KR100991398B1 - 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해조류인 쇠꼬리산말(Desmarestia viridis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 질소산화물(NO) 생성 억제, 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 억제, 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS) 발현 억제 및 전염증성 사이토카인인 인터루킨-1β(IL-1β) 발현 억제 활성을 통하여 항염증 효과를 나타내며 세포독성은 없으므로, 염증관련 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품, 건강기능식품 또는 기능성 사료에 유용하게 사용될 수 있다.

쇠꼬리산말, 항염증, 질소산화물, 프로스타글란딘, 질소산화물 합성효소, 인터루킨-1β

Description

쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물{Compositions for anti-inflammation containing Desmarestia viridis extracts as an active ingredient}

본 발명은 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 염증 억제활성을 나타내는 해조류인 쇠꼬리산말의 추출물을 포함하는 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 기능성 사료에 관한 것이다.

염증(inflammation)은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직손상에 대하여 국소적으로 나타나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 의하여 촉발되며, 이들 화학매개인자들은 염증과정의 형태에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화 시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 또한, 꽃가루와 같이 무해한 물질이나 천식, 류마티스성 관절염과 같은 자가면역반응에 의해 부적절하게 염증이 촉발되는 경우에는 방어반응 자체가 오히려 조직을 손상시킴으로 항염증제가 필요하게 된다. 거의 모든 임상질환에서 염증 반응을 관찰할 수 있고, 이들 염증 질환 중에는 항생제 투여로 원인적 치료가 가능한 세균성 질환도 있지만, 대부분은 그 발병이 자가면역반응에 의한 조직손상에 기인하므로 특이적 치료법이 없는 난치병으로 알려져 있다.

이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 항염증제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 항염증제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 항염증제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 즉, 염증 질환을 치료하기 위하여 적당한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)을 사용하여 염증을 완화시키며, 염증이 심하거나 NSAIDs의 효능이 없으면 스테로이드 제제를 사용하며, 난치성인 경우 면역 억제제나 수술요법을 실시하게 된다. 이 경우 사용되는 NSAIDs는 주로 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase; COX)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타내나, 위장 장애, 간장애, 신기능 장애 등의 부작용을 야기하여 장기간의 사용이 어렵다. 이러한 NSAIDs에 비해 스테로이드 제제는 환자에게 사용할 수 있는 가장 빠른 방법으로, 항염증 효과가 빠르고 극적으로 나타나는 약물로 알려져 있다. 그러 나 널리 알려진 것처럼 이 약물은 세균 감염에 대한 저항력을 약하게 하고, 당뇨병의 악화, 부신부전증, 정신 기능장애 등을 일으키는 것으로 독성이 매우 심각할 뿐만 아니라 치료를 시작하면 중지하기가 어렵기 때문에 사용상 주의를 요하며, 가능하면 금해야 하는 것으로 알려져 있다. 이처럼 합성 항염증제는 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 앞서 언급한 바와 같이 효력이 강하면서도 비교적 부작용이 적은 항염증제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다. 특히 효능 및 부작용 측면에서 볼 때, 예로부터 임상적 경험이 풍부하고 안전성 측면에서 탁월한 평가를 받고 있는 천연물 제제가 염증 질환의 예방 및 치료제 개발에 있어 좋은 후보물질이 될 것으로 생각된다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 화학적 자극에 의하여 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 NO를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)나 인터페론γ, TNF-α와 같은 사이토카인 자극에 의해 발현되는 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS)는 장시간 동안 다량의 질소산화물(NO)을 생산한다. 이러한 산화적 스트레스는 IκB에 의하여 억제되어 있는 염증 반응의 전사인자인 NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 NFκB는 핵으로 이동하여 iNOS, COX-2 및 IL-1β나 TNF-α와 같은 여러 종류의 사이토카인 등 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 이들 인자들을 저해하면 염증 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Baeuerle et al ., Annu. Rev. Immunol., 12:141-179, 1994).

질소산화물(NO)은 세 가지 주요한 질소산화물 합성효소(NOS) 이성질체인 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS(eNOS), inducible NOS(iNOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된다. nNOS와 eNOS는 Ca^{2 +}/칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 NO는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생리학적 과정에 관여하며, 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NFκB를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다(Lawrence et al., Nat Med., 7:1291-1297, 2001; Riehemann et al ., FEBS Lett., 442:89-94, 1999;Stamler et al., Science, 258:1898-1902, 1992).

프로스타글란딘은 환상구조를 지닌 20개의 탄소를 포함하고 있는 불포화 지방산 유도체로 주로 만성 염증 질환에 관여하는 화학 전달물질이며 천식 등의 자가면역질환에도 관여한다(Ruf el al ., Eur. J. Biochem., 204:1069-1073, 1992). 프로스타글란딘은 COX에 의하여 생합성되는데 이 효소는 COX-1과 COX-2의 두 가지 이성질체가 존재한다(Smith et al ., J. Biol. Chem., 271:33157-33160, 1996). COX-1 은 위나 신장과 같은 조직에서 일정하게 존재하는 효소로서 정상적인 항상성을 유지하는데 관여하는 반면, COX-2는 염증이나 기타 면역 반응시 세포분열인자나 사이토카인에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현된다. 급성 혹은 류마티스성 관절염과 같은 만성의 염증 질환의 치료에 사용되는 NSAIDs은 COX-2 효소를 억제할 뿐만 아니라 COX-1 효소도 억제함으로써 앞서 언급한 위장관 장애와 같은 여러 가지 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Masferrer et al ., P. Natl. Acad. Sci. USA., 91:3228-3232, 1994).

따라서, 상기 질소산화물(NO) 생성을 억제하거나, 프로스타글란딘 생성을 억제하거나, iNOS 발현 또는 IL-1β의 발현을 억제하는 물질을 탐색하면, 효과적인 항염증용 물질로 판명할 수 있을 것이다.

한편, 쇠꼬리산말(Desmarestia viridis)은 갈조식물 산말과의 바닷말로 썰물대 하부의 바위에 붙어 산다. 한류성 식물로 식물체는 원기둥 모양의 줄기에 사방으로 밀생하는 가지를 낸다. 이들 가지는 작은 가지를 밀생하여 가지 끝은 털 모양으로 가늘게 된다. 몸은 60∼90 cm 자라고, 중심가지는 지름 3 mm 정도이다. 다른 산말과의 식물처럼 몸속에 산을 많이 함유하고 있어서 물속에서는 밤색을 띠나 공기 중에서는 청색이 되며, 말리면 담황색이 된다. 한국(남해안)·일본·중국 등지에 분포한다(두산백과사전).

종래 쇠꼬리산말과 관련하여 Xiaojun Yan 등은 쇠꼬리산말의 DPPH 분석을 통한 자유라디칼 소거 활성을 밝혀 항산화효과가 있음을 알아낸 바 있 다(Antioxidative activities in some common seaweeds; Plant Foods for Human Nutrition, vol. 52, no. 3, p. 253-262, 1998. 9).

하지만, 그 외 쇠꼬리산말에 관한 연구는 전무한 상태이며, 특히 쇠꼬리산말 추출물의 항염증 효과 지표를 대상으로 한 구체적인 항염증 효과는 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 쇠꼬리산말 추출물을 제조하고, 인터페론γ/LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주에서 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물이 NO 생성 억제, 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 억제, NO 생산 효소인 iNOS 발현 억제, 전염증성 사이토카인인 IL-1β 발현 억제 등의 우수한 항염증 효과를 가지며, 세포독성이 전혀 없는 안전한 물질임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항염증용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 기능성 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 쇠꼬리산말 추출물을 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 질소산화물(NO) 생성 억제, 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 억제, 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS) 발현 억제 및 전염증성 사 이토카인인 인터루킨-1β(IL-1β) 발현 억제 활성을 통하여 항염증 효과를 나타내며 세포독성은 없으므로, 염증관련 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품, 건강기능식품 또는 기능성 사료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 “항염증” 또는 “염증억제”라 함은, 질병 상태로 진행된 만성 염증, 꽃가루와 같이 일반적으로 무해한 물질에 의한 염증반응, 천식 혹은 류마티스성 관절염과 같은 자가 면역 반응에 의한 염증반응 등 인체에 유해한 염증반응의 억제를 의미한다.

본 명세서에서 “쇠꼬리산말 추출물”이라 함은, 천연물인 쇠꼬리산말로부터 유효성분을 추출하여 얻어진 것이라면 특별히 한정하지 않고 모두 포함한다. 예컨대, 쇠꼬리 산말을 물이나 유기용매에 넣고 정치, 교반, 가압 또는 가열 등의 수단을 통해 유효성분을 용출함으로써 얻어진 결과물을 들 수 있다. 또한, 상기와 같이 얻어진 액상 추출물을 동결건조함으로써 얻어진 동결건조물을 포함한다. 또한, 그러한 동결건조물을 분쇄한 분말을 포함한다. 그 외에도 유효성분을 추출하기 위해 가능한 수단이 무엇이든지 가리지 않고 추출된 모든 추출물을 포함하며, 추출된 후 동결 건조 등의 가공을 거친 것까지도 모두 포함된다. 기타, 중탕이나 상온에 의한 추출법과 같이 예로부터 전해 내려오거나, 한의서 또는 교과서에 기재되어 있는 통 상적인 추출법에 의한 추출물을 포함한다. 또한, 특정 활성 화합물들을 분리하기 위한 특별한 추출방법인 Stass Otto 추출법이나 각종 칼럼 크로마토그래피 방법 등을 통하여 얻어진 분획 추출물을 포함한다.

본 발명은 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 쇠꼬리산말은 채취한 것, 양식한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 일례로 채취한 후 물로 세척하여 이물질 및 염분을 제거한 후 건조하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 쇠꼬리산말 추출물은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법으로 제조된 것일 수 있다. 바람직하게는 쇠꼬리산말 건조물을 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C₁~C₄의 저급 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 일례로 쇠꼬리산말 건조물을 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 넣고 용액을 끓이며 환류 추출한 후, 일정시간 방치한 다음 거름종이 등으로 여과하여 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 이때 알코올 용매의 부피는 분쇄한 시료 부피의 5 내지 15배인 것이 바람직하다. 추출 시간은 2 내지 12 시간인 것이 바람직하며, 3 시간인 것이 가장 바람직하다. 이후 에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 쇠꼬리산말 추출물을 염증을 억제할 정도의 양으로 투여하는 단계를 포함하는 염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

이 때, 염증을 억제할 정도의 양이란 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 0.1 내지 500 mg/kg 더욱 바람직하게는 1 내지 100 mg/kg이다. 상기 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에 따른 쇠꼬리산말 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위하여 BALB/c 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포주를 대상으로 질소산화물(NO) 생성 억제, 프로스타글란딘(PGE₂) 생성 억제, 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS) 발현 억제, 인터루킨-1β(IL-1β) 발현 억제 효과 및 세포독성 평가 실험을 수행하였다.

측정 결과, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL의 농도에서 인터페론γ/LPS 자극 처리군에 비하여 NO 생성을 각각 6, 12, 27, 50, 85% 억제시켰으며(도 1 참조), 5, 10, 20 μg/mL의 농도에서 인터페론γ/LPS 자극 처리군에 비하여 PGE₂ 생성을 각각 17, 24, 42% 억제시켰다(도 2 참조). 또한, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 20 μg/mL의 농도에서 NO 생산 효소인 iNOS 발현 및 전염증성 사이토카인인 IL-1β 발현을 전사 수준에서 억제하는 것으로 나타났다(도 3 및 도 4 참조). 한편, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 항염증 효과를 유도하는 2.5-40 μg/mL의 농도에서 세포독성이 전혀 없는 것으로 나타났다(도 5 참조).

상기 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 항염증 효과가 뛰어나며, 매우 안전한 것으로 판단되는바, 항염증용 의약품, 건강기능식품, 기능성 사료 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카 카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은, 그다지 심각한 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은, 유효성분으로서 쇠꼬리 산말 추출물을 전체 조성물 중량 중 0.001 내지 99.9중량% 함유할 수 있다. 0.001중량% 이상이어야 효과를 기대할 수 있고, 불순물의 존재 등으로 인해 99.9중량%를 넘기 어렵기 때문이다.

아울러, 본 발명은 상기 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

이 때, 상기 식품 중의 상기 쇠꼬리산말 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 내지 99.9 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중에는 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 0.1 g, 더 바람직하게는 0.05 내지 0.1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 쇠꼬리산말 추출물을 함유하는 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 쇠꼬리 산말 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 조성물을 가금류, 가축 등이 꾸준히 섭취하게 함으로써 염증을 예방할 수 있고, 기발생한 염증을 치료할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 쇠꼬리산말 추출물의 제조

강원도 강릉시 안인진 지역에서 채취한 쇠꼬리산말을 물로 씻어 이물질 및 염분을 제거한 후 건조하였다. 상기 건조물을 적당한 크기로 분쇄하여 17.15 g을 추출용기에 넣은 후 에탄올 200 mL를 가하여 환류 냉각 추출하고, 거름종이로 여과하여 추출물을 얻었다. 추출과정은 4회 반복하였고, 이후 용매를 감압 농축 및 건조하여 1.05 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.

실험예 1: 쇠꼬리산말 추출물의 질소산화물(NO) 생성 억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물의 항염증 효과 지표 중 하나인 질소산화물(NO) 생성 억제 효과를 측정하기 위하여 BALB/c 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포주를 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지용액을 RAW 264.7 세포와 혼합하여 96 웰 플레이트에 웰 당 5×10⁴ 세포를 넣어 6시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에 무자극 대조군은 동일 배지로, 무자극 처리군은 상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물을 각각 2.5, 5, 10, 20 및 40 μg/mL의 농도로 포함한 배지로, 자극 대조군은 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함한 배지로, 자극 처리군은 인터페론γ(100 U/ml)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함하며 상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물을 각각 2.5, 5, 10, 20 및 40 μg/mL의 농도로 포함한 배지로 바꾸어 준 후 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 50 μL의 배양액을 취하여 동일 부피의 그리에스(Griess) 시약과 혼합한 후 550 nm의 흡광도 를 측정하였다. 동일 배지에 녹인 여러 농도의 아질산나트륨(sodium nitrite) 표준 곡선을 이용하여 시료의 아질산염(nitrite) 양을 정량하였다.

상기 측정결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물은 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL의 농도에서 인터페론γ/LPS 자극 처리군에 비하여 NO 생성을 각각 6, 12, 27, 50 및 85% 정도 억제시키는 것으로 확인되었다.

실험예 2: 쇠꼬리산말 추출물의 프로스타글란딘 E ₂ (PGE ₂ ) 생성 억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물의 항염증 효과 지표 중 하나인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 억제 효과를 측정하기 위하여 BALB/c 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포주를 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지용액을 RAW 264.7 세포와 혼합하여 24 웰 플레이트에 웰 당 2×10⁵ 세포를 넣어 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에 대조군은 동일 배지로, 양성 대조군은 20 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 포함한 배지로, 처리군은 상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물을 5, 10, 20 μg/mL의 농도로 포함한 배지로 바꾸어 준 후 4시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 무자극 대조 군을 제외한 모든 실험군에 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 처리한 후 16시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 취하여 PGE₂ ELISA 키트로 PGE₂의 농도를 측정하였다.

상기 측정결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물은 5, 10, 20 μg/mL의 농도에서 인터페론γ/LPS 자극 처리군에 비하여 PGE₂ 생성을 각각 17, 24, 42% 정도 억제시키는 것으로 확인되었다.

실험예 3: 쇠꼬리산말 추출물의 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS) 발현 억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물의 항염증 효과 지표 중 하나인 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS)의 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 BALB/c 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포주를 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지용액을 RAW 264.7 세포와 혼합하여 6 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁶ 세포를 넣어 4시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 이 때, 무자극 대조군은 배지만 사용하였으며, 자극 대조군은 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함한 배지를 사용하였고, 자극 처리군은 상기 실시예 1에서 수득한 쇠꼬리산말 추출물을 20 μg/mL의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함 한 배지를 사용하였다. 배양 종료 후 세포를 회수하여 전체 RNA를 분리하였다. 1 μg RNA를 사용하여 반정량적 RT-PCR을 수행하여 iNOS 발현을 측정하였다. Internal control로는 housekeeping 단백질인 β-액틴(β-actin)의 발현을 측정하였다.

측정결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 쇠꼬리 산말 추출물은 20 μg/mL의 농도에서 유도성 질소산화물(NO) 합성 효소인 iNOS 발현을 전사 수준에서 억제하는 것으로 나타났다.

실험예 4: 쇠꼬리산말 추출물의 인터루킨-1β( IL -1β) 발현 억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물의 항염증 효과 지표 중 하나인 인터루킨-1β(IL-1β) 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 BALB/c 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포주를 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지용액을 RAW 264.7 세포와 혼합하여 6 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁶ 세포를 넣어 6시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 이 때, 무자극 대조군은 배지만 사용하였으며, 자극 대조군은 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함한 배지를 사용하였고, 자극 처리군은 상기 실시예 1에서 수득한 쇠꼬리산말 추출물을 20 μg/mL의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함 한 배지를 사용하였다. 배양 종료 후 세포를 회수하여 전체 RNA를 분리하였다. 1 μg RNA를 사용하여 반정량적 RT-PCR을 수행하여 IL-1β 발현을 측정하였다. Internal control로는 housekeeping 단백질인 β-actin의 발현을 측정하였다.

측정결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 쇠꼬리 산말 추출물은 20 μg/mL의 농도에서 전염증성 사이토카인인 IL-1β 발현을 전사 수준에서 억제하는 것으로 나타났다.

실험예 5: 쇠꼬리산말 추출물의 세포독성 측정

상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 BALB/c 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포주를 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 먼저, 10% 우태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지용액을 RAW 264.7 세포와 혼합하여 96 웰 플레이트에 웰 당 5×10⁴ 세포를 넣어 6시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에 무자극 대조군은 동일 배지로, 무자극 처리군은 상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물을 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 포함한 배지로, 자극 대조군은 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함한 배지로, 자극 처리군은 인터페론γ(100 U/mL)/지질다당류(LPS, 10 μg/mL)를 포함하며 상기 실시예 1에서 제조한 쇠꼬리산말 추출물을 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 포함한 배지로 바꾸어 준 후 18시간 동 안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 WST-1 시약을 첨가하여 3시간 동안 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양한 후 450 nm의 흡광도를 측정하였다.

측정결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 항염증 효과를 유도하는 2.5-40 μg/mL의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

상기 실험예로부터 본 발명의 쇠꼬리산말 추출물은 항염증지표인 질소산화물(NO) 생성 억제, 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 억제, 질소산화물(NO) 합성 효소인 iNOS 발현 억제, 전염증성 사이토카인인 인터루킨-1β(IL-1β) 발현 억제 등의 활성을 통하여 항염증 효과를 나타내며, 세포독성은 없으므로, 항염증용 의약품, 건강기능식품, 기능성 사료 등에 안전한 물질로 유용하게 이용될 수 있다.

하기에 본 발명의 일실시예에 따른 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 정제의 제조

실시예 1의 쇠꼬리산말 추출물……………… 100 mg

옥수수 전분……………………………………… 68 mg

락토오즈…………………………………………… 90 mg

미세결정질 셀룰로즈…………………………… 40 mg

마그네슘 스테아레이트…………………………… 2 mg

통상적인 정제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합하고, 교반한 후, 과립화하였다. 건조 후 타정기를 사용하여 1 정당 유효 성분인 쇠꼬리산말 추출물이 100 mg씩 포함되어 있는 목적하는 정제를 제조하였다.

제제예 2. 캅셀제의 제조

실시예 1의 쇠꼬리산말 추출물…………………… 100 mg

옥수수 전분…………………………………………… 68 mg

락토오즈………………………………………………… 90 mg

미세결정질 셀룰로즈…………………………………… 40 mg

마그네슘 스테아레이트………………………………… 2 mg

통상적인 캅셀제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합한 후, 1 캅셀 당 100 mg의 쇠꼬리산말 추출물이 포함되도록 적절한 크기의 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

제제예 3. 츄잉정의 제조

실시예 1의 쇠꼬리산말 추출물……………………… 100 mg

과립당 시럽…………………………………………… 240 mg

향료……………………………………………………… 2 mg

옥수수 전분…………………………………………… 60 mg

만니톨………………………………………………… 100 mg

마그네슘 스테아레이트……………………………… 20 mg

정제수………………………………………………… 적당량

통상적인 츄잉정의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 적당량의 물에 혼합하고, 가열하면서 용해시킨 후, 냉각시키고 성형기에 넣어 목적하는 형상의 츄잉정을, 1개 당 100 mg의 쇠꼬리산말 추출물이 포함되도록 제조하였다.

제제예 4. 캔디의 제조

실시예 1의 쇠꼬리산말 추출물………………… 100 mg

과립당 시럽………………………………………… 640 mg

향료…………………………………………………… 2 mg

물엿…………………………………………………… 230 mg

50% 타르타르산……………………………………… 20 mg

정제수………………………………………………… 적당량

과립당 시럽을 소량의 물에 완전히 용해하면서 110℃까지 가열한 후, 쇠꼬리산말 추출물을 용해한 나머지의 물과 물엿을 첨가하여, 145℃까지 온도를 올렸다. 불을 끄고, 향료와 타르타르산을 첨가하여 혼합하고, 75~80 ℃로 냉각시킨 후, 성형 롤러로 성형하여 쇠꼬리산말 추출물을 함유한 캔디를 제조하였다.

제제예 5. 음료의 제조

실시예 1의 쇠꼬리산말 추출물…………………… 100 mg

농축 과즙….………………………………………… 2 g

슈크로즈……………………………………………… 12 g

시트르산 나트륨…………………………………… 100 mg

향료…………………………………………………… 70 mg

물…………………………………………………… 적당량

통상적인 음료의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 적당량의 물에 혼합하고, 가열하여 용해시킨 후, 냉각시키고 용기에 충전하여 200 ml 용량의 음료 1병당 100 mg의 쇠꼬리산말 추출물을 포함하는 음료를 제조하였다.

도 1은 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물의 PGE₂ 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물의 iNOS 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물의 IL-1β 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 쇠꼬리 산말 추출물의 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.

Claims (11)

1. 쇠꼬리산말 건조물을 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 쇠꼬리산말 추출물은 질소산화물(NO) 생성 억제 효과 를 나타내는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 쇠꼬리산말 추출물은 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 쇠꼬리산말 추출물은 세포독성이 없는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 쇠꼬리산말 추출물은 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS) 발현 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 쇠꼬리산말 추출물은 인터루킨-1β(IL-1β) 발현 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
10. 제1항의 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
11. 제1항의 쇠꼬리산말 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 사료 조성물.

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