KR101606266B1 - 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents
피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피트모스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피트모스 추출물은 세포독성이 없고 염증반응과 관련하여 산화질소 생성을 억제하는 효과가 있으며, LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB 염증 단백질의 발현을 현저하게 저해시켜 우수한 염증 반응 억제 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 각종 염증 질환의 치료 및 예방에 유용한 치료제 및 염증을 개선할 수 있는 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 피트모스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민, 세로토닌, 브래디키닌, 프로스타글라딘, 류코트리엔과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 NO(Nitric Oxide)와 사이토카인을 생산하여 감염초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다. 내독소로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포외막에 존재하며, RAW 264.7과 같은 마크로파지(macrophage) 또는 단핵구(monocyte)에서 TNF-α, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β)와 같은 염증성 사이토카인들을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산이 프로스타글라딘으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다. 체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 프로스타글라딘E2(PGE2) 등의 염증인자가 iNOS 및 COX-2에 의해 형성된다. 이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 과잉 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. PGE2는 염증반응, 면역반응, 그리고 혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 기전의 작용으로 현재까지 항염증 약물의 사용으로 인해 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용되기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭게 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련 지어 최근에는 민간에서 사용되는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 상기와 같은 부작용에 대한 우려가 없으면서도 염증 작용의 효과적인 억제 효능을 가진 신규물질을 찾기 위하여 다양한 천연물을 대상으로 하여 연구를 수행하였다.
이에 본 발명자들은 피트모스 추출물이 우수한 항염증 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 염증 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 피트모스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 피트모스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 효과를 위한 건강기능성식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피트모스(peat moss) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 피트모스(peat moss) 추출물은 상기 조성물에 10~200ug/ml의 양으로 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 산화질소(NO) 생성 억제활성이 있을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB의 발현을 억제하는 활성이 있을 수 있다.
나아가 본 발명은 피트모스(peat moss) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 개선 및 예방용 건강기능성식품을 제공한다.
본 발명에 따른 피트모스 추출물은 세포독성이 없고 염증반응과 관련하여 산화질소 생성을 억제하는 효과가 있으며, LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB 염증 단백질의 발현을 현저하게 저해시켜 우수한 염증 반응 억제 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 각종 염증 질환의 치료 및 예방에 유용한 치료제 및 염증을 개선할 수 있는 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 RAW264.7 세포를 대상으로 피트모스의 세포독성 여부를 측정한 결과를 나타낸 결과이다.
도 2는 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의해 유도된 NO의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 3은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의해 유도된 PGE2의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의해 유도된 COX-2 및 iNOS의 mRNA 및 단백질의 발현 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 IL-1β의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 TNF-α의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA의 발현 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 NF-kB의 활성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 2는 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의해 유도된 NO의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 3은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의해 유도된 PGE2의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의해 유도된 COX-2 및 iNOS의 mRNA 및 단백질의 발현 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 IL-1β의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 TNF-α의 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA의 발현 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW264.7 세포에서 피트모스의 LPS에 의하여 유도된 NF-kB의 활성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
본 발명은 피트모스(peat moss) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
‘피트모스(peat moss)’는 한랭한 늪지대에서 물이끼나 수초 등의 유체가 퇴적되어 분해된 것으로 오랫동안 물 속의 지층 속에서 있으면서 공기가 차단되어 완전히 썩지 못하고 부분적으로 만들어진 물질이다. 피트모스에는 흡수성이 있는 섬유질이 존재하여 보수성을 향상시킬 뿐만 아니라 병충해가 없고, 보비력이 좋아 현재는 흔히 원예용 배지로 육모, 양액재배, 포트재배 등에 사용되고 있다.
한편 본 발명자들은 염증 작용의 효과적인 억제 효능을 가진 신규물질을 찾기 위하여 다양한 천연물을 대상으로 하여 연구를 수행하던 중 피트모스가 염증반응과 관련하여 산화질소 생성을 억제하고, LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB 염증 단백질의 발현을 확연히 저해시킨다는 사실을 확인함으로써, 피트모스 추출물을 염증 치료제로 사용할 수 있다는 사실을 처음으로 규명하였다.
이러한 사실을 입증하기 위해 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 즉, 피트모스 추출물을 농도별로 LPS로 염증 반응을 유발시킨 세포를 대상으로 산화질소 억제 효과를 분석한 결과, 50 μg/ml 처리 농도까지 피트모스는 별다른 세포독성을 보이지 않았으며, 오히려 H2O2 처리에 의한 산화적 손상에 의한 세포독성의 보호효과가 있음을 알 수 있었다(도 1 참조).
다른 일실시예에 의하면, LPS 처리에 의한 염증성 반응 유도 표식자로 대표적인 염증성 매개인자인 산화질소 (NO) 생성에 미치는 피트모스의 영향을 확인한 결과, LPS 단독 처리군의 경우 대조군에 비하여 약 6배 이상의 NO가 생성되었으며, 피트모스 단독 처리군에서는 큰 변화가 없었다. 그러나 LPS에 의한 NO의 생성은 피트모스 선처리에 의하여 거의 완벽하게 억제되었다(도 2 참조).
또한, 다른 일실시예에 의하면, 염증 유발 시 발현이 증가되는 것으로 알려진 염증인자인 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB의 단백질 발현에 피트모스의 추출물이 미치는 영향을 분석한 결과, 50 μg/ml의 피트모스를 처리한 군에서 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB 염증 단백질 발현을 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(도 3 내지 8 참조).
이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 본 발명에 따른 피트모스 추출물이 여러 염증유발 인자들의 발현 및 활성을 억제하는 기작을 통해 염증으로 유발되는 질환들을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 피트모스(peat moss) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 피트모스(peat moss) 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 추출 및 정제될 수 있는데, 본 발명에 따른 피트모스 추출물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 피트모스 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
한편, 본 발명에서 상기 염증 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 위염, 대장염, 관절염, 신장염 및 간염을 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 피트모스 추출물을 10~200ug/ml로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 50ug/ml로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항염증 조성물은 약학적으로 유효한 양의 피트모스 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 피트모스 추출물의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 염증질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 항염증 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항염증 조성물은 염증질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 피트모스 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명에 따른 항염 활성을 가지는 피트모스 추출물은 세포에 대해 독성을 유발시키지 않는 특징이 있고(도 1 참조), 또한 천연물인 피트모스를 사용함을 특징으로 하고 있어, 체내의 독성 및 부작용 염려 없이 안심하고 사용할 수 있다.
따라서 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 상기 조성물은 염증질환의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 항염증 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 상기 염증질환의 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 항염증 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 피트모스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
피트모스의 세포 독성 여부 측정
본 발명자들은 피트모스(peat moss)에 세포독성이 있는지 여부를 확인하기 위하여 MTT assay법을 이용하였다.
이를 위하여 RAW264.7 마우스 마크로파지를 이용하였으며, 500 ng/ml의 lipopolysaccharide(LPS)를 단독으로 24 시간 동안 처리한 군, 다양한 농도의 피트모스 처리군 및 LPS 처리 1시간 전에 50 μg/ml를 처리한 후 LPS를 처리한 군으로 나누어 준비하였으며, 대조군으로 H2O2 단독 또는 피트모스와의 복합 처리군을 포함시켰다. 24시간 후 배지를 제거하고 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, 1 mg/mL) 시약을 3시간 동안 처리한 후 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 590 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 피트모스의 50 μg/ml 처리 농도까지 세포증식 억제 효과는 관찰되지 않았으며, LPS 단독 또는 피트모스와의 복합 처리군에서도 유의적인 증식억제 현상이 관찰되지 않았다. 그러나 대조군인 H2O2 단독 처리군의 경우 60% 이상의 증식억제 효과를 보였다. 그러나 이러한 증식억제는 피트모스의 50 μg/ml 처리를 동시에 하였을 경우 정상 수준으로 회복되었음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
즉 본 실험에서 설정한 조건 내에서 피트모스는 별다른 세포독성을 보이지 않았으며, 오히려 H2O2 처리에 의한 산화적 손상에 의한 세포독성의 보호효과가 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2>
산화질소(NO)의 생성에 미치는 피트모스의 영향
본 발명자들은 피트모스 추출물에 항염증 효능이 있는지 유무를 조사하기 위하여 LPS 처리에 의한 염증성 반응 유도 표식자로 대표적인 염증성 매개인자인 nitric oxide (NO)의 생성에 미치는 피트모스의 영향을 조사하였다.
이를 위하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 NO2 -의 형태로 존재하는 NO의 양을 그리스시약(Griess reagent)을 사용하여 측정하였다. 즉 96웰 플레이트에 세포 배양 상등액 50 와 그리스시약(1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride, 2.5% H3PO4) 50 를 혼합하여 넣고 15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS 처리군의 경우 60의 산화질소가 생성되어 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 6배 이상의 산화질소(NO)가 생성되었다. 그러나, 피트모스를 25㎍/ml의 농도로 처리한 군에서는 40의 산화질소가 생성되었으며, 피트모스를 50㎍/ml의 농도로 처리한 군에서는 약 18의 산화질소가 생성되어 LPS를 처리하지 않은 군과 비교하였을 때와 비슷한 수준의 산화질소가 생성되었음을 알 수 있었다. 또한, 피트모스를 75㎍/ml의 농도로 처리한 군에서는 약 35의 산화질소가 생성되어 LPS에 의한 NO의 생성은 피트모스를 50㎍/ml의 농도로 처리한 군에서 가장 많이 억제되었음을 알 수 있었다(도 2 참조). 즉, 피트모스는 LPS에 의한 염증 매개인자인 NO의 생성을 현저하게 줄여주는 효과가 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
PGE
2
의 생성에 미치는 피트모스의 영향
또한, 본 발명자들은 피트모스에 의한 또 다른 주요한 염증 매개인자인 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성 억제 여부를 조사하였다. 이를 위하여 PGE2 생성 양의 변화 측정을 위한 PGE2 EIA kit는 Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, PGE2의 양을 측정하기 위하여 정상 및 다양한 농도의 피트모스를 선 처리 후 LPS (500 ng/ml)를 처리한 RAW 264.7 세포에서 24시간 동안 배양시킨 다음 상층액만 이용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음 ELISA 리더기를 이용하여 420 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.
그 결과, LPS 처리군의 경우 약 3700의 PGE2가 생성되어 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 8배 이상의 PGE2가 생성되었다. 그러나, 피트모스를 25㎍/ml의 농도로 처리한 군에서는 약 2600의 PGE2가 생성되었으며, 피트모스를 50㎍/ml의 농도로 처리한 군에서는 약 1050의 PGE2가 생성되어 LPS를 처리하지 않은 군과 비교하였을 때와 비슷한 수준으로 회복되었음을 알 수 있었다. 또한, 피트모스를 75㎍/ml의 농도로 처리한 군에서는 약 1900의 PGE2가 생성되어 LPS에 의한 PGE2의 생성은 피트모스를 50㎍/ml의 농도로 처리한 군에서 가장 많이 억제되었음을 알 수 있었다(도 3 참조).
즉 피트모스는 LPS에 의한 염증 매개인자인 PGE2의 생성을 현저하게 줄여주는 효과가 있었음을 알 수 있었다.
<
실시예
4>
COX
-2 및
iNOS
의 발현에 미치는
피트모스의
영향
또한, 본 발명자들은 상기 실시예 2 및 3에서 관찰된 피트모스의 LPS에 의한 과다한 NO 및 PGE2 생성 억제 효과가 이들 매개인자들의 조절인자들의 발현에 미치는 영향 변화에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여 NO와 PGE2 생성에 직접 관여하는 2가지 주요 유전자인 inducible NO synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현을 전사 및 번역 수준에서 확인하였다.
<4-1> 전사수준에 미치는 영향의 분석
상기 실시예 2 및 3과 동일한 조건에서 배양된 세포를 모아서 TRIzol 시약 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)에 라이시스(lysis) 시켜 total RNA를 분리하고, 정량을 통해 동량의 RNA를 준비한 후 COX-2 및 iNOS와 인터널 컨트롤(internal control)로 사용된 glyceraldhyde-3-phos-phate dehydrogenase (GAPDH)의 프라이머, DEPC water, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 각각 혼합하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 증폭시켰다. 그 후 1% 아가로즈 겔에 에티디움 브로마이드(EtBr)를 첨가하여 굳힌 다음, 각 샘플을 동량 로딩하여 100 V 에서 전기영동시킨 후 , UV 하에서 mRNA 발현의 차이를 비교하였다.
<4-2> 번역수준에 미치는 영향의 분석
상기 실시예 2 및 3과 동일한 조건에서 준비된 세포들을 모아서 라이시스 버퍼 [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM pheny-methylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]에 1 시간 동안 용해(lysis) 시켰다. Bio-rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법에 따라 정량 후, Laemmli sample buffer (Bio-rad)를 동량으로 섞어 SDS-폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)에 로딩(loading)한 후 90 V로 전기영동으로 분리하고, 일렉트로블로팅(electroblotting)을 통해 니트로섬유소막(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 옮긴 다음, 5% 탈지유(skim milk)로 1 시간 동안 블로킹(blocking)하고 4 ℃에서 1 차 항체를 붙여 1 시간 이상 반응시켰다. 그 후 PBS-T로 세척하고 상온에서 1 시간 동안 2 차 항체를 붙인 후 다시 PBS-T 로 세척하고 암실에서 Enhanced Chemilunimoecence (ECL)용액 (Amersham Life Science Corp.)에 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켰다.
그 결과, LPS 단독 처리군에서는 조사된 두 유전자의 발현이 전사 및 번역 수준에서 매우 증가되었으나, 피트모스 단독 처리군에서는 큰 변화가 없었다. 그러나 피트모스의 전처리군에서는 LPS에 의한 두 유전자의 mRNA 및 단백질의 발현 증가가 관찰되지 않았으며, 이는 피트모스에 의하여 두 유전자의 발현이 전사 수준에서 억제되었음을 의미한다. 아울러 실시예 2 및 3에 나타낸 피트모스의 염증성 매개인자인 NO 및 PGE2 생성 억제 효과는 이들의 생성을 조절하는 iNOS 및 COX-2의 발현 억제에 의한 것이었음을 알 수 있었다(도 4 참조).
<
실시예
5>
염증성 사이토카인의 생성에 미치는
피트모스의
영향
본 발명자들은 피트모스에 의한 염증성 사이토카인의 억제 여부를 조사하기 위하여 대표적인 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-1β (IL-1β)의 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
이를 위하여 동일 조건에서 세포를 배양한 후, 각 웰(well)에서 상층액을 회수하였다. 상층액 내 TNF-α와 IL-1β의 양은 각각 R&D System Inc (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 Fluorokine MAP Mouse IL-1β kit와 Fluorokine MAP Mouse TNF-α kit를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리 한 다음, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군의 경우 대조군에 비하여 약 8배 이상의 IL-1β 생성을 보여 주었으나, 피트모스의 선처리군에서는 이러한 IL-1β의 생성량이 현저하게 감소되었으며, 이러한 효과는 피트모스를 50㎍/ml의 농도로 처리한 군에서 IL-1β의 생성량이 가장 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다.
또한 LPS에 의한 TNF-α의 생성량도 피트모스 처리에 의하여 유의적으로 감소되어 염증성 사이토카인의 생성이 피트모스에 의하여 현저하게 억제되었음을 알 수 있었다(도 5 및 6 참조).
또한, 본 발명자들은 상기에서 관찰된 피트모스의 LPS에 의한 과다한 IL-1β 및 TNF-α의 생성 억제 효과가 이들 사이토카인의 조절 유전자들의 발현에 미치는 영향 변화에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여 IL-1β 및 TNF-α 두 유전자의 발현 변화를 상기에서 제시한 RT-PCR의 방법으로 조사하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군에서는 조사된 두 유전자의 발현이 전사에서 매우 증가되었으나, 피트모스 단독 처리군에서는 큰 변화가 없었다. 그러나 피트모스의 전처리군에서는 LPS에 의한 두 유전자의 mRNA 발현이 현저하게 억제되어, 피트모스에 의하여 IL-1β 및 TNF-α 유전자의 발현이 전사 수준에서 억제되었음을 알 수 있었다(도 7 참조).
<
실시예
5>
NF
-
kB
의 활성에 미치는
피트모스의
영향
피트모스에 의한 염증성 매개 인자 및 사이토카인의 생성 억제에 연관된 iNOS, COX-2와 IL-1β, TNF-α를 전사 수준에서 조절하는 대표적인 전사조절인자인 nuclear factorkappaB (NF-kB)의 활성에 미치는 영향을 조사하였으며, 이를 위하여 NF-kB의 핵 내로의 이동성 변화 여부를 세포질과 핵에서 분리된 단백질과 면역형광법에 의한 관찰로서 확인하였다.
배양된 세포를 PBS로 세번 수세하고, ice-cold hypotonic buffer(10 mM HEPES/KOH, 2 mM MgCl2 0.1 mM EDTA, 10 mM KCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, pH7.9)로 10 분간 반응시키고 15,000 × g에서 30 초간 원심 분리하여 세포핵 침전물을 얻어내었다. 침전물에 ice-cold saline buffer (50 mM HEPES/KOH, 50 mM KCl, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, pH7.9)를 가하여 20 분간 반응시킨 후 15,000 × g에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 핵단백질(nuclear extract)로 사용하였다.
그 결과, LPS를 단독으로 처리한 경우 LPS 처리 15분 이내에 NF-κB의 발현이 핵 단백질에서 매우 강하게 검출되었으며, 30분에는 더욱 증가되었다. 이와는 반대로 세포질에서 NF-κB의 저해 인자로 작용하는 IkappaB-α (IkB-α)의 발현이 세포질에서 상대적으로 매우 감소함을 알 수 있었다. 그러나 LPS에 의한 핵 내의 NF-κB 축척은 피트모스에 의하여 매우 강하게 억제되었으며, 이는 세포질에서의 IkB-α의 발현 증가와 연관성이 있음을 알 수 있었다(도 8A 참조).
NF-κB의 p65가 핵으로 이동되는 것을 면역현광염색법을 통해서 확인하기 위하여 준비된 세포를 모은 다음 37% 포름알데히드(formaldehyde) 용액과 PBS를 1：9 의 비율로 섞은 정착액(fixing solution)을 모아진 세포에 500μl 첨가하여 잘 섞어준 후, 실온에서 10분 동안 고정하였다. 1,000 rpm으로 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하고 PBS 200μl를 넣어서 충분히 섞은 후, 슬라이드 글라스(slide glass) 위에 80 μl 정도 떨어뜨려 900 rpm에서 5분간 시토스핀(cytospin)하였다. PBS로 2∼3회 워싱(washing)하고 PBS가 다 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100을 첨가하여 실온에서 10분간 고정하였다. 그 후 다시 PBS로 워싱(washing)하고 4’,6-diamidino-2-pheny-lindole (DAPI, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액을 세포가 고정된 슬라이드글라스 위에 적당량을 떨어뜨린 후 빛을 차단 하고 실온에서 염색시켰다. 15분 가량 염색시킨 후, PBS로 충분하게 세척하고 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 관찰하였다.
그 결과, LPS를 단독으로 처리한 경우 NF-κB의 세포 내 위치가 핵 내에서 검출되었음을 DAPI 염색에 의한 핵 염색과의 상호 비교에서 확인할 수 있었다. 그러나 정상 조건에서 배양된 세포의 경우 NF-κB는 세포질 쪽에서의 분포도가 강하게 나타났다. 이러한 LPS 처리에 의한 NF-κB의 핵 내 이동이 피트모스 전처리군에서는 현저하게 감소되어 웨스턴 블롯 분석 결과와 매우 일치됨을 알 수 있었다(도 8B 참조). 이러한 피트모스에 의한 NF-κB의 핵 내 이동 차단은 아마도 피트모스에 의한 염증성 매개 인자 및 사이토카인(cytokine)의 발현 억제를 유도하였을 것으로 추정된다.
따라서 피트모스에 의한 염증성 반응의 억제는 NF-κB 활성 억제를 통하여 이루어졌음을 알 수 있으며, 피트모스를 항염증의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (5)
- 피트모스(peat moss) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
피트모스(peat moss) 추출물은 상기 조성물에 10~200ug/ml의 양으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 추출물은 산화질소(NO) 생성 억제활성이 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 추출물은 PGE2, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 및 NF-kB의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물. - 피트모스(peat moss) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증의 개선 및 예방용 건강기능성 식품.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140072649A KR101606266B1 (ko) | 2014-06-16 | 2014-06-16 | 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140072649A KR101606266B1 (ko) | 2014-06-16 | 2014-06-16 | 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 |
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ID=55084115
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| KR1020140072649A KR101606266B1 (ko) | 2014-06-16 | 2014-06-16 | 피트모스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101093015B1 (ko) | 2008-11-18 | 2011-12-16 | 대한민국 | 솔이끼 추출물 또는 분획물을 포함하는 항염 또는 항암 조성물 |
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-
2014
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Non-Patent Citations (2)
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| 논문1: Solid Fuel Chemistry(2008) |
| 논문2: KSBB Journal(2011) |
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| KR20150144044A (ko) | 2015-12-24 |
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