏 결과사진

도 9는 본 발명의 참그물바탕말 디클로로메탄 분획물에 대하여 RAW264.7 세포에서 단백질 수준에서의 COX-2 생성억제 효과를 나타내는 웨스턴블랏 결과사진

도 10은 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 RAW264.7 세포에서 PGE₂ 생성 억제효과를 나타내는 그래프.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다.

일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonine), 브래디키닌(bradykinin), 프로스타글란딘(prostaglandins), 하이드록시에이코사테트라에노익산 hydroxyeicosatetraenoic acid(HETE), 루코트리엔 (leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다.

그러나, 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.

체내 염증과정에서는 과량의 산화질소(nitric oxide, NO) 및 프로스타글란딘E₂(prostagladin E₂ _,PGE₂) 등의 염증인자가 iNOS(inducibility nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)에 의해 형성된다.

이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다.

종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)와 같은 다 기능성 사이토킨(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히, 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다.

TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되어 왔으며, 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성를 증가시킴으로 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다.

따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 cytokine인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 PGE₂의 생성 억제를 통해 전구염증분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다.

세균감염 하에서 항생제 치료시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방 출되는 LPS는 내독소 쇼크(endotoxin shock)를 일으킨다.

또한 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 되므로 약물 처리를 하여 LPS의 작용을 줄임으로서 효과를 볼 수 있을 것이다.

현재까지의 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다.

그러나, 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다.

최근에는 상기의 종래기술과 같이 화학약물의 부작용을 극복하기 위해 천연물, 특히 해양생물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 많이 진행되고 있다.

한국공개특허공보 10-2005-0095298(가죽그물바탕말 추출물을 포함하는 피부보호 및 피부질환 개선용 조성물)에는, 가죽그물바탕말 추출물을 0.1 ~ 50 중량%로 포함하고 있는 약학적 조성물로서, 비만세포에서 히스타민 및 β-헥소사미니데이즈 등의 매개물질의 유리를 억제하며, IL-8 및 TNF-α 등과 같은 세포활성물질의 유리를 억제함으로써, 피부질환의 개선 및 치료효과를 나타내는 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 그물바탕말과의 갈조류에 대해서는 상기 종래기술의 가죽그물바탕말 추출물의 피부질환 개선 효과에 관한 연구 정도 외에는 더 다양한 생리활성에 대한 연구가 이뤄지고 있지 않은 실정이다.

본 발명에 의해 항염활성이 우수한 참그물바탕말 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 참그물바탕말 추출물을 활성성분으로 포함하는 염증 예방 및 개선용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명의 항염활성이 우수한 참그물바탕말 추출물이 첨가된 음료조성물, 식품첨가제, 사료첨가제, 화장료조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 참그물바탕말 추출물은, 참그물바탕말(Dictyota dichotoma)을 흐르는 물에 세척하여 염분을 제거한 후, 음건하고, 분쇄하여 미세분말로 만들어 80 % 에탄올에 침적하고, 이 에탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출한 다음, 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 이 농축물을 물에 현탁시킨 후, 현탁액을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출하여 참그물바탕말 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명의 참그물바탕말(Dictyota dichotoma (Hudson) Lamourorux(sensus in Okamura))은 분류학적으로 갈조류(Phaeophyta) 그물바탕말목(order Dictyotales), 그물바탕말과(family Dictyotaceae), 그물바탕말속(tribe Dictyoteae)에 속하며, 본 종은 동해안과 제주도를 포함한 남해안의 조하대 수심 1 ~ 5 m 깊이에서 여러 개체가 서로 엉킨 상태로 생육한다.

이들은 엽체의 두께가 얇아서 파도나 조류의 흐름에 의해 유난히 흔들거리고, 또 체색이 엷은 회갈색을 띠며, 몸 전체에서 푸른 형광을 띠고 있어서 야외에서 다른 그물바탕말과는 명확하게 구별된다.

갈조류의 하나인 참그물바탕말에 대한 성분이나 생리활성에 대한 보고는 거의 없는 실정이다.

이에 본 발명의 발명자들은 참그물바탕말에서 활성 성분을 추출하여 생리활성을 확인한바, 염증성 사이토카인 억제효과 및 그 작용기전 실험에서 참그물바탕말 추출물의 우수한 항염증 효과를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 본 발명의 참그물바탕말 추출물이 세포 독성에 미치는 영향을 알아보았으며, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 참그물바탕말 추출물과 각 분획물의 효과를 알아보았다.

또한, 본 발명의 참그물바탕말 추출물이 초기 염증성 분자 생성에 미치는 영향, iNOS 생성에 미치는 영향, COX-2 발현에 미치는 영향, PGE₂ 생성에 미치는 영향을 실험하여 본 발명의 참그물바탕말 추출물의 항염활성에 대해 알아보았다.

젖산탈수소효소(LDH)는 모든 세포의 세포질 안에 존재하는 효소로서 피브릭 산(pyruvic acid)과 젖산(lactic acid) 간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다.

따라서, 본 발명에서는 손상을 입은 세포가 방출하는 LDH 활성을 측정하여 본 발명의 참그물바탕말 추출물이 세포 독성에 미치는 영향에 대해 실험하였다.

그 결과, RAW264.7 세포 (1.5×10⁵cells/㎖)에 참그물바탕말 추출물 및 분획물과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24 시간 배양한 후, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 확인한 결과, 50 ㎍/㎖ 이상의 처리 농도부터는 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 다소 강한 독성이 나타났으나, 25 ㎍/㎖ 이하의 처리농도에서는 모든 분획물에서 거의 독성이 나타나지 않았다(표 1).

일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

이에 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide (NO) 생성에 대한 참그물바탕말 추출물과 각 분획물의 효과를 알아보았다.

그 결과, 헥산 및 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다(표 2).

또한, 내독소로 잘 알려진 지질다당류(lipopolysaccaride, LPS)는 그람-음성 균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 마크로파지(macrophage) 또는 모노사이트(monocyte)에서 종양괴사인자(TNF-α), IL-6(Interleukin-6), IL-1β(Interleukin-1β)와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다.

따라서, RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 알아보았다.

그 결과, LPS 자극과 함께 처리하여 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성 억제에 대한 참그물바탕말의 추출물 및 용매분획물을 25 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, TNF-α 생성 억제는 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 나타냈으며, IL-6 생성 억제는 헥산과 디클로로메탄 분획물이, IL-1β 생성 억제는 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 나타내었다(도 1 ~ 3).

iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 nitric oxide(NO)를 생성하며, 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.

그리고, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

RAW264.7 세포에 LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 참그물바탕말 추출물과 분획물을 처리하여 iNOS 생성에 대한 억제 정도를 RT-PCR을 통해 알아보았다.

그 결과, RT-PCR에 의한 유전자 발현은 헥산, 디클로로메탄 그리고 에틸아세테이트 분획물에서 iNOS의 유전자발현이 강하게 억제되었다(도 4).

그러나, 웨스턴블랏(Western blot)에 의한 단백질 발현 수준에서는 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(도 6).

또한, NO 생성 억제 효과와 초기-염증성 분자(Pro-inflammatory molecule) 생성 억제 효과가 가장 두드러지게 나타난 디클로로메탄 분획물을 농도별(0, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하여 iNOS의 단백질 발현정도를 확인한 결과 농도의존적으로 iNOS의 단백질 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 7).

이러한 결과는 NO의 생성 억제가 iNOS 발현 억제를 통한 것으로 여겨진다.

한편, 다수의 염증 억제 약물들의 작용기전은 프로스타글란딘(prostagladin) 합성 억제를 나타내며 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다.

따라서, COX-2에 의한 프로스타글란딘(prostagladin)의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다.

RAW264.7 세포에 LPS (1 ㎍/㎖) 를 사용하여 COX-2의 생성을 유도한 후 참그물바탕말 추출물과 분획물을 처리하여 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 RT-PCR과 웨스턴블랏(Western blot)을 통해 알아보았다.

그 결과, 디클로로메탄 분획물에서 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(도 5, 도 7).

또한, 디클로로메탄 분획물을 농도별(0, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하여 COX-2의 단백질 발현정도를 확인한 결과 농도의존적으로 COX-2의 단백질 발현이 감소되었다(도 8).

Cyclooxygenase(COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘(prostaglandins, PGs)으로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다.

COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하며, COX-2는 염증매개물질인 PGE₂를 형성시킨다.

PGE₂는 염증반응, 면역반응, 그리고 맥관형성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

마크로파지(Macrophage) RAW 264.7 세포에서 염증성 PGE₂ 억제 효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다.

그 결과, PGE₂ 생성억제는 25 ㎍/㎖의 농도에서는 디클로로메탄 분획물에서 다른 분획물에 비해 높은 억제 효과를 나타내었으며, 참그물바탕말의 디클로로메탄 분획물이 LPS에 의해 발현되는 PGE₂ 억제에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

이러한 결과는 COX-2의 생성 억제가 PGE₂ 생성 억제를 통한 것으로 여겨진 다.

상기의 실험 결과로부터 본 발명의 참그물바탕말 추출물이 항염활성이 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명의 항염활성을 가지는 참그물바탕말 추출물은 식품첨가제, 사료첨가제, 음료조성물, 화장료조성물 등 다양하게 활용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물을 활성성분으로 포함하는 염증 예방 및 개선용 조성물을 제조할 수 있다.

이때, 본 발명의 염증 예방 및 개선용 조성물은 환, 캡슐, 과립, 현탁액 등 다양한 형태로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물에 대하여 실시예 및 실험예를 통해 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물 제조

제주도 문섬 연안 조하대에서 참그물바탕말(Dictyota dichotoma)을 2006년 4월 경에 채집하여, 흐르는 물에 염분을 제거한 후 음건하였다.

음건 된 시료 24.9 g를 마쇄기로 분쇄하여 미세분말 시료를 80 % 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축하여 참그물바탕말 에탄올추출물 8.1424 g을 제조하였다.

이 에탄올 추출물을 증류수 1ℓ에 현탁시킨 후에 헥산(1ℓ× 3), 디클로로메 탄(1ℓ× 3), 에틸아세테이트(1ℓ× 3), 부탄올(1ℓ× 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 진공 건조하여, 헥산추출물 0.5110 g, 디클로로메탄 추출물 0.7520 g, 에틸아세테이트 추출물 2.3639 g 및 부탄올 추출물 0.3406 g, 그리고 잔사 8.8918g 을 얻었다.

<실시예 2> 참그물바탕말 추출물을 이용한 염증 예방 및 개선용 액상조성물 제조

본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 참그물바탕말 추출물을 준비하였다.

통상적인 염증 치료용 조성물의 제조시 준비한 본 발명의 참그물바탕말 추출물을 30 중량% 첨가하여 본 발명의 염증 예방 및 개선용 액상조성물을 제조하였다.

<실시예 3> 참그물바탕말 추출물을 이용한 염증 예방 및 개선용 환 제조

본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 참그물바탕말 추출물을 동결건조 한 후 분말로 준비하였다.

준비한 분말 1 ㎏에 물 200 g, 꿀 100 g을 넣고 반죽하여 환 제조장치에 넣어 환 모양으로 만든 후, 건조기에 넣고 30 ℃ 에서 12 시간 동안 건조하여 염증 예방 및 개선용 환을 제조하였다.

<실시예 4> 참그물바탕말 추출물이 함유된 음료조성물의 제조

정제수 1 ℓ 당 준비한 참그물바탕말 추출물 10 g, 비타민 B2 4 g, 비타민 B6 6 g, 니코틴산아미드 10 g, 구연산 30 g, 액상과당 2 ㎏, 허브향 70 ㎖ 를 첨가하여 본 발명의 참그물바탕말 추출물이 함유된 음료조성물을 제조하였다.

<실시예 5> 참그물바탕말 추출물이 함유된 화장료조성물의 제조 1

통상적인 크림 조성물 제조시, 상기의 추출물을 3 % 첨가하여 염증의 예방 및 개선용 크림조성물을 제조하였다.

<실시예 6> 참그물바탕말 추출물이 함유된 화장료조성물의 제조 2

통상적인 에센스 조성물 제조시, 상기의 추출물을 1 % 첨가하여 염증의 예방 및 개선용 에센스조성물을 제조하였다.

<실시예 7> 참그물바탕말 추출물이 함유된 식품첨가제의 제조

본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 참그물바탕말 추출물을 동결건조 후 분말로 제조하였다.

통상적인 식품 제조시 상기의 분말을 0.1 중량% 첨가하여 사용하였다.

<실시예 8> 참그물바탕말 추출물이 함유된 사료첨가제의 제조

통상적인 가축용 사료에 상기의 분말을 10 중량% 첨가하여 사용하였다.

<실험예 1> 세포 독성에 미치는 영향 측정실험

1. 세포배양

대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 한국유전자은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)로부터 분양 받아 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 units/㎖ 과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

2. 실험방법

젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)는 모든 세포의 세포질 안에 존재하는 효소로서 피브릭산(pyruvic acid)과 젖산(lactic acid) 간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다.

본 실험에서는 손상을 입은 세포가 방출하는 LDH 활성을 측정하는 비색분석법(Colorimetric assay)을 사용하였다.

즉, 세포를 48 well plate의 각 well에 seeding 하고 24 시간 동안 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하여 세포배양이 끝난 후 LDH 세포독성 검색 키트(cytotocixity detection kit, Promega)를 사용하여 492 ㎚에서 효소활성을 측정하였다.

3. 실험결과

본 발명의 참그물바탕말 추출물이 세포 독성에 미치는 영향에 대해 실험한 결과, RAW264.7 세포 (1.5×10⁵cells/㎖)에 참그물바탕말 추출물 및 분획물과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24 시간 배양한 후, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 확인한 결과, 50 ㎍/㎖ 이상의 처리 농도부터는 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 다소 강한 독성이 나타났으나, 25 ㎍/㎖ 이하의 처리농도에서는 모든 분획물에서 거의 독성이 나타나지 않았다(표 1).

이에 모든 실험은 25 ㎍/㎖ 이하에서 이루어졌다.

<표 1> 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대한 세포독성 검색결과

구 분	LDH 세포독성(%)
구 분	25 ㎍/㎖	50 ㎍/㎖
에탄올 추출물	-	4.31
헥산 추출물	2.33	57.78
디클로로메탄 추출물	-	37.74
에틸아세테이트 추출물	-	7.49
부탄올 추출물	-	3.12
물 분획물	-	8.19

<실험예 2> NO 생성 억제효과 측정실험

1. 실험방법

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5× 10⁵cells/㎖로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 추출물 시료와 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다.

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다.

세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.

생성된 NO의 양은 질산나트륨(NaNO₂)를 표준으로 비교하였다.

2. 실험결과

본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대하여 NO 생성 억제효과를 실험한 결과, 헥산 및 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다(표 2).

<표 2> 본 발명의 참그물바탕말 추출물에 대한 NO 생성 억제효과 실험결과

구 분	NO 억제율 (%)
구 분	25 ㎍/㎖	50 ㎍/㎖
에탄올 추출물	7.77	29.23
헥산 추출물	69.27	93.17
디클로로메탄 추출물	76.18	95.36
에틸아세테이트 추출물	27.84	25.94
부탄올 추출물	1.66	5.84
물 분획물	0.96	4.02

<실험예 3> 초기 염증성 분자 생성에 미치는 영향 측정실험

1. 실험방법

내독소로 잘 알려진 지질다당류(lipopolysaccaride, LPS)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 마크로파지(macrophage) 또는 모노사이트(monocyte)에서 종양괴사인자(TNF-α), IL-6(Interleukin-6), IL-1β(Interleukin-1β)와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증 가시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다.

따라서, RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현 정도를 RT-PCR를 통해 알아보았다.

세포로부터의 Total RNA 추출은 TRI-reagent (MRC)를 이용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다.

1 ㎍의 Total RNA를 oligo(dT)₁₈ primer, dNTP(0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2U로 70 ℃ 5 min, 37 ℃ 5 min, 37 ℃ 60 min, 그리고 70 ℃에서 10 min 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다.

중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 합성된 cDNA로부터 유전자를 증폭시키기 위하여 2 ㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3' primer, 10X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM MgCl₂, 1 unit Taq polymerase (Promega)를 섞고 증류수로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음 Perkin-Elmer 사의 온도순환기(Thermal Cycler)를 이용하여 PCR을 실시하였다.

이때, PCR cycle은 94℃/45초, 55 ~ 60℃/45초, 72℃/60초, 30회 이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5 % 아가로스겔(agarose gel)에서 전기영동을 실시하고 이티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드를 확인하였다(표 3).

<표 3> RT-PCR 분석시 사용된 프라이머 서열 및 단편 사이즈

Gene		Primer sequences	Fragment size(bp)
TNF-α	F	5'-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3'	364
	R	5'-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3'
IL-1β	F	5'-CAGGATGAGGACATGAGCACC-3'	447
	R	5'-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3'
IL-6	F	5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3'	308
	R	5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3'
iNOS	F	5`-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3`	496
	R	5`-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3`
COX-2	F	5'-CACTACATCCTGACCCACTT-3'	696
	R	5'-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3'
β-Actin	F	5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3'	603
	R	5'-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3'

2. 실험결과

본 결과, LPS 자극과 함께 처리하여 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성 억제에 대한 참그물바탕말의 추출물 및 용매분획물을 25 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, TNF-α 생성 억제는 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 나타냈으며, IL-6 생성 억제는 헥산과 디클로로메탄 분획물이, IL-1β 생성 억제는 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 나타내었다(도 1 ~ 3).

<실험예 4> iNOS 생성에 미치는 영향 측정실험

1. 실험방법

iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다 량의 nitric oxide(NO)를 생성하며, 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.

RAW264.7 세포에 LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 참그물바탕말 추출물과 분획물을 처리하여 iNOS 생성에 대한 억제 정도를 RT-PCR과 Western blot를 통해 알아보았다.

배양이 끝난 세포를 수집하여 2 ~ 3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 한 후 1 ㎖의 용해 완충용액(lysis buffer)을 첨가하여 30 분간 용해(lysis) 시킨 후 12,000 rpm에서 20 분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다.

단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 단백질 정량키트(Protein Assay Kit, Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다.

30 ~ 50 ㎍의 용해액(lysate)을 8 ~ 12 % mini gel SDS-PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane (BIO-RAD)에 200mA로 2시간 동안 transfer하였다.

그리고 Membrane의 blocking은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2 시간동안 실시하였다.

iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1: 1000) (Santa-Cruz) 을 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1: 1000) (Cell Signaling)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다.

2차 항체로는 HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1: 5000으로 희석하여 상온에서 30 분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1 ~ 3 분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

2. 실험결과

RT-PCR에 의한 유전자 발현은 헥산, 디클로로메탄 그리고 에틸아세테이트 분획물에서 iNOS의 유전자발현이 강하게 억제되었다(도 4).

<실험예 5> COX-2 발현에 미치는 영향 측정실험

1. 실험방법

다수의 염증 억제 약물들의 작용기전은 프로스타글란딘(prostagladin) 합성 억제를 나타내며 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다.

2. 실험결과

디클로로메탄 분획물에서 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(도 5, 도 7).

<실험예 6> 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂) 생성에 미치는 영향 측정실험

뮤린대식세포주(Murine macrophage cell line) 인 RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5 % CO₂ 항온기에서 18 시간 전배양하였다.

이후 배지를 제거하고 10배 농도 (1 mg/㎖)로 조제된 시험물질 25 ㎕와 450 ㎕의 LPS 최종농도(1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다.

24 시간 후 PGE₂를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다.

PGE₂의 정량은 PGE₂ ELISA kit (R&D Systemes, Inc, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r² 값은 0.99 이상이었다.

2. 실험결과

PGE₂ 생성억제는 25 ㎍/㎖의 농도에서는 디클로로메탄 분획물에서 다른 분획물에 비해 높은 억제 효과를 나타내었으며, 참그물바탕말의 디클로로메탄 분획물이 LPS에 의해 발현되는 PGE₂ 억제에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

이러한 결과는 COX-2의 생성 억제가 PGE₂ 생성 억제를 통한 것으로 여겨진다.

본 발명은 항염활성이 우수한 참그물바탕말 추출물이 제공된다.

또한, 본 발명의 참그물바탕말 추출물을 활성성분으로 포함하는 염증 예방 및 개선용 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 항염활성이 우수한 참그물바탕말 추출물이 첨가된 음료조성물, 식품첨가제, 사료첨가제, 화장료조성물이 제공된다.

Claims

갈조류 추출물에 있어서,

참그물바탕말(Dictyota dichotoma)을 미세분말로 만들어 80 % 에탄올에 침적하고, 이 에탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출한 다음, 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 물에 현탁시킨 후, 현탁액을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출하여 제조한 참그물바탕말 추출물로서,

NO 생성 억제활성, 초기 염증성 분자 생성 억제활성, iNOS 발현 억제활성, COX-2 발현 억제활성, 염증성 PGE₂ 생성 억제활성 중 1종 이상의 활성을 나타내는 것이 특징인,

항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물.
제1항의 참그물바탕말 추출물을 활성성분으로 포함하는,

염증 예방 및 개선용 조성물.