KR20160041110A - 갈색거저리의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈색거저리 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명인 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법은, 동결건조된 갈색거저리를 분쇄시키는 제1단계, 상기 제1단계에서 분쇄된 갈색거저리와 에탄올을 혼합하여 갈색거저리 혼합액을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계에서 제조된 갈색거저리 혼합액을 초음파 분쇄기로 미세화시키는 제3단계 및, 상기 제3단계에서 미세화된 갈색거저리 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시키는 제4단계를 포함하여, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 갖는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 갖는 갈색거저리 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

Description

갈색거저리의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Rheumatoid Arthritis Comprising extract suspension of Tenebrio molitor}

본 발명은 갈색거저리의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 갖는 갈색거저리의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

만성염증인 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)의 정확한 발병원인과 기작은 아직까지 잘 알려져 있지 않지만, 현재까지 밝혀진 유력한 발병원인 중 한 가지는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)와 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)의 수적 불균형으로 인해 뼈의 항상성이 무너져서 발생되는 것으로 알려져 있다.

정상적인 상태의 파골세포는 단핵구 및 대식세포에서 분화되어 오래된 뼈를 파괴시키거나 손상된 뼈를 제거하는 역할을 하지만, 류마티스 환자에서 발견되는 파골세포의 양상은 파골세포 생성(osteoclatogeneration)으로 인한 수적 증가와 지속적인 생존 및 과도한 활성이 확인되며, 이로 인해 뼈가 크게 손상되는 병리학적 형태를 보인다.

파골세포의 전구체 세포인 단핵구와 대식세포가 파골세포로 분화하기 위해서는 골수줄기세포(mesenchymal stem cell)에서 분화된 조골세포나 활성화된 T 세포에서 생성된 RANK(receptor activator of NK-κB)의 리간드인 RANKL(RANK Ligand)과 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)의 존재가 필수적으로 생각되고 있다.

NF-κB 패밀리의 구성원 중 하나인 RANKL은 전구체세포를 파골세포로 분화시키고 생존시키며, 파골 전구체세포 끼리의 융합을 촉진시켜 파골세포가 성숙, 뼈를 파괴시키는 효소를 발현하는데 필수적인 역할을 한다.

M-CSF는 파골 전구세포의 cFMS 수용체에 결합하여 파골세포의 분열을 촉진시킨다. 파골세포는 뼈의 항상성을 유지시키는데 필수적인 세포이지만, 과도하게 생성된 면역반응에 의해 RANKL과 M-CSF가 대량 분비되면 파골세포의 수적 증가, 지속적인 생존, 높은 활성 등을 일으켜 류마티스의 원인이 된다고 생각되고 있다.

파골세포는 뼈를 분해시키기 위한 다양한 효소를 생성하는데, 뼈를 산화 시켜 분해시키는 산성인산화 효소인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)과 뼈와 연골의 세포지지조직을 분해하는 MMP-9(matrix metallopeptidase-9), 콜라겐을 분해하는 cathepsin K등이 주 효소로 알려져 있으며, 이 효소들은 성숙한 파골세포의 특별한 표지자로 사용되고 있다.

파골세포의 전구체인 대식세포에 RANKL을 처리하였을 때, NF-κB와 MAPK kinase의 활성화를 보여 염증매개물질을 생성하며, 이중 염증성 사이토카인인 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인은 RANKL과 M-CSF와 함께 파골세포의 생성, 성숙과 활성, 효소생성을 크게 증가시키는 역할을 한다.

현재까지 류마티스의 치료제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 진통제(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID)가 널리 이용되고 있지만, 이를 장기간 투여하면 위장장애와 심혈관 관련질환, 신장장애등 여려가지 다양한 부작용이 있기 때문에 화학적 약재보다 부작용이 적고 흡수가 용이한 천연물에서 새로운 류마티스 치료제를 발견하려는 노력이 지속되고 있다.

관련 선행기술로는 한국등록특허 제10-1338516호 "다기능성 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 조성물" 및 한국등록특허 제10-1201549호 "두충 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강식품조성물"에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 아직까지는 곤충을 대상으로 유효성분을 추출해 내어 이를 포함하는 항류마티스제에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은 여러 곤충들 중 갈색거저리를 대상으로 에탄올로 추출하고 이의 현탁액을 제조하여, 이 현탁액이 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 나타냄으로서, 이를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로, 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액은 상기 조성물 1㎖를 기준으로 1000~3000㎍으로 포함되는 것이 특징이다.

또 다른 관점의 본 발명인 류마티스 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물은, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로, 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액은 상기 조성물 1㎖를 기준으로 1000~3000㎍으로 포함되는 것이 특징이다.

또 다른 과점의 본 발명인 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법은, 동결건조된 갈색거저리를 분쇄시키는 제1단계, 상기 제1단계에서 분쇄된 갈색거저리와 에탄올을 혼합하여 갈색거저리 혼합액을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계에서 제조된 갈색거저리 혼합액을 초음파 분쇄기로 미세화시키는 제3단계 및, 상기 제3단계에서 미세화된 갈색거저리 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과하여, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액을 제조하는 제4단계를 포함하는 것이 특징이다.

이때, 상기 에탄올 1ℓ당 분쇄된 갈색거저리 1∼3g을 혼합시키는 것이 특징이며, 상기 에탄올은 70~80% 에탄올인 것이 특징이다.

또한, 상기 제3단계의 갈색거저리 혼합액을 미세화시키는 단계는 초음파 분쇄기를 갈색거저리 혼합액에 20~30초간 작동시키는 것이 특징이다.

또한, 상기 제4단계의 원심분리는 4000~5000rpm에서 5~20분동안 이루어지는 것이 특징이다.

본 발명의 항류마티스제는 상기의 제조방법으로 제조된 갈색거저리 현탁액을 유효성분으로 포함하여, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 갖는 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 갖는 갈색거저리물의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 대상으로 RAW 264.7 세포의 생장능을 나타낸 도면이다.
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 2A는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 RANKL의 전사체에 대해 발현정도를 나타낸 도면이다.
CON(control): 아무것도 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 2B는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 M-CSF의 전사체에 대해 발현정도를 나타낸 도면이다.
CON(control): 아무것도 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 2C는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 MMP-9의 전사체에 대해 발현정도를 나타낸 도면이다.
CON(control): 아무것도 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 2D는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 cathepsin K의 전사체에 대해 발현정도를 나타낸 도면이다.
CON(control): 아무것도 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 3A는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 파골세포 분화 억제정도를 TRAP 염색을 통해 나타낸 도면이다.
CON(control): RANKL과 M-CSF를 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 3B는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 TRAP의 효소활성을 TRAP assay kit를 이용하여 나타낸 도면이다.
CON(control): RANKL과 M-CSF를 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 4는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 RANKL 단백질 발현정도를 나타낸 도면이다.
CON(control): 아무것도 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군
도 5는 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별로 처리하여 TNF-α단백질 생성정도를 나타낸 도면이다.
CON(control): 아무것도 처리하지 않은 음성대조군
OC(osteoclast differentiation): 파골세포
TME: 본 발명인 실시예1의 갈색거저리 현탁액 처리군
CLE: 양성대조군인 강황 현탁액 처리군

이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

현재까지 류마티스의 치료제로 사용되고 있는 비스테로이드성 진통제(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID)는 장기간 투여 시 위장과 신장의 기능저하를 일으키며 특히, 혈관을 확장시키는 PGE와 프로스타사이클린(prostacyclin)의 생성을 억제하여 심혈관과 관련된 심각한 부작용이 보고되고 있으므로 이용이 감소되고 있는 실정이다.

따라서 최근에는 이를 대체하기 위해서 천연물이 NSAID에 비해 생체에 잘 흡수되고 대사되므로 부작용이 좀 더 적을 것으로 판단하여, 천연허브 6종을 혼합하여 만든 신바로(shinbaro) 등과 같은 천연물에서 류마티스에 대한 치료제를 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

따라서 본 발명에서는 곤충 유래 천연물인 갈색거저리 현탁액을 대상으로 파골세포의 분화와 관련된 RANKL과 M-CSF, 뼈를 파괴하는 효소인 MMP-9과 Cathepsin K 및 TRAP, 파골세포의 분화와 통증과 관련된 염증성 사이토카인의 억제능을 확인한 바, 상기 갈색거저리 현탁액은 천연물 유래 류마티스 치료제로 개발될 수 있을 것이라 사료된다.

구체적으로 설명하면, 본 발명에서는 통상적으로 간질환에 효과가 있다고 알려진 갈색거저리(Tenebrio molitor)를 대상으로 파골세포의 분화억제를 통한 항류마티스효과에 대하여 확인하고자 한다.

다시말해, 갈색거저리는 아직까지 국내에서 애완동물의 사료로만 사용되고 있으며, 본 발명은 갈색거저리의 파골세포를 억제하는 효능에 대한 최초연구이다.

본 발명에서는 갈색거저리의 기능성 연구의 일환으로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 RANKL과 M-CSF를 처리하여 파골세포로 분화시키면서, 갈색거저리 현탁액을 처리하여 파골세포의 분화억제를 TRAP 염색과 분석, 파골세포에서 특이적으로 발현되는 효소의 유전자 발현, RANKL의 단백질 발현, 염증성 사이토카인 TNF-α의 억제를 확인하여 류마티스의 여러 발병원인 중에 하나로서 과도하게 생성되고 활성화된 파골세포에 대한 갈색거저리의 분화 억제 효능을 확인하였다.

이에 본 발명의 발명자는 상기와 같은 갈색거저리를 천연물질을 유효성분으로 하는 것으로 부작용의 문제가 발생되지 아니하여 류마티스 관절염을 치료하고 또는 예방하기 위하여도 널리 사용할 수 있을 것으로 판단하였다.

이에, 본 발명인 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 갖는 갈색거저리의 현탁액 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제 1단계; 갈색거저리 분쇄

우선, 본 단계에서는 갈색거저리(Tenebrio molitor)를 준비한다.

상기 갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목 거저리과의 곤충으로, 갈색쌀거저리 라고도 불리며 한국을 비롯하여 전 세계에 분포한다. 알, 유충, 번데기, 성충의 시기를 거치는 완전변태를 하는 곤충이며 현재 국내에 대량생산하고 있는 사육농가가 형성되어져 있다. 유충기간은 약 10주이나 인공 사육할 때에는 약 2주 정도이다.

갈색거저리는 다른 곤충들과 달리 변태기간이 비교적 짧기 때문에 애완용으로 많이 사육되며, 갈색거저리의 유충은 밀웜(mealworm)이라 하여 먹이곤충으로 이용되는데 이는 동물 중에서 단백질 함량이 높고 성장이 빠르며 번식률이 매우 높은 것으로 알려져 있다.

이렇게 준비된 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor)는 건조한 다음 분쇄하여 분말형태로 제조한다.

다시말해, 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor)에는 다량의 수분이 함유되어 있기 때문에 수분이 완전히 없는 상태로 만들기 위해서는 건조과정을 거쳐야 한다. 이때, 상기 갈색거저리가 함유하고 있는 유효성분들의 변화를 최소화시키기 위해 동결건조를 통해 건조를 하는 것이 좋다.

그 다음 하기 추출의 용이성을 위해 상기 건조된 갈색거저리는 분쇄기를 이용하여 분말형태로 제조된다.

2. 제 2단계; 갈색거저리(Tenebrio molitor) 혼합액 제조

본 단계에서는 상기 제조한 갈색거저리(Tenebrio molitor) 분말을 에탄올과 혼합하여 갈색거저리 혼합액을 제조한다.

이때, 에탄올과 분쇄된 갈색거저리 분말의 혼합비율은 특별히 제한되지 않으나, 상기 에탄올 1ℓ당 상기 분쇄된 갈색거저리 분말 1∼3g로 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어날 경우, 번거로운 농축이나 희석 과정을 거쳐 적정 농도로 조절하는 추가 과정을 수행해야하는 문제점이 있을 수 있다.

또한 상기 사용된 에탄올로는 어떠한 에탄올을 사용하여도 무관하나, 갈색거저리 내에 함유된 유효성분을 가장 적절히 추출할 수 있도록 70~80%의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

3. 제 3단계; 갈색거저리(Tenebrio molitor) 혼합액을 미세화시키는 단계

본 단계에서는 상기 갈색거저리 혼합액으로부터 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 가지는 유효성분을 추출하기 위한 단계로써, 통상적으로 알려진 초음파 분쇄기를 이용하여 특별한 제한없이 미세화시킬 수 있으나, 초음파 분쇄기를 갈색거저리 혼합액에 200~300jule의 에너지로 10~30초간 작동시키는 것이 바람직하다.

상기 초음파 분쇄기 적용 조건이 상기 범위를 벗어날 경우, 목적하는 유효성분의 추출이 이루어지지 않거나, 유효성분이 파괴되거나 변성되는 문제가 발생될 수 있다.

4. 제 4단계; 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액 제조단계

본 단계에서는 상기 미세화된 갈색거저리 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시켜 제조하는 단계로써, 최종적으로 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액이 제조되는 것이다.

이때, 상기 원심분리는 4000~5000rpm에서 5~20분동안 이루어지는 것을 특징으로, 상기 원심분리 적용 조건이 상기 범위를 벗어날 경우, 목적하는 유효성분이 파괴되거나 변성되는 문제가 발생될 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 갈색거저리 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 류마티스 관절염 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

구체적으로 설명하면, 상기 갈색거저리 현탁액은 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 갖는 것을 특징으로, 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 류마티스 관절염 예방 및 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 사용가능하며, 이때 상기 유효성분인 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액 함량은 상기 조성물 1㎖를 기준으로 1000~3000㎍으로 포함하는 것이 특징이다.

이는 하기 실험예에 뒷받침 되는 것으로써, 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액의 함량이 1000㎍미만으로 함유될 경우에는 파골세포 분화억제능이 떨어져 본 발명이 목적하는 항류마티스제로 사용하기 적합하지 않으며, 3000㎍초과로 함유될 경우에는 세포 생장에 영향을 주어 독성을 나타낼 우려가 있다.

이러한 상기 본 발명의 약학 조성물은 류마티스 관절염 예방 및 치료를 목적으로 항류마티스효과를 갖는 천연물의약품에 함유될 수 있다. 이때 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다. 즉, 이는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 선택될 수 있음을 의미한다.

상기 약학적으로 허용되는 담체로는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 관점에서의 본 발명에서는 상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액을 류마티스 관절염 예방 및 개선용을 목적으로 식품 조성물의 유효성분으로 포함한다. 즉, 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액을 식품 조성물의 유효성분으로 사용할 경우, 상기 그대로 사용하거나 다른 통상의 식품 조성물의 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

이러한 상기 식품용 조성물은 류마티스 관절염 예방 및 개선을 위한 목적으로 건강식품에 함유될 수 있으며 그 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육으로 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예 및 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 본 발명의 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리의 현탁액 제조

갈색거저리(Tenebrio molitor)는 고성곤충생태원(경남고성시)에서 사육된 것을 구매한 후, 이를 흐르는 물에 2회 세척하였다.

그 다음, 동결 건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 상기 세척한 갈색거저리를 건조시켜 수분을 제거하고 다기능 분쇄기(Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 갈색거저리 분말을 제조하였다.

상기 제조된 갈색거저리 분말 3g을 70% 에탄올 1ℓ에 넣고 혼합액을 제조한 후, 이 혼합액을 초음파 파쇄기(LabaX, MA, USA)로 230 jule, 20초간 파쇄하여 미세화시켰다.

상기 미세화시킨 갈색거저리 혼합액을 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 회수한 상층액을 0.25 μm 주사기 필터 (syringe filter/ Whatman, ND, USA)로 여과한 후 건조하여 갈색거저리 현탁액을 제조하였다.

<실시예 2> 본 발명의 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리의 현탁액을 포함하는 정제 제조

실시예 1의 갈색거저리 현탁액................3000 ㎍

유당........................................100 ㎎

전분........................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다

<실시예 3> 본 발명의 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리의 현탁액을 포함하는 건강식품 제조

실시예 1의 갈색거저리 현탁액.............3000 ㎍

비타민 혼합물..............................적량

비타민 A 아세테이트........................70 ㎍

비타민 E..................................1.0 ㎎

비타민 B1.................................0.13 ㎎

비타민 B2.................................0.15 ㎎

비타민 B6.................................0.5 ㎎

비타민 B12................................0.2 ㎍

비타민 C..................................10 ㎎

비오틴....................................10 ㎍

니코틴산아미드...........................1.7 ㎎

엽산......................................50 ㎍

판토텐산 칼슘............................0.5 ㎎

무기질 혼합물............................적량

황산제1철...............................1.75 ㎎

산화아연................................0.82 ㎎

탄산마그네슘............................25.3 ㎎

제1인산칼륨..............................15 ㎎

제2인산칼슘..............................55 ㎎

구연산칼륨...............................90 ㎎

탄산칼슘................................100 ㎎

염화마그네슘............................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 실험예 1> 본 발명의 갈색거저리 현탁액을 대상으로 파골세포 분화억제를 통한 항류마티스활성 확인

1. 실험방법

1) 세포생존율 분석

RAW 264.7 세포는 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 unit/ml과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum/ Gibco, MD, USA)이 함유된 배지(Dublecco's Modified Eagle Medium/ Gibco, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator/Thermo Scientific, IL, USA)에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 실시하였다.

세포 생존율 측정을 위해 RAW 264.7 세포를 2×10⁵ cells/ml로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 상기 실시예1의 갈색거저리 현탁액을 농도별(100, 500, 1000, 2000, 3000 μg/ml)로 처리 후 37°C, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다.

CellTiter 96^®aqueousnon-radio active cell proliferation assay reagent(Promega,WI,USA)를 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4시간 반응시켜 마이크로 플레이트 리더기(microplate reader/ Beckman Coulter, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

2) TRAP 염색 및 측정

파골세포의 분화와 기능의 마커인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)의 발현에 대한 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)의 효능을 검증하기 위해서 RANKL (Sigma, MO, USA) 50 ng/ml과 M-CSF 150 ng/ml 농도로 2×10⁵ cells/ml의 RAW 264.7 세포에 4일 동안 처리하여 파골세포로 분화를 유도시키면서 동시에, 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별(1000, 3000 μg/ml)로 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4일 동안 배양시켰다.

배양된 세포는 PBS(phosphate buffered salin/ Sigma, MO, USA)로 2회 세척 후 포름알데하이드(formaldehyde/ Sigma, MO, USA)를 이용하여 상온에서 5분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 TRAP staining kit (Cosmo bio, Japan)를 이용하여 36℃에서 한 시간 동안 TRAP 효소를 기질과 반응시켜 염색시킨 후 멸균수로 세척한 다음 DMI6000B 현미경(Leica, NJ, USA)을 이용하여 확인하였다.

TRAP의 효소 활성 검사는 염색과 동일 조건으로 파골세포로 분화시킨 RAW 264.7 세포에 대해 TRAP assay kit (Takara, Japan)을 이용하여 효소를 발색 시킨 후 microplate reader (Beckman Coulter, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

3) Real-time PCR 분석

파골세포의 분화와 기능과 관련된 유전자 전사(transcription)에 미치는 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)의 효과를 검증하기 위해서 real-time PCR을 수행하였다.

RANKL (Sigma, MO, USA) 50 ng/ml과 M-CSF (Sigma, MO, USA) 150 ng/ml 농도로 4일 동안 처리하여 RAW 264.7 세포를 분화시키고, 동시에 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)을 농도별(100, 1000, 3000 μg/ml)로 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4일 동안 배양하였다.

세포를 PBS로 2회 세척 후 트리졸 시약(trizol reagent/ Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 세포에서 총 RNA을 추출한 후, high capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, IL, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA는 Power SYBR^®GreenMaserMix (Applied Biosystems, IL, USA)를 이용하여 7500 Real-time Thermal Cycler (Applied Biosystems, IL, USA)를 통해 RANKL, M-CSF, MMP-9 및 Cathesin K 유전자를 증폭시켰으며, 이때 사용한 프라이머(primer)는 표 1에 나타내었다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase)를 내생(內生)의 대조군(endogenous control)으로 사용하여 GAPDH 대비 유전자들의 mRNA의 발현량을 ddCT 방법을 통해 상대정량 분석하였다.

Name	Sequences
GAPDH	Forward	5'-GCCTCACCCCATTTGATGTT-3'
	Reverse	5'-GGGAAGCCCATCACCATCT-3'
RANKL	Forward	5'-GTGGGGGAGAACGACAGTTT-3'
	Reverse	5'-AGGTGCTTTTCAGGGGAGAC-3'
M-CSF	Forward	5'-TTCAAGCTCTTTCTGAACCGTGTA-3'
	Reverse	5'-GCCTTGTTTTGTGCCATTAAGAAG-3'
MMP-9	Forward	5'-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3'
	Reverse	5'-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3'
Cathepsin K	Forward	5'-GGCCAACTCAAGAAGAAAAC-3'
	Reverse	5'-GTGCTTGCTTCCCTTCTGG-3'

4) Western blot 분석

파골세포의 분화와 생존에 관련된 RANKL 단백질 발현에 미치는 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)의 효과를 검증하기 위해 RANKL (Sigma, MO, USA) 50 ng/ml과 M-CSF (Sigma, MO, USA) 150 ng/ml 농도로 4일 동안 RAW 264.7 세포를 분화시키면서 동시에 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)을 100, 1000, 3000 μg/ml의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4일 동안 배양 후 세포에서 단백질을 분리하여 Western blot 분석을 수행하였다.

세포를 PBS로 2회 세척 후 셀 스크레이퍼(cell scraper/ SPL Life Science, Korea)로 모은 다음 Cytobuster^TM Protein Extraction Reagent(Novagen,ND,USA)를 이용하여 세포를 분쇄한 후, 12000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 회수하였다.

회수한 상층액은 Bio Rad Protein Assay (Bio Rad, CA, USA)로 농도를 측정하고 10 μg/ml의 농도로 맞춘 후 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 후 PVDF 멤브레인 (GE Healthcare, NJ, USA)에 이동(transfer)하고, Blotting Grade Blocker (Bio Rad, CA, USA)를 TBST에 녹여 5%의 농도로 만든 다음 이를 이용하여 PVDF membrane을 1시간 동안 상온에서 블로킹(blocking)시켰다.

1차 항체 RANKL (Santa Cruz, CA, USA)은 1:500으로, β-Actin (Sigma, MO, USA)은 1:10000의 비율로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후 다음날 TBST로 15분씩 4번 세척하였다. 2차 항체 HRP-conjugated secondary antibody (Promega, WI, USA)는 1:3000의 비율로 40분 동안 상온에서 반응 시킨 후 다시 TBST로 15분씩 4번 세척하였다. Western Lightning^® PlusECL(Perkin Elmer, MA, USA)을 PVDF membrane에 처리 후 암실에서 X-ray 필름(Fujifilm, Japan)으로 감광시켜 RANKL의 단백질 발현량을 확인하였다.

5) TNF-α생성량 분석

활성화된 파골세포에서 분비하는 염증성 사이토카인 TNF-α의 생성에 미치는 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)의 효과를 확인하기 위해 RANKL (Sigma, MO, USA) 50 ng/ml과 M-CSF (Sigma, MO, USA) 150 ng/ml 농도로 RAW 264.7 세포를 분화시키면서 동시에 본 발명의 갈색거저리 현탁액(TME)을 100, 1000, 3000 μg/ml의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4일 동안 배양 후 배양액을 회수하여 TNF-α의 생성량 분석을 ELISA kit (Promega, WI, USA)를 이용하여 microplate reader (Beckman Coulter, CA, USA)를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2. 실험결과

1) 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 세포독성 활성확인

본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 RAW 264.7 대식세포에 농도별(100, 500, 1000, 2000 및 3000 μg/ml)로 처리한 후 MTS((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)) assay로 세포 생존율을 확인하였다.

양성대조군으로는 기존에 파골세포의 분화를 억제하는 것으로 보고된 강황(C. longa)을 사용하였으며, 이때 강황은 본 발명의 실시예 1과 같은 방법을 적용하여 본 발명의 대조군(CLE)으로 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타나 있듯이 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)은 3000 μg/ml의 농도까지 세포 생장에 영향을 주지 않아 독성이 없음을 확인하였으며, 양성대조군인 강황 현탁액(CLE)은 1000 μg/ml의 농도까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME) 및 강황 현탁액(CLE)의 최고 농도는 각각 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 3000 및 1000 μg/ml로 사용하였다.

2) 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 처리가 파골세포 관련 유전자에 미치는 영향 분석

본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 파골세포 분화 억제 효능을 분석하기 위해 RAW 264.7 세포에 RANKL과 M-CSF로 파골세포 분화 유도와 동시에 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME) 처리하고 파골세포의 분화와 생존에 관련된 전사체 수준에서 real-time PCR로 확인하였다.

그 결과 도 2A 내지 도 2D에 나타나 있듯이, 파골세포의 분화와 생존에 중요한 요소인 RANKL과 M-CSF 및 파골세포의 뼈를 파괴하는 기능 및 특이적인 마커로 알려진 효소인 MMP-9(matrix metallopeptidase-9)과 카텝센 K(cathepsin K)의 전사체 발현은 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소됨을 확인 할 수 있었다.

다시말해, NF-κB 패밀리 구성원인 RANKL은 M-CSF와 함께 조골세포나 활성화된 T 세포에서 분비되어, 대식세포의 각각의 수용체에 결합하면 발현되는 유전자이며, 이 유전자의 과도한 발현은 파골세포를 대량 생성시켜 류마티스와 연관이 있다고 생각되고 있으며, MMP-9 효소는 아연결합 엔도펩티다아제(zinc-binding endopeptidase) 패밀리의 구성원으로서, 뼈의 세포지지조직(extra cellular matrix)과 구성성분인 젤라틴(gelatin)을 분해하는 역할을 한다. 파골세포에서 가장 먼저 발견되어 동정된 cathepsin K는 파골세포의 주요 효소 중 하나로서 여러 카텝신(cathepsin) 효소 구성원 중 파골세포에서 특이적으로 높게 발현되며, 뼈와 연골의 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)을 분해하는 기능을 수행하는 효소이다.

또한 이들 MMP-9과 cathepsin K는 성숙한 파골세포에서만 발견되기 때문에 파골세포의 특별한 마커로서 보고되어 있다.

따라서, 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)은 대식세포가 파골세포로 분화되는 것을 막아주며, 파골세포의 뼈를 파괴하는 효소를 억제하여 과도하게 활성된 파골세포의 생성과 기능을 억제하여 류마티스에 효과가 있을 것으로 사료된다.

3) 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 처리로 인한 TRAP 억제 확인

본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)이 파골세포의 효소 중에 뼈를 산화시켜 파괴하는 역할 및 파골세포의 마커로서 사용되는 효소인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 TRAP 염색과 TRAP assay을 통해 확인하였다.

RANKL과 M-CSF로 파골세포 분화 유도 동시에 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)를 (100, 1000, 3000 μg/ml)로 처리하고 4일 후 TRAP을 염색하여 확인하였다.

그 결과 도 3A에 나타나 있듯이, RANKL과 M-CSF를 처리하지 않은 음성대조군은 TRAP염색이 전혀 되지 않았으며, 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME) 처리 시 농도 의존적으로 파골세포의 분화를 억제함을 TRAP 염색을 통해 확인하였다.

또한, TRAP의 효소활성을 TRAP assay kit를 이용하여 확인한 결과, 도 3B에 나타나 있듯이, TRAP효소 활성은 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME) 처리에 따라 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다.

따라서 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)은 TRAP의 생성을 억제하여 뼈를 파괴하는 기능을 억제하여 류마티스에 대한 치료제로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

3) 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 처리로 인한 RANKL 단백질 발현 억제 확인

본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)에 의한 파골세포의 분화와 생존을 위해 필수적인 RANKL의 단백질 발현 억제를 확인하기 위해, RANKL과 M-CSF로 분화 유도시킨 RAW 264.7 세포에 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 100, 1000, 3000 μg/ml의 농도로 처리한 후 RANKL의 단백질 발현을 Western blot 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 도 4에 나타나 있듯이, RANKL 단백질은 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME) 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 3000 μg/ml의 TME 처리시 단백질 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다.

따라서 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)은 전사체 뿐만 아니라 단백질 수준에서도 RANKL을 억제하여 과도한 파골세포 분화를 억제할 것으로 사료된다.

4) 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 처리로 인한 TNF-α 단백질 생성 억제 확인

성숙한 파골세포는 염증성 사이토카인을 비롯한 다양한 사이토카인을 분비하는 것으로 보고되어 있으며, 염증성 사이토카인인 TNF-α는 수용체에 부착하여 염증성 사이토카인, 통증을 생성하는 PGE2 등 다양한 염증매개물질을 분비하며, 파골세포의 생성과 분화를 촉진한다고 보고되어 있다.

본 발명에서는 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)의 처리로 인한 TNF-α 단백질 생성 억제를 확인하기 위해, RANKL과 M-CSF로 분화 유도시킨 RAW 264.7 세포에 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)을 100, 1000, 3000 μg/ml의 농도로 처리한 후 TNF-α의 단백질 생성량을 ELISA를 통해 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타나 있듯이, TNF-α 단백질은 TME 처리에 따라 최저농도인 100 μg/ml부터 크게 감소하였으며, 특히 최고 처리 농도인 3000 μg/ml의 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME) 처리 시 TNF-α 단백질 생성이 가장 높게 감소된 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명인 실시예 1의 갈색거저리 현탁액(TME)은 TNF-α의 생성을 억제를 통해 과도한 파골세포의 생성을 억제하고 염증매개물의 생성을 억제하는 효과가 사료된다.

이와 같이 본 발명의 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액은 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 나타냄으로써 이들을 유효성분으로 포함하여, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 류마티스 관절염 예방 및 개선용 식품조성물을 제공할 수 있게 된다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액을 유효성분으로 포함하는,
   류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액은 상기 조성물 1㎖를 기준으로 1000~3000㎍으로 포함되는 것이 특징인,
   류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
3. 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스 효과를 나타내는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액을 유효성분으로 포함하는,
   류마티스 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 갈색거저리(Tenebrio molitor) 현탁액은 상기 조성물 1㎖를 기준으로 1000~3000㎍으로 포함되는 것이 특징인,
   류마티스 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
5. 동결건조된 갈색거저리를 분쇄시키는 제1단계;
   상기 제1단계에서 분쇄된 갈색거저리와 에탄올을 혼합하여 갈색거저리 혼합액을 제조하는 제2단계;
   상기 제2단계에서 제조된 갈색거저리 혼합액을 초음파 분쇄기로 미세화시키는 제3단계 및,
   상기 제3단계에서 미세화된 갈색거저리 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시며, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액을 제조하는 제4단계를 포함하는,
   항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 에탄올 1ℓ당 분쇄된 갈색거저리 1∼3g을 혼합시키는 것이 특징인,
   항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 제2단계의 상기 에탄올은 70~80% 에탄올인 것이 특징인,
   항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법.
   
8. 제5항에 있어서,
   상기 제3단계의 갈색거저리 혼합액을 미세화시키는 단계는 초음파 분쇄기를 갈색거저리 혼합액에 10~30초간 작동시키는 것이 특징인,
   항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법.
   
9. 제5항에 있어서,
   상기 제4단계의 원심분리는 4000~5000rpm에서 5~20분동안 이루어지는 것이 특징인,
   항류마티스효과를 갖는 갈색거저리 현탁액의 제조방법.
   
10. 제5항 내지 제9항 중 선택된 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 갈색거저리 현탁액을 유효성분으로 포함하여, 파골세포 분화억제를 통해 항류마티스효과를 갖는 것이 특징인,
    항류마티스제.
    
    
    

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