KR101172595B1

KR101172595B1 - 꽈리 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101172595B1
Application number: KR1020100049925A
Authority: KR
Inventors: 김형일; 심인섭; 김윤상
Original assignee: 김형일
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2012-08-08
Also published as: WO2011149301A2; WO2011149301A3; EP2575842A2; JP2013530159A; EP2575842A4; CN102971000A; US20130142889A1; KR20110130546A

Abstract

본 발명은 꽈리(Physalis alkekengi var. francheti (Masters) Hort) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 꽈리 추출물이 리포폴리싸카가이드(LPS) 처리 후 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), 코르티코스테론(corticosterone), COX-2, NO의 생성을 효과적으로 억제함을 확인함으로서, 상기 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품의 제공으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

꽈리 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the extract of Physalis alkekengi var. francheti (Masters) Hort as an active ingredient for preventing and treating inflammatory disease}

본 발명은 꽈리(Physalis alkekengi var. francheti (Masters) Hort)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] 生津養血湯加味方과 매괴화가 streptozotocin으로 유발된 고혈당 생쥐의 췌장에 미치는 영향 홍광표, 나창수, 장경선, 김희철, 박민희, 김정상, 대한한의학회지, 22(4), 79-89, 2001

[문헌 2] 수종의 한약 복합 추출물의 항균, 항염 및 항 알레르기 효과에 대한 실험적 연구, 김진만, 오한철, 오성필, 김남권, 황충연, 동의생이병리학회지, 20(1), 103-114, 2005

[문헌 3] 대한피부과학회 교과서 편찬위원회. 피부과학, 서울 pp 161-166, 461-464, 2001

[문헌 4] Matsuura T, Kawai M, Makashima R, Butsugan Y (1970). "Structures of physalin A and physalin B, 13,14-seco-16,24-cyclo-steroids from Physalis alkekengi var. Francheti". J. Chem . Soc . Perkin Trans . I 5: 66470.

[문헌 5] JanuAH, Filho ER, Pietro RC, Kashima S, Sato DN, FranSC (2002). "Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae)". Phytother Res 16 (5): 4458.

[문헌 6] Silva MT, Simas SM, Batista TG, Cardarelli P, Tomassini TC (2005). "Studies on antimicrobial activity, in vitro, of Physalis angulata L. (Solanaceae) fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination". Mem . Inst . Oswaldo Cruz 100 (7): 77982.

[문헌 7] Choudhary MI, Yousaf S, Ahmed S, Yasmeen K (2005). "Antileishmanial physalins from Physalis minima". Chem . Biodivers . 2 (9): 116473.

[문헌 8] Jacobo-Herrera et al, J. Nat . Prod ., 69, pp328-331, 2006

[문헌 9] Weller P et al., J. Agric . Food Chem ., 51, pp7044-7049, 2003

[문헌 10] Hwang HJ, Lee HJ, Kim CJ, Shim I, Hahm DH. Inhibitory effect of amygdalin on popolysaccharide-inducible TNF-alpha and IL-1beta mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis. J Microbiol Biotechnol . 2008;18(10):1641-7.

[문헌 11] Oh JK, Kim YS, Park HJ, Lim EM, Pyun KH, Shim I. Antidepressant effects of Soyo-san on Immobilization stress in ovariectomized female rats. Biol Pharm Bull . 2007;30(8):1422-6.

염증은 손상에 대한 살아있는 조직의 반응으로 염증 반응은 면역계를 동원 하는 생체의 방어와 치유에 핵심적인 역할을 하고 있을 뿐 아니라 많은 질병의 병리작용에 관련되어 있는 대단히 중요한 과정이다. 염증을 일으키는 원인을 무수히 많으나 세균, 진균, 바이러스와 같은 생물성 원인도 그 중 하나이다. 또한, 염증 반응 시, 면역세포인 마크로파지(macrophage)는 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β)나 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)류 또는 일산화질소(nitric oxide, NO)나 프로스타글란딘(prostaglandin, PG)등의 다른 염증 메디에이터(inflammatory mediator)를 생산함으로써 반응 진행과정에서 중요한 역할을 수행한다. 마크로파지(Macrophage)에 의한 이런 매개체의 생산은 많은 염증성 조직에서 발견된다. 예를 들어 생체가 세균 내독소(bacterial endotoxin)인 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 외부 면역 자극 물질에 노출되면 생체신호전달 경로를 거쳐 면역세포들이 활성화되며 동시에 이들 세포에 의한 염증 유발 인자들의 발현양이 증가하게 되는데, 이 과정의 첫 단계로 해당 인자의 mRNA 발현이 증가하게 된다. 또한, 증가된 IL-1β, TNF-α, iNOS, COX-2 등과 같은 사이토카인이나 생체 효소들은 염증(inflammation), 통증조절 (pain control), 세포사멸(apoptosis), 종양생성 (tumorigenesis), 자가면역반응(autoimmune response) 등의 약리학적 또는 생리학적 생체반응에서 중요한 역할을 수행 한다.

생체 조직의 손상에 대한 능동적인 생체 방어 과정으로 설명되는 염증반응은 생체의 세포나 조직이 어떤 원인에 의하여 손상을 받으면 이에 대한 반응을 시작하여 손상을 극소화시키고, 손상된 부위를 복구시키려는 일련의 생체과정을 일으키게 된다. 염증 반응 시, 면역세포인 마크로파지(macrophage)는 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β)나 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)류 또는 일산화질소(nitric oxide, NO)나 프로스타글란딘(prostaglandin, PG) 등의 다른 염증 메디에이터(inflammatory mediator)를 생산함으로써 반응 진행과정에서 중요한 역할을 수행한다. 마크로파지(Macrophage)에 의한 이런 매개체의 생산은 많은 염증성 조직에서 발견된다. 예를 들어 생체가 세균 내독소(bacterial endotoxin)인 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 외부 면역 자극 물질에 노출되면 생체신호전달 경로를 거쳐 면역세포들이 활성화되며 동시에 이들 세포에 의한 염증 유발 인자들의 발현양이 증가하게 되는데, 이 과정의 첫 단계로 해당 인자의 mRNA 발현이 증가하게 된다. 염증 매개 인자의 과생산은 류마티스성 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 만성 간염, 폐섬유화증 등과 같은 많은 염증성 질환에서 쉽게 발견되며 이들 질환의 병리현상에 대한 주요인이 된다. 따라서, 이러한 염증 유발 매개 인자에 대한 유전자 발현의 저해방법은 다양한 염증성 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 치료원리 및 방법이 될 수 있다. IL-1β, TNF-α, iNOS, COX-2 등과 같은 사이토카인이나 생체 효소들은 염증(inflammation), 통증조절 (pain control), 세포사멸(apoptosis), 종양생성 (tumorigenesis), 자가면역반응(autoimmune response) 등의 약리학적 또는 생리학적 생체반응에서 중요한 역할을 수행 한다.

목이 아프면서 열이 나는 질환 중에 가장 많은 경우는 급성 편도염인데, 편도염과같은 염증성 질환은 감염, 외상, 면역학적 반응을 포함한 인체 내의 반응이다. 발열, 홍조, 부종, 통증 등의 급성 염증 증후가 있으며, 염증과정의 후반에는 염증부위로의 백혈구의 이주 및 사이토카인(cytokine), degradative enzyme, bioactive lipid intermediate, transient reactive oxygen species, sensitized lmphocyte의 생성 등 세포내의 변화가 일어난다. 만성적인 염증질환에서는 백혈구의 침윤에 의해 세포 활성화 및 세포사멸이 일어난다. 염증반응의 화학매개물 중 프로스타글란딘(prostaglandins, PG)과 일산화질소(nitric oxide ,NO)는 발암 및 염증의 진행과정에 중요한 매개물질이다. 염증이나 통증을 조절하는 약물 중 가장 흔히 사용되는 약물인 nonsteroidal antiinflammatory drugs(NSAIDs)는 체내에 프로스타글란딘(prostaglandin)을 생성하는 COX를 저해함으로써 약리작용을 나타나는데 싸이클로옥시게나제(cyclooxygenase)는 COX-1과 COX-2의 두 가지 isoform으로 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이 중 COX-1은 정상상태에서 위장관 점막과 혈소판, 신장에서 세포 보호 작용과 조절 작용에 관여하는 PG류 생성에 관여하는 효소인데 반해, COX-2는 정상세포에서는 그 농도가 매우 낮으나 염증관련세포에서 여러 자극(cytokine, endotoxin, mitogen)에 의해 유도 발현되어 통증이나 염증에 관여하는 PG류 생성에 관여한다. 염증이나 통증을 조절하는 약물 중 NSAIDs는 인체 내에서 염증 반응에 관여하는 PG류 이외에 위점막 보호, 혈소판기능과 관련된 PG의 생성도 억제하여, 위장관 장해나 출혈 등의 부작용도 함께 나타나게 된다.

꽈리 (Physalis alkekengi var. francheti (Masters) Hort)는 우리나라 각지에 재배하는 다년생 초본으로 해발 600m 이하의 숲 가장자리에 자라는 다년초로서 높이 60~90 cm 정도이다. 지하에는 옆으로 기는 긴 근경이 있다. 잎은 호생하며 광난형으로 끝이 날카롭고 치아식의 거치가 있으며 절마다 2매씩 난다. 꽃은 엽액에서 나오며 흰색으로 1개씩 달리며 소화경은 길이 3~4cm이고, 꽃받침은 짧은 통형이며, 끝이 얕게 5개로 갈라지고 가장자리에 털이 있다. 과실은 구형의 액과로 적색으로 익는다. 생약으로는 전초를 사용하며 산장 (Physalis Herba), 등룡이라고도 한다. 성분으로는 전초에 피살린 A, B, C (physalin A, B, C), 사포닌 (saponin), 플라보노이드 (flavonoid), 알칼로이드 (alkaloid)가 있으며 열매에는 0.12% 카로티노이드 (carotenoid)인 붉은 색소, 아스코르빈산, 수지, 펙틴, 탄닌, 쓴맛물질, 카로틴, 알칼로이드, 퀘르쎄틴 (quercetin), 카페인산, 시나민산, 페룰라산 등이 있고 뿌리에는 3-알파-티글로옥시트로판, 피살린, 제아크산틴이 함유되어있고 씨에는 리놀레인을 주성분으로 하는 기름이 함유되어 있다.

하지만 꽈리의 항염증 작용에 대한 실험적 연구는 아직 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카가이드(LPS)를 처리한 후 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), 코르티코스테론(corticosterone), COX-2, NO에 미치는 꽈리 추출물의 억제 효과를 확인함으로써 항염증 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 꽈리 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 꽈리 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 꽈리 추출물의 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 사용이 가능하다.

본원에서 정의되는 염증성 질환은 염증성 고열, 편도염, 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 결막염, 아토피, 비염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식, 바람직하게는 염증성 고열, 염증, 편도염, 위염, 대장염, 관절염, 아토피, 보다 바람직하게는 염증성 고열, 또는 편도염을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 꽈리 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 꽈리를 세척 후, 음건하여 추출 1시간 내지 30시간, 바람직하게는 5시간 내지 25시간 전에 건조된 꽈리 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁내지 C₄의 저급알코올의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 물로, 약 0 내지 200℃, 바람직하게는 약 50℃ 내지 150℃에서 30분 내지 10시간, 바람직하게는 1시간 내지 5시간 동안 냉침 추출법, 열수추출, 환류 순환 추출, 또는 압력추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출법을 수행하여 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 꽈리추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 꽈리 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 꽈리 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

꽈리 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 꽈리 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 꽈리 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 꽈리 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 꽈리 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 선복화 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 꽈리 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 면역 반응에 의한 인터루킨인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), 코르티코스테론(corticosterone), COX-2, NO의 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.

도 1은 꽈리 추출물의 세포독성에 대한 효과를 나타내는 도이고,
도 2는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용한 염증반응에서 꽈리 추출물 처리 후 IL-1β 유전자 발현에 대한 효과를 나타내는 도이고,
도 3은 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용한 염증반응에서 꽈리 추출물 처리 후 TNF-α 유전자 발현에 대한 효과를 나타내는 도이고,
도 4는 유도성 나이트릭 옥사이드 신타아제 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 mRNA 레벨의 RT-PCR 분석을 나타낸 도이고,
도 5는 싸이클로옥시게나제 (cyclooxygenase-2, COX-2)의 mRNA 레벨의 RT-PCR 분석을 나타낸 도이고,
도 6은 쥐 모델에서 LPS-유도된 코르티코스테론에 미치는 작용을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 꽈리 추출물의 제조

(사)한국세포주은행(http://cellbank.snu.ac.kr/)에서 분양받은 꽈리 280g을 세척한 후 절단하여 추출 24시간 전 꽈리 추출물의 10배의 물에 꽈리를 담가 전 추출하였다. 24시간 후 약탕기(대웅제약)에서 90℃에서 약 2시간 동안 상기 추출 약물을 끓인 후 거즈로 깨끗하게 걸러 rotary evaporator (EYELA, Japan)를 이용해 중탕 농축 시켰다. 상기 농축된 추출물은 동결 건조기 (Ilshin, Korea) 에서 24시간 동안 동결 건조한 후에 꽈리 추출물(이하 “PA”라 명명 함) 23g(수율 8.2%)을 수득하였으며, 냉동고에 보관하며 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

참고예 1. 실험재료의 준비

세포 배양액인 RPMI-1640, Dulbecco's Modifide Eagle Medium(DMEM), 10% (v/v) fetal bovine serum(FBS), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycine) 등의 세포 배양용 시약들은 Welgene(LS202-02, S-001-04, LM001-01, Korea)에서 구입하였고 시약 Ezcytox는 Daeilab사(ez 3000, Korea)에서 구입하였다. Rotary evaporator는 (BUCHI, R-124, German)에서 구입하였고, 동결 건조기는 Iishin사(FDU-2200, Korea)에서 구입하였으며, TRIzol^TM은 GIBCO BRL사( MD, USA)에서, ELISA reader는 Anthos (Multiread 400, Austia)에서, 분광분석기(Spectrophotometer)는 GE healthcare Life sciences (Ultraspec 2100 pro, sweden)에서, Primeacript Rtase는 TaKaRa사(Shiga, Japan)에서, PTC-100 Programmable Thermal Controller^TM는MJ Research Waltham사(MA, USA)에, ImageMaster TotalLab^TM는 Amersham Biosceinces사(Piscataway, NJ)에서 구입하였다.

참고예 2. 세포 배양

쥐 대식세포 주(Mouse macrophage cell line)인 RAW264.7을 (사)한국세포주은행으로부터 분양받은 후, RAW264.7을 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS)과 페니실린(penicillin) 100U/ml와 스트렙토마이신(streptomycin) 100μg/ml의 항생제를 포함하는 High glucose DMEM 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, U.S.A.)를 사용하여 실험실에서 37℃, 5% CO₂ 공급조건을 갖춘 동물 세포 배양기 에서 배양하였다.

실험예 1. 꽈리 추출물(PA)의 세포독성 (MTT assay)

상기 실시예 1에서 수득한 PA의 세포독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 실시하였다 (Hwang HJ, Lee HJ, Kim CJ, Shim I, Hahm DH. Inhibitory effect of amygdalin on popolysaccharide-inducible TNF-alpha and IL-1beta mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis. J Microbiol Biotechnol. 2008;18(10):1641-7).

상기 참고예2를 통해 배양된 RAW 264.7 세포를 96 well에 10000 cells/well로 준비하여 24시간동안 안정화 시켰다. 24시간 후 FBS가 포함되지 않은 최소 배지에 4시간 동안 적응시키고 이후 각각의 0.1mg/ml 및 1mg/ml의 농도로 준비된 약물을 24시간 동안 처리하였다. 1μg/ml 농도로 LPS를 추가 첨가하여 24시간 배양 후 실험하였다. 24시간 배양한 후 MTT assay를 위해 Ezcytox (Daeilab, Korea) 시약을 각 well 당 10μl씩 첨가하였고, 1시간 더 배양하였다. 배양 종료 후, ELISA 판독기(reader)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

시험물질 투여 24시간 후 IL-1β에 대한 PA의 효과를 살펴본 결과, PA의 농도에 비례하여 그 성장이 약간씩 증가하는 경향성은 보였으나, 농도 간의 유의성은 나타나지 않았다(도 1 참조).

실험예 2. 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용한 염증반응에서의 염증발현 유전자에 대한 효과

상기 실시예 1에서 얻은 PA의 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용한 염증유발 사이토카인인 IL-1β 및 TNF-α에 대한 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Hwang HJ, Lee HJ, Kim CJ, Shim I, Hahm DH. Inhibitory effect of amygdalin on popolysaccharide-inducible TNF-alpha and IL-1beta mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis. J Microbiol Biotechnol. 2008;18(10):1641-7).

2-1. IL -1β발현억제효과

상기 참고예2를 통해 배양된 RAW 264.7세포를 well당 5×10⁶ 농도로 준비하여 24시간동안 안정화 시키고 24시간 후 FBS가 포함되지 않은 배지에 4시간 동안 안정화 시켰다. 이후 각각의 0.1mg/ml 및 1mg/ml의 농도로 준비된 약물(PA)을 24시간 동안 처리한 후 1μg/ml 농도로 LPS를 추가 첨가하여 24시간 배양 후 실험 하였다. Total RNA는 TRIzol^TM(GIBCO BRL, MD, USA)을 사용하여 추출하였고, 분광분석기(Spectrophotometer)로 260nm에서 정량한 후 -80℃에서 보관하였다. 1μg의 total RNA를 65℃에서 10분 동안 denaturation시킨 후, Primeacript Rtase 0.2ul (TaKaRa, Shiga, Japan)을 이용하여 최종 부피가 20μl인 반응 혼합액에서 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다. cDNA는 10X PCR buffer와 각 primer와 0.5 U Taq polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan)을 포함한 20 μl의 반응 혼합액에서 PTC-100 Programmable Thermal Controller^TM (MJ Research, Waltham, MA, USA)를 사용하여 증폭되었다. 각각의 primer는 Genbank에 기록된 염기서열을 토대로 적당한 부위를 선택하여 제작하였으며 각각의 염기서열 및 증폭 조건은 하기의 표 1과 같다. 증폭된 DNA는 1.2% agarose gel에서 전기영동 하여 확인하였다. gel 상의 band intensity는 ImageMaster TotalLab^TM (Amersham Biosceinces, Piscataway, NJ)을 이용하여 분석하였고 내부 표준물질로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다.

Primers used in PCR reactions
Name	Primer sequence	Product size (bp)	Annealing temperature (℃)	Cycle numbers
IL-1β	5'-tgcagagttccccaactggtacatc-3'	387	60	30
	5'-gtgctgcctaatgtccccttgaatc-3'
TNF-α	5'-cctgtagcccacgtcgtagc-3'	374	60	30
	5'-ttgacctcagcgctgagttg-3'
GAPDH	5'-atcccatcaccatcttccag-3'	579	60	30
	5'-cctgcttcaccaccttcttg-3'

RAW 264.7 세포에 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용하여 염증반응 유발 후 IL-1β 유전자 발현을 나타낸 결과, 배지만 넣어준 그룹에 비해 리포폴리싸카라이드(LPS)를 같이 넣어준 그룹에서는 IL-1β 유전자 발현이 유의하게 증가하였으나, PA을 0.1mg ~ 1mg/ml로 함께 처리한 경우에는 리포폴리싸카라이드(LPS) 처리군과 비교할 때, 약물의 농도가 증가함에 따라 통계적으로 유의한 감소를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

2-2. TNF -α 유전자 발현억제효과

상기 실험예 2-1에 개시된 방법을 응용하여 TNF-α 유전자 발현에 대한 효과를 실험하였다.

RAW 264.7 세포에 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용하여 염증반응 유발 후 TNF-α 유전자 발현을 나타낸 결과, 배지만 넣어준 그룹에 비해 리포폴리싸카라이드(LPS)를 같이 넣어준 그룹에서는 TNF-α 유전자 발현이 유의하게 증가하였으나, PA을 처리한 그룹과 리포폴리싸카라이드(LPS) 처리군과 통계적으로 유의한 차이는 확인할 수 없었다(도 3 참조).

2-3. iNOS 유전자 발현억제효과

상기 실험예 2-1에 개시된 방법을 응용하여 iNOS 유전자 발현에 대한 효과를 실험하였다.

RAW 264.7 세포에 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용하여 염증반응 유발 후 iNOS 유전자 발현을 나타낸 결과, 배지만 넣어준 그룹에 비해 리포폴리싸카라이드(LPS)를 같이 넣어준 그룹에서는 iNOS 유전자 발현이 유의하게 증가하였으나, PA을 0.1mg ~ 1mg/ml로 함께 처리한 경우에는 리포폴리싸카라이드(LPS) 처리군과 비교할 때, 약물의 농도가 증가함에 따라 통계적으로 유의한 감소를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

2-4. COX -2 효소 mRNA 유전자 발현억제효과

상기 실험예 2-1에 개시된 방법을 응용하여 COX-2 효소 mRNA 유전자 발현에 대한 효과를 실험하였다.

RAW 264.7 세포에 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용하여 염증반응 유발 후 COX-2 효소 mRNA 유전자 발현을 나타낸 결과, 배지만 넣어준 그룹에 비해 리포폴리싸카라이드(LPS)를 같이 넣어준 그룹에서는 COX-2 효소 mRNA 유전자 발현이 유의하게 증가하였으나, PA을 400mg/kg을 함께 처리한 경우에는 리포폴리싸카라이드(LPS) 처리군과 비교할 때, 통계적으로 유의한 감소를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

실험예 3. 쥐 모델에서 리포폴리싸카라이드 ( LPS )- induced corticosterone 에 미치는 작용

리포폴리싸카라이드(LPS)를 ICV후 채취한 혈액을 4℃의 온도의 원심분리기에서에서 4,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 50㎕의 혈장을 얻은 다음 test tube에 옮기고 5㎖의 메틸렌 클로라이드(Methylene Chloride)를 가하여 혼합 시킨 후 10분간 실온에 방치한 다음 다른 tube에 옮긴다. 형광 시약(Fluorescent reagent) 2.5㎖을 넣고 vortexing하여 섞는다. 30분 후 2,000rpm으로 5분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 하층액을 취하여 exitation:475nm, emission:530nm 파장의 Spectroflorometer로 측정하였다. 측정된 값은 농도별로 작성된 표준 곡선과 비교하여 정량하였으며 형광 시약(fluorescence reagent)은 황산(sulfuric acid)와 에탄올(ethanol)을 7 : 3의 비율로 섞어서 사용하였다 (Oh JK, Kim YS, Park HJ, Lim EM, Pyun KH, Shim I. Antidepressant effects of Soyo-san on Immobilization stress in ovariectomized female rats. Biol Pharm Bull . 2007;30(8):1422-6).

그 결과, 코르티코스테론(corticosterone)에 대한 황금(SB)과 PA의 효과를 살펴보면, 리포폴리싸카라이드(LPS)와 함께 SB, PA를 400mg/kg으로 처리한 경우 리포폴리싸카라이드(LPS) 처리한 군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 6 참조).

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

PA 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

PA 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

PA 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

PA 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

PA 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

PA 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

PA 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

한국산 꽈리(Physalis alkekengi var. francheti (Masters) Hort) 과실을 세척 후, 음건하여 추출 5시간 내지 25시간 전에 건조된 꽈리 건조중량의 5 내지 15배에 달하는 부피의 물로, 50℃ 내지 150℃에서 30분 내지 10시간 동안 열수 추출법을 수행하여 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 수득한 한국산 꽈리 과실 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 고열, 또는 편도염의 예방 및 치료용 약학조성물.
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한국산 꽈리(Physalis alkekengi var. francheti (Masters) Hort) 과실을 세척 후, 음건하여 추출 5시간 내지 25시간 전에 건조된 꽈리 건조중량의 5 내지 15배에 달하는 부피의 물로, 50℃ 내지 150℃에서 30분 내지 10시간 동안 열수 추출법을 수행하여 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 수득한 한국산 꽈리 과실 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 고열, 또는 편도염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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