WO2016064009A1

WO2016064009A1 - 라말린을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: WO2016064009A1
Application number: PCT/KR2014/010057
Authority: WO
Inventors: 임정한; 김일찬; 한세종; 조동규
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-04-28
Also published as: EP3210602A4; US9968576B2; EP3210602B1; JP2017533261A; EP3210602A1; CN113456623A; JP6398014B2; CN107205973A; US20170304244A1

Abstract

본 발명은 라말린의 새로운 용도인 퇴행성 뇌질환 치료용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인플라마솜(inflammasome) 및 BACE1의 발현 억제 활성을 갖는 라말린을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 라말린은 NLRP 인플라마솜(inflammasome) 단백질을 포함하는 염증인자 및 BACE1의 발현을 억제를 통하여 인지능력을 향상시키는 효과가 있어, 기억장애 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

라말린을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물

본 발명은 라말린(Ramalin)의 새로운 용도인 퇴행성 뇌질환 치료용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인플라마솜(inflammasome) 및 BACE1의 발현 억제 활성을 갖는 라말린을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease : AD)은 치매를 일으키는 가장 일반적인 퇴행성 뇌질환이며, 진행형 신경 퇴행성 질환 증상으로 뉴런 손실 및 인지 장애가 있다(Donev et al., J Cell Mol Med, 13:4329-48, 2009). 알츠하이머병은 세포외 아밀로이드-베타(amyloid-β:Aβ) 플라크 및 세포 내 신경섬유 엉킴의 신경 병리학적 특징을 나타낸다(Querfurth et al., N Engl J Med. 362(4):329-44; LaFerla et al., Biochem Soc Trans. 38(4):993-5). 아밀로이드-베타는 BACE1(Beta-secretase 1) 및 프리시닐린/감마-세크레타제(presenilin/γ-secretase)에 의해 매개되는, 아밀로이드-베타 전구체 단백질(amyloid-β precursor protein:APP)의 연속 분열에 의해 생성된다. 아밀로이드-베타의 생성 및 응집은 신경퇴화, 신경섬유의 엉킴 현상, 염증 및 뉴런의 손실을 일으키는 복잡한 병리학적 유발을 촉발시키는 중요한 역활을 한다.

신경염증을 나타내는 미세신경아교세포의 활성화는 알츠하이머병 환자 뇌에서의 또 다른 병리학적 특성이다(McGeer et al., Neurosci Lett, 79:195-200, 1987). 또한, 미세신경아교세포는 AD, PD(파킨슨병:Parkinson's disease), HIV(인간 면역 결핍 바이러스:human immunodeficiency virus) 치매 및 다발성 경화증과 같은 만성 신경변성 질환을 포함하여 많은 CNS(중추신경계통:central nervous system) 질환에서 잠재적인 발병원의 역활을 한다(Block et al., Nat Rev Neurosci, 8:57-69, 2007). 활성화된 신경아교세포 및 백혈구는 아나필라톡신 보체(anaphylatoxin complement), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine) 및 프로스타글라딘(prostaglandin)을 포함하는 다양한 염증성 매개 물질을 생산한다(Gelderblom et al., Stroke 40(5):1849-57, 2009; Iadecola et al., Nature Neuroscience 14(11):1363-1368, 2011).

말초조직에서 인플라마솜 복합체(inflammasome complex)에 대한 연구는, 염증성 사이토카인의 생산 및 분비, apoptotic 및 pyroptotic 세포사멸에 관한 것이다(Lamkanfi et al., Annu Rev Cell Dev Biol. 28:137-61). NLRP1(NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 1) 및 NLRP3(NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3) 인플라마솜은 NLRP1/3 수용체, ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain), 전구체 카스파제-1(procaspase-1), 전구체 카스파제-11(procaspase-11)(인간의 전구체 카스파제-4 또는 5와 상동) 및 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)로 구성된 세포질의 고분자 복합체이다(Boyden et al., Nat Genet 38(2):240-4, 2006; Martinon et al., Mol Cell 10(2):417-26, 2002). NLRP1 및 NLRP3 수용체의 활성화 및 호모-올리고머화에 의해 전구체 카스파제-1이 자동 활성화되어 절단 카스파제-1으로 전환되고, NLRP1 및 NLRP3 인플라마솜을 형성한다(Lamkanfi et al., Annu Rev Cell Dev Biol. 28:137-61; Martinon et al., Mol Cell 10(2):417-26, 2002). Aβ의 만성 축적은 알츠하이머병에서 미세신경아교세포의 활성화를 촉진한다(Goldmann et al., Cell Res. 23:595-6). IL-1β 수준의 증가는 Aβ의 축적과 연관이 있으며(Lucin et al., Neuron, 64:110-22, 2009), IL-1β은 카스파제-1의 활성화 및 분비를 위해 비활성 프로-형태로 생산되며, 카스파제-1 활성은 인플라마솜에 의해 조절된다. NLRP3 인플라솜은 Aβ와 같은 염증성 결정 및 응집 단백질을 감지하며, 만성 염증질환과 관련이 있다(Halle et al., Nat Immunol 9(8)857-65, 2008; Martinon et al., Annu Rev Immunol 27:229-65, 2009; Heneka et al., Nature 493(7434):674-8). NLRP 인플라마솜의 활성화에 의해 유도된 염증성 물질은 시냅스 기능장애, 인지장애 및 미세신경교세포의 기능제한 등을 매개하는 역활을 한다. Aβ-매개 염증성 반응에서 주요 역활을 하는 NLRP 인플라마솜 및 인플라마솜-유래 사이토카인의 활성화를 억제하는 치료를 통하여 알츠하이머병의 진행을 효과적으로 방해할 수 있다.

라말린은 인간 각질세포 및 섬유아세포에서 세포 독성이 거의 나타나지 않는 농도에서 항산화 효과를 나타냈으며(Paudel et al., Phytomedicine. 18(14):1285-90), 염증 반응을 억제하는 항산화제로 알려져 있다.

본 발명자들은 이전 연구에서 남극 킹조지섬에 자생하는 지의류인 라말리나 테라브라타(Ramalina terebrata)로부터 신규 화합물인 라말린을 분리하였으며(KR 10-1025612), 라말린의 합성 방법을 제공하였다(KR 10-1182334). 또한, 상기 분리 및 합성한 라말린의 염증 또는 면역질환 에방 또는 치료 효과(KR 10-1290745) 및 간섬유화 및 간경화의 예방 또는 치료 효과(KR 10-1326256)를 밝혔다. 그러나, 라말린의 퇴행성 뇌질환 관련 예방 또는 치료 효과에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 알츠하이머병 및 알츠하이머병 유사 질환 치료를 위한 효과적인 전략을 개발하고자 예의 노력한 결과, 라말린이 BACE1 발현 및 NLRP 인플라마솜 단백질 같은 염증성 마커의 발현을 억제함으로써 아밀로이드 생성을 저해하고, 알츠하이머병 모델 마우스에서 인지기능을 현저히 향상시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

화학식 1

본 발명은 또한, 상기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

도 1은 (a) 라말린의 화학 구조에 대한 도식도 및 (b) 라말린 처리 후 행동기능 검사를 위한 동물 실험 계획의 도식도이다.

도 2는 알츠하이머병 동물모델인 APP/PS1 형질전환 마우스를 대상으로 라말린 투여에 따른 학습 및 기억 장애 예방 효과를 나타낸 결과이다. (a) 라말린이 4주 동안 투여된 실험군들에서는 수면 아래의 플랫폼을 대조군 (vehicle)에 비해 빠르게 찾아감; (b) 수중미로 테스트 시작 후 6일 째 되는 날에 수행된 프로브 테스트 결과, 라말린은 치매 동물모델의 기억유지능의 개선 효과를 보임; (C) 실험 동물군들의 수영 속도를 측정한 결과 실험군 간의 차이가 없음; (d) 공간기억능력을 평가하기 위해서 Y-maze test를 실시한 결과, 라말린(20 mg/kg)이 4주 동안 투여된 실험군에서 변경행동력이 크게 증가함.

도 3은 알츠하이머병 동물모델인 APP/PS1 형질전환 마우스에서 라말린 투여 후, 신경반(neuritic plaque) 형성 및 Aβ 생성이 현저히 감소하는 것을 나타내는 결과이다. (a) 피질과 해마에서 Aβ 염색정도가 라말린 투여 동물에서 감소한 것을 현미경 사진으로 관찰함; (b) 피질과 해마에서 모두 라말린 투여에 의해 Aβ 노인반의 숫자 또한 감소한 것을 이미지 분석 정량으로 확인함; (c) 효소면역측정법(ELISA)를 이용한 수용성 Aβ 측정결과, 라마린 투여군에서 Aβ40과 Aβ42 모두 감소한 것을 확인함.

도 4는 라말린 투여 후 알츠하이머병 동물모델 APP/PS1 형질전환 마우스에서 BACE1 레벨 억제를 확인한 결과로 라말린이 뇌내 BACE1의 전사체 및 단백질의 양을 감소시키는 효능이 있으며, 이로 인해 치매 원인 물질인 Aβ의 생산이 감소한다는 것을 의미하는 결과이다. (a) 라말린 투여 후 동물의 피질에서 Aβ를 생산하는 효소인 BACE1에 특이적인 항체를 이용한 면역화학염색법을 통해 BACE1의 발현이 라말린 투여에 의해 줄어들어 있는 것을 확인함; (b) 라말린 투여 후 동물의 해마에서 Aβ를 생산하는 효소인 BACE1에 특이적인 항체를 이용한 면역화학염색법을 통해 BACE1의 발현이 라말린 투여에 의해 감소하는 것을 확인함; (c) 웨스턴블랏 (Western blotting) 방법에 의해 단백질의 양을 측정했을 때 라말린 투여 동물의 뇌조직에서 BACE1과 Aβ 전구체이자 BACE1의 기질인 C99 또한 감소한 것을 확인함; (d) 웨스턴블랏 (Western blotting) 방법에 의해 단백질의 양을 측정을 통계처리한 값을 나타낸 것임; (e) 라말린 투여에 의해 치매 동물의 뇌조직에서 BACE1의 전사체(mRNA) 발현이 감소한 것을 확인함.

도 5는 라말린 투여 후 알츠하이머병 동물모델 APP/PS1 형질전환 마우스 뇌의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 효과를 확인한 결과이다. (a) 라말린 투여에 의해 치매 동물의 뇌조직에서 iNOS와 COX-2의 단백질 양이 감소한 것을 확인함; (b) 웨스턴블랏(Western blotting) 방법에 의해 단백질의 양의 측정을 통계 처리한 값임.

도 6은 라말린 투여 후 알츠하이머병 동물모델 APP/PS1 형질전환 마우스 뇌에서의 MAPK 신호전달 경로 단백질에 대한 영향을 확인한 결과이다. (a) 치매 동물의 뇌조직에서 인산화된 스트레스 카이네이즈(p38, JNK 및 ERK)의 양이 라말린 투여에 의해 크게 감소함; (b) 웨스턴블랏 (Western blotting) 방법에 의해 p38, JNK 및 ERK 단백질의 양을 측정을 통계처리한 값임.

도 7은 라말린 투여 후 알츠하이머병 동물모델 APP/PS1 형질전환 마우스 뇌에서의 인플라마솜(inflammasome) 단백질에 대한 영향을 확인한 결과이다. (a) 치매 동물들의 뇌조직에서 인플라마좀 구성 단백질들(NALP1, NALP3, caspase-1, IL-1β, TLR4 및 XIAP)의 양이 라말린 투여에 의해 크게 감소함; (b) 웨스턴블랏(Western blotting) 방법에 의해 NALP1, NALP3, caspase-1, IL-1β, TLR4 및 XIAP 단백질의 양을 측정을 통계처리한 값임.

도 8은 LPS에 의해 유도되는 염증에 대한 라말린의 영향을 미세신경교세포에서 확인한 결과이다. (a) 미세신경교세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하면 크게 증가하는 NO가 라말린 처리에 의해 완전히 억제되는 결과를 확인함; (b) 웨스턴블랏을 통해 미세신경교세포에서 LPS에 의해 증가되는 염증 신호전달의 주요 인자들 (iNOS, COX-2)의 발현이 라말린에 의해 완전히 억제되는 결과를 확인함; (c) 웨스턴블랏(Western blotting) 방법에 의해 iNOS의 양을 측정을 통계처리한 값임; (d) 웨스턴블랏(Western blotting) 방법에 의해 COX-2의 양을 측정을 통계처리한 값임.

도 9는 LPS에 의해 유도되는 NF-κB 및 MAPK의 활성에 대한 라말린의 영향을 미세신경교세포에서 확인한 결과이다. (a) 미세신경교세포에서 LPS에 의해 억제되는 NF-κB (인산화된 p65)가 라말린 처리에 의해 감소되는 결과를 확인함; (b) 미세신경교세포에서 LPS에 의해 억제되는 NF-κB (인산화된 p65)를 통계처리한 값임; (c) LPS가 처리된 미세신경교세포에서 활성화되는 스트레스 카이네이즈들(p38, JNK, ERK)이 라말린 처리에 의해 억제되는 결과를 확인함; (d) 미세신경교세포에서 LPS에 의해 억제되는 스트레스 카이네이즈들을 통계처리한 값임.

도 10은 LPS에 의해 유도되는 인플라마솜(inflammasome), IL-1β, TLR4 및 BACE1의 발현에 대한 라말린의 영향을 미세신경교세포에서 확인한 결과이다. (a) 웨스턴블랏(Western blotting) 방법을 통해 미세신경교세포에서 LPS에 의해 증가되는 인플라마솜 구성분자들 (NALP3, NALP3, Caspase-1)과 선청성 면역수용체인 TLR4 및 Aβ 생산 효소인 BACE1의 발현이 라말린 처리에 의해 억제되는 결과를 확인함; (b) 웨스턴블랏(Western blotting) 방법에 의해 인플라마솜 구성분자들 및 선청성 면역수용체의 양을 측정하여 통계처리한 값임.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 남극 지의류 라말리나 테레브라타로부터 분리한 분자식 C₁₁H₁₆N₃O₄의 화합물 라말린(γ-glutamyl-N'(2-hydroxyphenyl)hydrazide)의 신규한 학습 및 기억장애 예방 효과를 규명하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 알츠하이머병인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 라말린은 BACE1 발현 억제 및 NALP 인플라마솜 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 염증 매개 인자 iNOS, COX-2, MAPK 신호전달 경로 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 라말린을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 라말린을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.001~100/kg으로, 바람직하게는 0.01~10/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, 하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

본 발명의 식품 조성물은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 라말린을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 라말린을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로써 기능성 식품, 영양보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 라말린을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 라말린의 분리/합성 및 동물모델 디자인

본 발명의 하기 실시예에서는 2008년 1월, 남극 킹조지섬의 바튼반도(S62°13.1, W58°47.0)에서 채집한 라말리나 테레브라타르(Ramalina terebrata)로부터 메탄올을 이용한 분리방법으로 라말린을 분리(KR 10-1025612)하여 사용하거나, 또한, 천연물 유래의 라말린과 같은 효능을 나타내는 안정한 라말린을 합성(KR 10-1182334)하여 사용하였다(도 1a)

C57BL/6J 종의 반접합성 형질전환 마우스 APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)를 12시간-명(light), 12시간-암(dark)으로 유지하면서 실험을 실시하였다. 7개월령, 암컷 APP/PS1 마우스를 그룹당 6마리씩, 3개의 그룹(대조군, 10mg/kg 라말린, 20mg/kg 라말린)으로 나누고, 라말린을 38일간 하루에 한번 씩 구강 투여하였다.

모리스 수중 미로 테스트는 31일째부터 35일째까지 실시하였으며, 36일째 기억력 유지 검사 및 38일째 Y 미로 테스트를 실시하였다. 40일째에는 마우스를 희생시킨 후, 뇌조직을 -70℃에 보관하였다(도 1b).

실시예 2: 모리스 수중 미로 테스트

APP/PS1 형질전환 마우스에 대한 라말린의 기억력 향상 효과를 확인하기 위하여, 기존에 알려진 모리스 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 수조는 높이 35cm, 지름 100cm의 원형으로 무독성의 수용성 검은 염료를 넣고, 수온을 20℃로 유지하였다. 수조를 4등분 하고, 그 중 하나의 중간에 수면으로부터 1cm 정도 아래에 검은 플랫폼(높이 10cm, 지름 8cm)을 위치시켰다. 여러 가지 공간 단서들을 담은 수조의 플랫폼에서 수영을 시작시킨 마우스들을 비디오 시스템(Ethovirion system Noldus, Wageningen, Netherlands)으로 관찰하였다. 수중미로 교육은 마우스가 60초 동안 플랫폼을 찾지 못하면, 하루에 2번의 기회를 더 부여하였다. 각각의 시도는 15분의 휴식시간을 가진 후 실시하였고, 4일 연속 실시하였다. 각각의 마우스가 각각의 실험에서의 보여주는 시간을 측정하여 평균치를 얻었다. 마우스가 플랫폼을 찾으면 10초간 머무르게 하였고, 만약 마우스가 120초 내에 플랫폼을 찾지 못하면, 실험자가 플랫폼에 10초간 있도록 유도하였다. 6일째에는 수조에서 플랫폼을 제거한 후, 60초 동안 프로브 테스트를 하였다.

APP/PS1 형질전환 마우스에 4주간 라말린을 투여하여 해마기능을 향상시킨 후 모리스 수중미로 실험을 실시하였으며, 테스트를 실시하는 1주일간 역시 라말린을 투여하였다. 그 결과, 플랫폼의 위치를 교육받은 후, 향상된 기억력에 의해 플랫폼에 도착하는 시간이 짧아지는 것을 확인하였다. 라말린(10 및 20mg/kg) 투여군에서 4일째 플랫폼에 도착하는 시간이 단축되었다(도 2a). 또한, 마지막날 플랫폼을 제거 후, 목표 사분면에 머무는 시간을 측정했을 때, 라말린(10 및 20mg/kg) 농도에 의존적으로 증가하였다(도 2b). 라말린 투여군과 대조군에서 수영 속도에는 차이가 없었다(도 2c).

실시예 3: Y 미로 테스트

Y 미로는 3개의 통로(arm)가 Y자 모양으로 뻗어 있고, 각 통로는 길이 40cm, 높이 12cm, 폭 3cm로 각각 120°의 각도로 위치한다. 미로 바닥과 벽은 불투명한 어두운 색의 폴리비닐 플라스틱 재질이며, 마우스들은 처음 한 개의 통로에서 순서대로 위치(i.e., ABCAB etc.)시킨 후, 8분간 통로를 통과하는 것을 기록하였다. 마우스의 움직임을 교차횟수로 나타내고, 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 경우만 한번 교차한 것으로 정의하였다(i.e., ABC, CAB, 또는 BCA 그러나 BAB는 아님). 미로의 통로는 냄새를 깨끗하게 제거하여 청소하였으며, 마지막 라말린을 투여(10 및 20mg/kg) 한 다음 한 시간 후에 라말린에 의한 기억손상 억제를 측정하였다. 교차 비율은 다음과 같이 정의된다.

％교차=[(교차횟수)/(총 통로 통과 횟수)]×100.

그 결과, 라말린 농도 20mg/kg 투여군에서 기억력이 증진된 것을 확인할 수 있었다(도 2d).

실시예 4: APP/PS1 마우스 뇌의 Aβ 생성과 신경반(neuritic plaque) 형성

APP/PS1 마우스 뇌의 아밀로이드 축적에 대한 라말린의 영향을 조사하기 위하여, 라말린 투여군과 대조군의 Aβ40, Aβ42 및 Aβ 플라크 형성을 분석하였다. 라말린 처리에 대한 Aβ 플라크 축적은 뇌를 면역염색하여 확인하였다.

마우스의 뇌조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 30% 수크로즈로 4℃에서 48시간동안 동결시켜 45㎛ 두께로 절단하였다. 항-Aβ 항체(400:1, 4G8, Covance)를 사용하여, DAB 염색으로 플라크 형성을 확인하였다. 그 결과, 라말린 투여군의 뇌 피질과 해마에서 플라크 형성이 현저하게 감소되었다(도 3b).

또한, Aβ를 고체상 샌드위치 ELISA 시스템(IBL, 27713 및 27711)으로 정량하였다. 뇌 조직을 1x 프로테아제 칵테일(Calbiochem)이 함유된 PBS로 균질화한 후, 4℃에서 13,000rpm으로 10분간 원심분리하고, well 당 100㎍의 표준 Aβ 및 시료를 넣고 Aβ 항체와 4℃에서 O/N 반응시킨 후, antimouse IgG-HRP와 상온에서 1시간 반응시키고, 세척하여 well당 100㎕의 안정화된 크로모젠을 첨가하여 상온에서 30분간 암반응시킨 후, 정지 용액을 첨가하여 450nm에서 분석하였다. 그 결과, 라말린 처리에 의해 APP/PS1 마우스 뇌조직에서 Aβ40 및 Aβ42 등이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 3c).

실시예 5: 라말린 처리된 APP/PS1 마우스 뇌의 BACE1 발현 감소

APP/PS1 마우스 뇌의 BACE1 발현에 대한 라말린의 영향을 조사하기 위하여, 라말린 투여군과 대조군의 BACE1 레벨을 면역형광염색법 및 웨스턴블롯으로 분석하였다. 또한, 실시간 중합효소 연쇄반응으로 BACE1 mRNA 레벨을 분석하였다.

면역형광염색법은 실시예 4의 방법과 동일하며, BACE1 항체(400:1, R＆D system)를 사용하여 분석하였다.

웨스턴블롯을 수행하기 위해, APP/PS1 마우스 뇌 조직에서 T-per(Pierce) 추출버퍼와 Complete Mini Protease Inhibitor Tablets(Roche)를 사용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 8-17% SDS-PAGE로 전기영동한 후, 0.45μM PVDF로 트랜스퍼한 후, BACE1 항체(Cell Signaling)로 확인하였다.

실시간 중합효소 연쇄반응은 Ribospin RNA purification system(GeanAll)로 총 RNA를 추출하고, iScript system cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 이용하여 1㎍의 RNA로 RT를 실시하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 CFX96TM system(Bio-Rad)을 사용하여 수행하였으며, PCR 증폭은 SYBR Premix EX TaqTMII(TaKaRa Bio Inc.)를 사용하였고, 2-△△ct 방법으로 상대적 정량을 하였다. 각각의 유전자에 대한 프라이머는 하기와 같다.

BACE1: forward 5'-ATGTGGAGATGACCGTAGGC-3' (서열번호 1)

reverse 5'-TACACACCCTTTCGGAGGTC-3' (서열번호 2)

GAPDH: forward 5'-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3' (서열번호 3)

reverse 5'-TGTCATACCAGGAAATAGGC-3' (서열번호 4)

BACE1 발현 레벨은 GAPDH 발현 레벨에 대한 %로 표시하였다.

그 결과, 면역형광염색으로 라말린 투여군의 뇌 피질과 해마에서 BACE1 면역 반응이 감소한 것을 확인하였다(도 4a). 그 다음, 라말린 처리한 APP/PS1 마우스 뇌에서 BACE1, C99 및 C83의 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과, 1개월 동안 라말린 처리 조건에서 BACE1 발현이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 4d). 또한, 라말린 처리는 BACE1의 mRNA 레벨도 감소시킴을 실시간 중합효소 연쇄반응 분석으로 확인하였다(도 4e).

실시예 6: 라말린 처리가 APP/PS1 마우스 뇌에서 iNOS, COX-2, MAPK 및 인플라마솜에 미치는 효과

라말린은 잘 알려진 항염증 화합물로 산화질소 생성을 억제하여 신경 보호작용을 증가시킨다. 따라서, 산화질소 생성을 통해 라말린의 항염증 효과 및 AD 모델인 APP/PS1 마우스에서 라말린의 신경염증에 대한 효과를 확인하였다.

그 결과, 라말린 처리에 의해 APP/PS1 마우스 뇌에서 iNOS 및 COX-2의 발현이 현저히 억제된 것을 확인 할 수 있었다(도 5).

또한, 라말린 처리에 의한 MAPK(Mitogen-activated protein kinases) 및 NALP 인플라마솜 단백질(NALP inflammasome protein) 발현에 대한 효과를 분석하였다. p38, JNK, ERK, NALP3, NALP1, Caspase1 및 XIAP의 단백질 발현을 웨스턴블롯으로 확인하였다.

그 결과, p-p38, p-JNK, P-ERK, NALP1, NALP3, pre-caspase1, cleaved-caspase1 및 TLR4는 라말린 처리에 의해 발현이 감소하였으나, t-p38, t-JNK, t-ERK, pre-IL-1β 및 XIAP는 큰 차이를 나타내지 않았다(도 6 및 7).

실시예 7: LPS에 의해 유도된 NO, iNOS 및 COX-2에 대한 라말린의 영향

HT-22 해마세포와 BV-2 미세신경아교세포는 10% FBS 및 1% pen/strep(Gibco, USA)가 포함된 DMEM(Hyclone, USA)으로 37℃에서 CO₂ 배양기로 배양하였다. 라말린은 0.1%(v/v)의 농도로 증류수에 녹여 사용하였고, 모든 실험의 세포는 LPS(1㎍/ml)가 존재하거나 존재하지 않는 무혈청 DMEM 배지에 각각의 농도의 라말린을 처리하여 배양하였다.

NO 측정은 배양 배지를 Griess 반응으로 수행하였으며, BV-2 미세신경아교세포(2.5×10⁵ cell/well in 24 well plate)에 라말린을 전처리 후, LPS(1㎍/ml) 24시간 동안 처리하여 배양액을 분석하였다. 각 샘플 50㎕ 배양액을 동량의 Griess 시약[0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride 및 1% sulfanilamide가 포함된 5% phosphoric acid]과 혼합하여 96 well plate에서 10분간 암반응 하였다. 질산염 농도는 배양액의 질산나트륨의 표준용액으로 분석하였으며, 540nm에서 측정하였다.

그 결과, BV-2 미세신경아교세포에서 1㎍/ml LPS 처리에 의한 NO 생성은 18.52μM이며, 1㎍/ml 라말린 처리에 의해 15.17μM 및 10㎍/ml 라말린 처리에 의해 5.64μM으로 NO 생성이 감소하였다. 또한, 100㎍/ml 라말린 처리에 의해 0.53μM으로 NO 생성이 현저하게 억제되었다(도 8a).

1㎍/ml LPS 처리 후, 웨스턴블롯으로 분석한 iNOS 및 COX-2 단백질 레벨은 대조군에 비해 48% 정도 증가하였으나, 10㎍/ml 라말린 처리에 의해 다시 46.67% 및 55.33% 증가가 억제되었다. 또한, 100㎍/ml 라말린 처리에 의해 iNOS 및 COX-2 단백질 레벨은 126.3% 및 232%의 현저한 증가 억제가 나타났다(도 8c, d).

실시예 8: LPS에 의해 유도된 p38, JNK, ERK 및 NF-κB의 인산화 및 인플라마솜 단백질에 대한 라말린의 영향

도 8에 나타난 바와 같이, BV-2 미세신경아교세포에 1㎍/ml LPS 처리는 p38, JNK, ERK MAPK 및 NF-κB p65를 대조군과 비교하여 503.7%, 99%, 58% 및 89%의 비율로 빠르게 인산화시키는데 반하여, 10 및 100㎍/ml 라말린 처리는 NF-κB를 41.67% 및 131% 감소시켰고, 100㎍/ml 라말린 처리는 p38, JNK 및 ERK MAPK의 인산화를 516.5%, 116% 및 42% 감소시켜, LPS를 처리한 미세신경교세포에서 라말린이 증가되는 NF-κB (인산화된 p65)를 감소시켰으며, LPS가 처리된 미세신경교세포에서 활성화되는 스트레스 카이네이즈들 (p38, JNK, ERK)이 라말린 처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 9).

또한, BV-2 미세신경아교세포에서 LPS에 의해 증가되는 인플라마솜 구성분자들(NALP3, NALP3, Caspase-1)과 선천성면역수용체인 TLR4 및 Aβ 생산 효소인 BACE1 발현이 라말린 처리에 의해 현저히 억제되는 것으로 나타났다(도 10).

본 발명에 따른 라말린은 NLRP 인플라마솜(inflammasome) 단백질을 포함하는 염증인자 및 BACE1의 발현을 억제를 통하여 인지능력을 향상시키는 효과가 있어, 기억장애 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

전자파일 첨부하였음.

Claims

하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물:

화학식 1
제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병,픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, BACE1 발현 억제 및 NALP 인플라마솜 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물:

화학식 1
제6항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병,픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.