JP6398014B2

JP6398014B2 - ラマリンを含有する退行性脳疾患の予防または治療用組成物

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Publication number: JP6398014B2
Application number: JP2017540950A
Authority: JP
Inventors: ジョンハンイム; イルチャンキム; セジョンハン; ドンギュチョ
Original assignee: Korea Institute of Ocean Science and Technology KIOST
Current assignee: Korea Institute of Ocean Science and Technology KIOST
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2018-09-26
Anticipated expiration: 2034-10-24
Also published as: EP3210602B1; EP3210602A4; US20170304244A1; US9968576B2; JP2017533261A; CN107205973A; WO2016064009A1; EP3210602A1; CN113456623A

Description

本発明は、ラマリン（Ｒａｍａｌｉｎ）の新しい用途である退行性脳疾患治療用途に関し、より詳細にはインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）およびＢＡＣＥ１の発現抑制活性を有するラマリンを含有する退行性脳疾患の予防または治療用組成物に関する。

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）は、痴呆を引き起こす最も一般的な退行性脳疾患であり、進行型神経退行性疾患症状でニューロン損失および認知障害がある（Ｄｏｎｅｖｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＭｏｌＭｅｄ，１３：４３２９−４８，２００９）。アルツハイマー病は、細胞外アミロイド−ベータ（ａｍｙｌｏｉｄ−β：Ａβ）プラークおよび細胞内神経線維もつれの神経病理学的特徴を示す（Ｑｕｅｒｆｕｒｔｈｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．３６２（４）：３２９−４４；ＬａＦｅｒｌａｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ．３８（４）：９９３−５）。アミロイド−ベータは、ＢＡＣＥ１（Ｂｅｔａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ１）およびプレセニリン／ガンマ−セクレターゼ（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ／γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）により媒介される、アミロイド−ベータ前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ−β ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）の連続分裂によって生成される。アミロイド−ベータの生成および凝集は、神経退化、神経線維のもつれ現象、炎症およびニューロンの損失を引き起こす複雑な病理学的誘発を触発させる重要な役割をする。

神経炎症を示す微細神経膠細胞の活性化は、アルツハイマー病患者脳におけるさらに他の病理学的特性である（ＭｃＧｅｅｒｅｔａｌ．，ＮｅｕｒｏｓｃｉＬｅｔｔ，７９：１９５−２００，１９８７）。また、微細神経膠細胞は、ＡＤ、ＰＤ（パーキンソン病：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）、痴呆および多発性硬化症のような慢性神経変成疾患を含んで多くのＣＮＳ（中枢神経系：ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ）疾患で潜在的な発病原の役割をする（Ｂｌｏｃｋｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ，８：５７−６９，２００７）。活性化した神経膠細胞および白血球は、アナフィラトキシン補体（ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）およびプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）を含む様々な炎症性媒介物質を産生する（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍｅｔａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ４０（５）：１８４９−５７，２００９；Ｉａｄｅｃｏｌａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１４（１１）：１３６３−１３６８，２０１１）。

末梢組織におけるインフラマソーム複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｃｏｍｐｌｅｘ）に対する研究は、炎症性サイトカインの産生および分泌、ａｐｏｐｔｏｔｉｃおよびｐｙｒｏｐｔｏｔｉｃ細胞死滅に関するものである（Ｌａｍｋａｎｆｉｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ．２８：１３７−６１）。ＮＬＲＰ１（ＮＡＣＨＴ，ＬＲＲａｎｄＰＹＤｄｏｍａｉｎｓ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１）およびＮＬＲＰ３（ＮＡＣＨＴ，ＬＲＲａｎｄＰＹＤｄｏｍａｉｎｓ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３）インフラマソームは、ＮＬＲＰ１／３受容体、ＡＳＣ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｃａｓｐａｓｅｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｄｏｍａｉｎ）、前駆体カスパーゼ−１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）、前駆体カスパーゼ−１１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１１）（ヒトの前駆体カスパーゼ−４または５と相同）およびＸＩＡＰ（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ）で構成された細胞質の高分子複合体である（Ｂｏｙｄｅｎｅｔａｌ．，ＮａｔＧｅｎｅｔ３８（２）：２４０−４，２００６；Ｍａｒｔｉｎｏｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌ１０（２）：４１７−２６，２００２）。ＮＬＲＰ１およびＮＬＲＰ３受容体の活性化およびホモ−オリゴマー化によって前駆体カスパーゼ−１が自動活性化して切断カスパーゼ−１に転換されて、ＮＬＲＰ１およびＮＬＲＰ３インフラマソームを形成する（Ｌａｍｋａｎｆｉｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ．２８：１３７−６１；Ｍａｒｔｉｎｏｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌ１０（２）：４１７−２６，２００２）。Ａβの慢性蓄積は、アルツハイマー病で微細神経膠細胞の活性化を促進する（Ｇｏｌｄｍａｎｎｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｓ．２３：５９５−６）。ＩＬ−１β水準の増加は、Ａβの蓄積と関連があって（Ｌｕｃｉｎｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，６４：１１０−２２，２００９）、ＩＬ−１βは、カスパーゼ−１の活性化および分泌のために非活性プロ−形態で産生されて、カスパーゼ−１活性は、インフラマソームによって調節される。ＮＬＲＰ３インフラマソームはＡβのような炎症性結晶および凝集タンパク質を感知して、慢性炎症疾患と関連がある（Ｈａｌｌｅｅｔａｌ．，ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ９（８）８５７−６５，２００８；Ｍａｒｔｉｎｏｎｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２７：２２９−６５，２００９；Ｈｅｎｅｋａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４９３（７４３４）：６７４−８）。ＮＬＲＰインフラマソームの活性化によって誘導された炎症性物質は、シナプス機能障害、認知障害および微細神経膠細胞の機能制限などを媒介する役割をする。Ａβ−媒介炎症性反応で主な役割をするＮＬＲＰインフラマソームおよびインフラマソーム−由来サイトカインの活性化を抑制する治療を介してアルツハイマー病の進行を効果的に妨害することができる。

ラマリンは、ヒト角質細胞および線維芽細胞で細胞毒性がほとんど現れない濃度で坑酸化効果を示して（Ｐａｕｄｅｌｅｔａｌ．，Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．１８（１４）：１２８５−９０）、炎症反応を抑制する抗酸化剤として知られている。

本発明者等は、以前の研究で南極キングジョージ島に自生する地衣類であるラマリナ・テレブラタ（Ｒａｍａｌｉｎａｔｅｒｅｂｒａｔａ）から新規化合物であるラマリンを分離して（ＫＲ１０−１０２５６１２）、ラマリンの合成方法を提供した（ＫＲ１０−１１８２３３４）。また、前記分離および合成したラマリンの炎症または免疫疾患予防または治療効果（ＫＲ１０−１２９０７４５）および肝線維化および肝硬変の予防または治療効果（ＫＲ１０−１３２６２５６）を明らかにした。しかし、ラマリンの退行性脳疾患関連予防または治療効果についてはまだ知られていない。

そこで、本発明者等は、アルツハイマー病およびアルツハイマー病類似疾患治療のための効果的な戦略を開発しようと鋭意努力した結果、ラマリンがＢＡＣＥ１発現およびＮＬＲＰインフラマソームタンパク質のような炎症性マーカーの発現を抑制することによって、アミロイド生成を阻害して、アルツハイマー病モデルマウスで認知機能を顕著に向上させることを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は、ラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物を提供するところにある。
本発明の他の目的は、ラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、下記式Ｉで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。

本発明はまた、前記式Ｉで表示されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

（Ａ）ラマリンの化学構造に対する模式図および（Ｂ）ラマリン処理後行動機能検査のための動物実験計画の模式図である。アルツハイマー病動物モデルであるＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウスを対象にラマリン投与による学習および記憶障害予防効果を示した結果である。（Ａ）ラマリンが４週間投与された実験群では、水面下のプラットホームを対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて速く探して行く；（Ｂ）水迷路試験開始後、６日目に実行されたプローブテスト結果、ラマリンは痴呆動物モデルの記憶維持能の改善効果を示す；（Ｃ）実験動物群の水泳速度を測定した結果、実験群間の差がない；（Ｄ）空間記憶能力を評価するために、Ｙ−ｍａｚｅｔｅｓｔを実施した結果、ラマリン（２０ｍｇ／ｋｇ）が４週間投与された実験群で変更行動力が大きく増加する。アルツハイマー病動物モデルであるＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウスでラマリン投与後、神経班（ｎｅｕｒｉｔｉｃｐｌａｑｕｅ）形成およびＡβ生成が顕著に減少することを示す結果である。（Ａ）皮質と海馬でＡβ染色程度がラマリン投与動物で減少したことを顕微鏡写真で観察する；（Ｂ）皮質と海馬共にラマリン投与によってＡβ老人班の数字も減少したことをイメージ分析定量で確認する；（Ｃ）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用した水溶性Ａβ測定結果、ラマリン投与群でＡβ４０とＡβ４２共に減少したことを確認する。ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウスでＢＡＣＥ１レベル抑制を確認した結果で、ラマリンが脳内ＢＡＣＥ１のトランスクリプトームおよびタンパク質の量を減少させる効能があって、これによって痴呆原因物質であるＡβの産性が減少することを意味する結果である。（Ａ）ラマリン投与後動物の皮質でＡβを産生する酵素であるＢＡＣＥ１に特異的な抗体を利用した免疫化学染色法を介してＢＡＣＥ１の発現がラマリン投与によって減っていることを確認する；（Ｂ）ラマリン投与後、動物の海馬でＡβを産生する酵素であるＢＡＣＥ１に特異的な抗体を利用した免疫化学染色法を介してＢＡＣＥ１の発現がラマリン投与によって減少することを確認する；（Ｃ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってタンパク質の量を測定した時ラマリン投与動物の脳組織でＢＡＣＥ１とＡβ前駆体でありながらＢＡＣＥ１の基質であるＣ９９も減少したことを確認する；（Ｄ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってタンパク質の量を測定を統計処理した値を示したものと；（Ｅ）ラマリン投与によって痴呆動物の脳組織でＢＡＣＥ１のトランスクリプトーム（ｍＲＮＡ）発現が減少したことを確認する。ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウス脳のｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２発現抑制効果を確認した結果である。（Ａ）ラマリン投与によって痴呆動物の脳組織でｉＮＯＳとＣＯＸ−２のタンパク質量が減少したことを確認する；（Ｂ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってタンパク質の量の測定を統計処理した値である。ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウス脳でのＭＡＰＫ信号伝達経路タンパク質に対する影響を確認した結果である。（Ａ）痴呆動物の脳組織でリン酸化されたストレスキナーゼ（ｐ３８、ＪＮＫおよびＥＲＫ）の量がラマリン投与によって大きく減少する；（Ｂ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってｐ３８、ＪＮＫおよびＥＲＫタンパク質の量を測定を統計処理した値である。ラマリン投与後、アルツハイマー病動物モデルＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウス脳でのインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）タンパク質に対する影響を確認した結果である。（Ａ）痴呆動物の脳組織でインフラマソーム構成タンパク質（ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ３、ｃａｓｐａｓｅ−１、ＩＬ−１β、ＴＬＲ４およびＸＩＡＰ）の量がラマリン投与によって大きく減少する；（Ｂ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ３、ｃａｓｐａｓｅ−１、ＩＬ−１β、ＴＬＲ４およびＸＩＡＰタンパク質の量を測定を統計処理した値である。ＬＰＳによって誘導される炎症に対するラマリンの影響を微細神経膠細胞で確認した結果である。（Ａ）微細神経膠細胞にＬＰＳを処理して炎症反応を誘導すると大きく増加するＮＯがラマリン処理によって完全に抑制される結果を確認する；（Ｂ）ウェスタンブロットを介して微細神経膠細胞でＬＰＳによって増加する炎症信号伝達の主な因子（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２）の発現がラマをリンによって完全に抑制される結果を確認する；（Ｃ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってｉＮＯＳの量を測定を統計処理した値である；（Ｄ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってＣＯＸ−２の量を測定を統計処理した値である。ＬＰＳによって誘導されるＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性に対するラマリンの影響を微細神経膠細胞で確認した結果である。（Ａ）微細神経膠細胞でＬＰＳによって抑制されるＮＦ−κＢ（リン酸化されたｐ６５）がラマリン処理によって減少する結果を確認する；（Ｂ）微細神経膠細胞でＬＰＳによって抑制されるＮＦ−κＢ（リン酸化されたｐ６５）を統計処理した値である；（Ｃ）ＬＰＳが処理された微細神経膠細胞で活性化するストレスキナーゼ（ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ）がラマリン処理によって抑制される結果を確認する；（Ｄ）微細神経膠細胞でＬＰＳによって抑制されるストレスキナーゼを統計処理した値である。ＬＰＳによって誘導されるインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、ＩＬ−１β、ＴＬＲ４およびＢＡＣＥ１の発現に対するラマリンの影響を微細神経膠細胞で確認した結果である。（Ａ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法を介して微細神経膠細胞でＬＰＳによって増加するインフラマソーム構成分子（ＮＡＬＰ３、ＮＡＬＰ３、Ｃａｓｐａｓｅ−１）と先天性免疫受容体であるＴＬＲ４およびＡβ産生酵素であるＢＡＣＥ１の発現がラマリン処理によって抑制される結果を確認する；（Ｂ）ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）法によってインフラマソーム構成分子および先天性免疫受容体の量を測定して統計処理した値である。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明では、南極地衣類ラマリナ・テレブラタから分離した分子式Ｃ_１１Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_４の化合物ラマリン（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｎ’（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）の新規な学習および記憶障害予防効果を解明した。

従って、一観点において、本発明は、下記式Ｉで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の治療または予防用薬学組成物に関する。

本発明において、前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルーゲリック病、ピック病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病および痴呆からなる群で選択されることを特徴とし、アルツハイマー病であることが好ましいか、これに限定されない。

本発明において、前記ラマリンは、ＢＡＣＥ１およびＮＡＬＰインフラマソームタンパク質の発現を抑制することを特徴とする。また、炎症媒介因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＭＡＰＫ信号伝達経路タンパク質の発現を抑制することを特徴とする。

発明のラマリンを含有する組成物は、各々通常の方法による適切な担体、賦形剤または、希釈剤をさらに含んでもよい。化合物を含む組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

発明のラマリンを含有する組成物は、各々通常の方法により散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁液、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有してもよい。

製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤、保存剤等が含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６０、カカオ脂、ラウリン脂、クリセロゼラチン等が用いられる。

本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬品形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適宜選択される。しかし、好ましい効果を得るために、本発明の組成物は、１日０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｇ／ｋｇで、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇで投与した方が良い。投与は一日一回投与してもよく、数回に分けて経口投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。

他の観点において、本発明は、下記式Ｉで表されるラマリンを有効性分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用食品組成物に関する。

本発明の食品組成物は、機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｏｏｄ）、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、健康食品（ｈｅａｌｔｈｆｏｏｄ）および食品添加剤（ｆｏｏｄａｄｄｉｔｉｖｅｓ）等のすべての形態を含む。前記類型の健康機能食品は、当業界に公示された通常の方法により様々な形態で製造することができる。例えば、健康食品としては、本発明のラマリンを茶、ジュースおよびドリンクの形態で製造して飲用するようにしたり、顆粒化、カプセル化および粉末化して摂取することができる。また、機能性食品としては、飲み物（アルコール性飲み物を含む）、果実およびその加工食品（例：果物缶詰め、瓶詰、ジャム、ママレードなど）、魚類、肉類およびその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コンビーフなど）、パン類および麺類（例：ウドン、ザルソバ、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、醤油、ソースなど）等に本発明のラマリンを添加して製造することができる。

前記健康機能食品また、食品組成物として、機能性食品、栄養補助剤、健康食品、食品添加剤等の様々な形態を含み、当業界に公示された通常の方法により様々な形態、例えば、先述したラマリンを茶、ジュースおよびドリンクの形態で製造するか、顆粒化、カプセル化および粉末化するか、このような化合物または抽出物を飲み物、果実およびその加工食品、魚類、肉類およびその加工食品、パン類、麺類、調味料等各種食品に添加して製造することにより提供されることができる。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：ラマリンの分離／合成および動物モデルデザイン
本発明の下記の実施例では２００８年１月、南極キングジョージ島のバートン半島（Ｓ６２°１３．１、Ｗ５８°４７．０）で採集したラマリナ・テレブラタ（Ｒａｍａｌｉｎａｔｅｒｅｂｒａｔａ）からメタノールを利用した分離方法でラマリンを分離（ＫＲ１０−１０２５６１２）して使用するか、また天産物由来のラマリンと同じ効能を示す安定したラマリンを合成（ＫＲ１０−１１８２３３４）して使用した（図１Ａ）。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ種の反接合性形質転換マウスＡＰＰ／ＰＳ１（ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ１ｄＥ９）を１２時間−明（ｌｉｇｈｔ）、１２時間−暗（ｄａｒｋ）で維持しながら実験を実施した。７カ月齢、雌ＡＰＰ／ＰＳ１マウスをグループ当たり６匹ずつ、三つのグループ（対照群、１０ｍｇ／ｋｇラマリン、２０ｍｇ／ｋｇラマリン）に分けて、ラマリンを３８日間一日に一回ずつ口腔投与した。

モリス水迷路試験は３１日目から３５日目まで実施して、３６日目記憶力維持検査および３８日目Ｙ迷路試験を実施した。４０日目にはマウスを犠牲させた後、脳組織を−７０℃に保管した（図１Ｂ）。

実施例２：モリス水迷路試験
ＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウスに対するラマリンの記憶力向上効果を確認するために、既に知られたモリス法を若干変形して実施した。水槽は、高さ３５ｃｍ、径１００ｃｍの原形で、無毒性の水溶性の黒の染料を入れて、水温を２０℃に維持した。水槽を４等分して、その中一つの中間に水面から１ｃｍ程度下方に黒のプラットホーム（高さ１０ｃｍ、径８ｃｍ）を位置させた。様々な空間手がかりを入れた水槽のプラットホームで水泳を開始させたマウスをビデオシステム（ＥｔｈｏｖｉｒｉｏｎｓｙｓｔｅｍＮｏｌｄｕｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で観察した。水中迷路教育は、マウスが６０秒間プラットホームを探すことができなければ、一日に２回の機会をさらに与えた。各試みは１５分の休息時間を設けた後実施して、４日連続実施した。各マウスが、各実験での示す時間を測定して平均値を得た。マウスがプラットホームを探せば、１０秒間留まるようにして、もしマウスが１２０秒内にプラットホームを探すことができなければ、実験者がプラットホームに１０秒間いるように誘導した。６日目には水槽でプラットホームを除去した後、６０秒間プローブテストを行った。

ＡＰＰ／ＰＳ１形質転換マウスに４週間ラマリンを投与して、海馬機能を向上させた後、モリス水迷路実験を実施して、テストを実施する１週間もラマリンを投与した。その結果、プラットホームの位置について教育を受けた後、向上した記憶力によってプラットホームに到着する時間が短くなることを確認した。ラマリン（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）投与群で４日目プラットホームに到着する時間が短縮された（図２Ａ）。また、最終日プラットホームを除去後、目標象限に留まる時間を測定した時、ラマリン（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）濃度に依存的に増加した（図２Ｂ）。ラマリン投与群と対照群で水泳速度には差がなかった（図２Ｃ）。

実施例３：Ｙ迷路試験
Ｙ迷路は三つの通路（ａｒｍ）がＹ字型に延びて、各通路は長さ４０ｃｍ、高さ１２ｃｍ、幅３ｃｍとそれぞれ１２０°の角度で位置する。迷路底と壁は、不透明な暗色のポリビニールプラスチック材質であり、マウスは最初一つの通路で順に位置（ｉ．ｅ．，ＡＢＣＡＢｅｔｃ．）させた後、８分間通路を通過することを記録した。マウスの動きを交差回数で示し、連続的に三つの通路を通過した場合だけ一回交差したと定義した（ｉ．ｅ．，ＡＢＣ、ＣＡＢ、またはＢＣＡ、しかしＢＡＢではない）。迷路の通路は、臭いをきれいに除去して掃除して、最後のラマリンを投与（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）してから、一時間後にラマリンによる記憶損傷抑制を測定した。交差比率は下記の通り定義される。
％交差＝［（交差回数）／（総通路通過回数）］×１００
その結果、ラマリン濃度２０ｍｇ／ｋｇ投与群で記憶力が増進されたことを確認することができた（図２Ｄ）。

実施例４：ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳のＡβ生成と神経班（ｎｅｕｒｉｔｉｃｐｌａｑｕｅ）形成
ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳のアミロイド蓄積に対するラマリンの影響を調べるために、ラマリン投与群と対照群のＡβ４０、Ａβ４２およびＡβプラーク形成を分析した。ラマリン処理に対するＡβプラーク蓄積は脳を免疫染色して確認した。

マウスの脳組織は、４％パラホルムアルデヒドで固定して、３０％スクロースで４℃で４８時間凍結させて４５ｕｍ厚さに切断した。抗−Ａβ抗体（４００：１，４Ｇ８，Ｃｏｖａｎｃｅ）を使用して、ＤＡＢ染色でプラーク形成を確認した。その結果、ラマリン投与群の脳皮質と海馬でプラーク形成が顕著に減少した（図３Ｂ）。

また、Ａβを固相サンドイッチＥＬＩＳＡシステム（ＩＢＬ、２７７１３および２７７１１）で定量した。脳組織を１ｘプロテアーゼカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が含まれたＰＢＳで均質化した後、４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、ｗｅｌｌ当たり１００μｇの標準Ａβおよび試料を入れてＡβ抗体と４℃でＯ／Ｎ反応させた後、ａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ−ＨＲＰと常温で１時間反応させて、洗浄してｗｅｌｌ当たり１００ｕｌの安定化されたクロモゲンを添加して常温で３０分間暗反応させた後、停止溶液を添加して４５０ｎｍで分析した。その結果、ラマリン処理によってＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳組織でＡβ４０およびＡβ４２等が顕著に減少したことを確認した（図３Ｃ）。

実施例５：ラマリン処理されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳のＢＡＣＥ１発現減少
ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳のＢＡＣＥ１発現に対するラマリンの影響を調べるために、ラマリン投与群と対照群のＢＡＣＥ１レベルを免疫蛍光染色法およびウェスタンブロットで分析した。また、リアルタイム重合酵素連鎖反応でＢＡＣＥ１ｍＲＮＡレベルを分析した。
免疫蛍光染色法は、実施例４の方法と同じで、ＢＡＣＥ１抗体（４００：１，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）を使用して分析した。

ウェスタンブロットを行うために、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳組織でＴ−ｐｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）抽出バッファーとＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＴａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は、８−１７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、０．４５μＭＰＶＤＦでトランスファーした後、ＢＡＣＥ１抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）で確認した。

リアルタイム重合酵素連鎖反応は、ＲｉｂｏｓｐｉｎＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（ＧｅａｎＡｌｌ）で全てのＲＮＡを抽出して、ｉＳｃｒｉｐｔｓｙｓｔｅｍｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用して１μｇのＲＮＡでＲＴを実施した。リアルタイム重合酵素連鎖反応は、ＣＦＸ９６ＴＭｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行って、ＰＣＲ増幅は、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑＴＭＩＩ（ＴａＫａＲａＢｉｏＩｎｃ．）を使用して、２−ΔΔｃｔ方法で相対的定量をした。各遺伝子に対するプライマーは下記のとおりである。
ＢＡＣＥ１：ｆｏｒｗａｒｄ５’−ＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＡＧＧＣ−３’（配列番号１）
ｒｅｖｅｒｓｅ５’−ＴＡＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ：ｆｏｒｗａｒｄ５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’（配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ５’−ＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号４）

ＢＡＣＥ１発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現レベルに対する％で表示した。
その結果、免疫蛍光染色でラマリン投与群の脳皮質と海馬でＢＡＣＥ１免疫反応が減少したことを確認した（図４Ａ）。その次に、ラマリン処理したＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳でＢＡＣＥ１、Ｃ９９およびＣ８３のタンパク質発現を測定した。その結果、１ヶ月の間ラマリン処理条件でＢＡＣＥ１発現が顕著に減少したことを確認した（図４Ｄ）。また、ラマリン処理は、ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡレベルも減少させることをリアルタイム重合酵素連鎖反応分析で確認した（図４Ｅ）。

実施例６：ラマリン処理がＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳でｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＭＡＰＫおよびインフラマソームに及ぼす効果
ラマリンは良く知られている抗炎症化合物で、酸化窒素生成を抑制して神経保護作用を増加させる。したがって、酸化窒素生成を介してラマリンの抗炎症効果およびＡＤモデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスでラマリンの神経炎症に対する効果を確認した。

その結果、ラマリン処理によってＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳でｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現が顕著に抑制されたことを確認することができた（図５）。また、ラマリン処理によるＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ）およびＮＡＬＰインフラマソームタンパク質（ＮＡＬＰｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｐｒｏｔｅｉｎ）発現に対する効果を分析した。ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ、ＮＡＬＰ３、ＮＡＬＰ１、Ｃａｓｐａｓｅ１およびＸＩＡＰのタンパク質発現をウェスタンブロットで確認した。

その結果、ｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、Ｐ−ＥＲＫ、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ３、ｐｒｅ−ｃａｓｐａｓｅ１、ｃｌｅａｖｅｄ−ｃａｓｐａｓｅ１およびＴＬＲ４はラマリン処理によって発現が減少したが、ｔ−ｐ３８、ｔ−ＪＮＫ、ｔ−ＥＲＫ、ｐｒｅ−ＩＬ−１βおよびＸＩＡＰは大きいな差を示さなかった（図６および７）。

実施例７：ＬＰＳによって誘導されたＮＯ、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２に対するラマリンの影響
ＨＴ−２２海馬細胞とＢＶ−２微細神経膠細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）が含まれたＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）で３７℃でＣＯ_２培養器で培養した。ラマリンは０．１％（ｖ／ｖ）の濃度で蒸溜水に溶かして使用して、すべての実験の細胞はＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）が存在するか、存在しない無血清ＤＭＥＭ培地に各濃度のラマリンを処理して培養した。

ＮＯ測定は、培養培地をＧｒｉｅｓｓ反応で行って、ＢＶ−２微細神経膠細胞（２．５×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌｉｎ２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）にラマをリンを前処理した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）２４時間処理して培養液を分析した。各サンプル５０ｕｌ培養液を同量のＧｒｉｅｓｓ試薬［０．１％Ｎ−（１−ｎａｐｈｔｈｙｌ）−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅおよび１％ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅが含まれた５％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄ］と混合して９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅで１０分間暗反応した。硝酸塩濃度は、培養液の硝酸ナトリウムの標準溶液で分析して、５４０ｎｍで測定した。

その結果、ＢＶ−２微細神経膠細胞で１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理によるＮＯ生成は、１８．５２μＭであり、１μｇ／ｍｌラマリン処理によって１５．１７μＭおよび１０μｇ／ｍｌラマリン処理によって５．６４μＭとＮＯ生成が減少した。また、１００μｇ／ｍｌラマリン処理によって０．５３μＭとＮＯ生成が顕著に抑制された（図８Ａ）。

１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理後、ウェスタンブロットで分析したｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２タンパク質レベルは、対照群に比べて４８％程度増加したが、１０μｇ／ｍｌラマリン処理によって再び４６．６７％および５５．３３％増加が抑制された。また、１００μｇ／ｍｌラマリン処理によってｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２タンパク質レベルは１２６．３％および２３２％の顕著な増加抑制が示された（図８Ｃ、Ｄ）。

実施例８：ＬＰＳによって誘導されたｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびＮＦ−κＢのリン酸化およびインフラマソームタンパク質に対するラマリンの影響
図８に示された通り、ＢＶ−２微細神経膠細胞に１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理は、ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢｐ６５を対照群と比較して５０３．７％、９９％、５８％および８９％の割合で速くリン酸化させるのに対して、１０および１００μｇ／ｍｌラマリン処理は、ＮＦ−κＢを４１．６７％および１３１％減少させて、１００μｇ／ｍｌラマリン処理はｐ３８、ＪＮＫおよびＥＲＫＭＡＰＫのリン酸化を５１６．５％、１１６％および４２％減少させて、ＬＰＳを処理した微細神経膠細胞でラマリンが増加するＮＦ−κＢ（リン酸化されたｐ６５）を減少させて、ＬＰＳが処理された微細神経膠細胞で活性化するストレスキナーゼ（ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ）がラマリン処理によって抑制されることが明らかにされた（図９）。

また、ＢＶ−２微細神経膠細胞でＬＰＳによって増加するインフラマソーム構成分子（ＮＡＬＰ３、ＮＡＬＰ３、Ｃａｓｐａｓｅ−１）と先天性免疫受容体であるＴＬＲ４およびＡβ産生酵素であるＢＡＣＥ１発現がラマリン処理によって顕著に抑制されることが明らかにされた（図１０）。

本発明に係るラマリンは、ＮＬＲＰインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）タンパク質を含む炎症因子およびＢＡＣＥ１の発現抑制を介して認知能力を向上させる効果があって、記憶障害および退行性脳疾患の予防または治療に有用である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

下記式Ｉで表されるラマリンを有効成分として含有するアルツハイマー病の治療または予防用薬学組成物。
前記ラマリンは、ＢＡＣＥ１およびＮＡＬＰインフラマソームタンパク質の発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
下記式Ｉで表されるラマリンを有効成分として含有するアルツハイマー病の予防または改善用食品組成物。