KR20160124970A

KR20160124970A - 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물 및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20160124970A
Application number: KR1020150055275A
Authority: KR
Inventors: 윤은영; 황재삼; 김미애; 이영보; 윤영일
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2016-10-31
Also published as: KR101730065B1

Abstract

본 발명은 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지(Gametis jucunda)를 용매로 추출하여 수득되는 것을 특징으로, 또 다른 관점에서는 상기 풀색꽃무지 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성질환 예방 및 치료용 약학조성물 또는 염증성 질환 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항염증활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물 및 이를 포함하는 조성물은 곤충유래 천연자원으로서 세포독성이 없어 안전성이 우수할 뿐만 아니라 염증 관련 인자의 발현을 억제하여 항염증 효과을 가짐으로써 다양한 질병의 원인이 되는 염증의 예방 및 치료제로서 사용이 가능하다.

Description

항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물 및 이를 함유하는 조성물{An Extract of Gametis jucunda Having Anti-inflammatory and Immuno-modulating Activity and Composition Comprising the Same}

본 발명은 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 풀색꽃무지(Gametis jucunda)를 용매로 추출하여 수득되는 풀색꽃무지 추출물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 상처와 외부 이물질의 침입 시 생체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 선천성 면역(innate immunity) 반응이며(비특허문헌 8), 염증의 작용과 기간에 따라 급성염증과 만성염증 반응으로 나눌 수 있다.

급성염증 반응은 외부 이물질로 인한 자극에 의해 대식세포(macrophage)가 활성화되어 생성된 염증매개물질인 염증성 사이토카인(cytokine), chemokine, nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 등을 생성하여 이들에 의해 활성화된 백혈구와 대식세포에 의해 이물질을 제거한 후 조직재생을 통해 종료된다(비특허문헌 1).

급성염증 반응은 생체를 방어하기 위한 필수적인 반응이지만, 이 반응에서 과도하게 분비된 염증매개물질은 과도한 혈관확장으로 급성 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있으며, 면역세포의 지속적인 생존과 활성을 일으켜 만성염증이나 면역과민반응의 원인이 되어 류마치스 관절염과 같은 만성염증성질환 및 자가면역질환으로 발전될 수 있으므로(비특허문헌 8, 10, 11, 13), 염증반응 조절은 생명현상 유지를 위해 매우 중요하다.

면역세포에는 대식세포, 단핵구, 백혈구 및 비만세포 등이 있으며, 이 중 대식세포는 모든 조직에 존재하며 체내 유입된 염증의 원인을 가장 먼저 인식한 후 염증매개물질을 생성하여 다른 면역세포의 활성화 및 주화성을 유도시켜 염증원인을 제거하고 염증부위를 복구시키는 등 염증과정에 필수적인 역할을 수행한다.

PAMPS(Pathogen-associated molecular patterns)에 속해있는 그람 음성세균의 세포벽 성분인 LPS 처리시 대식세포 표면에 있는 TLR-4(toll like receptor-4)가 이를 인식한 후 TIR(Toll/IL-1 receptor domain)과 MYD88(myeloid differentiation primary response gene 88)로 신호를 전달하여 활성화된 MYD88 단백질은 IRAK-4(IL-1 receptor associated kinase-4)를 TLR-4에 결합시키고 TRAF-6(TNF receptor associated factor-6)를 유도시킨다.

TRAF-6는 IκK(I kappaB kinase)를 활성화시켜 세포질에 존재하는 전사인자인 NF-κB p50/p65에 결합되어 있는 IκBα가 분해되어 NF-κB p50/p65는 핵으로 이동된다. 핵으로 이동된 NF-κB p50/p65 전사인자는 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6와 염증성 효소인 iNOS 및 COX-2를 발현시킨다(비특허문헌 1, 2, 3, 9, 12)

TNF-α는 내분비와 외분비를 통해 자신과 다른 대식세포의 TNF-α 수용체(TNFR)에 리간드(ligand)로 결합하여 NF-κB p50/p65를 활성화시켜 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6와 iNOS, COX-2를 발현시킨다(비특허문헌 1, 2, 7, 9).

IL-6는 JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription) 신호전달과정을 활성화시켜 백혈구와 후천성 면역(acquired immunity)과 관련된 림프구인 T 및 B 세포를 자극하여 급성염증을 만성염증으로 전환시킨다(비특허문헌 5, 15).

NO는 iNOS에 의해 생성되며 정상적인 상태에서는 방어작용과 신경전달물질 및 혈관 조절 등의 기능을 하지만 염증과정에서 대량 생성된 NO는 급성 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있으며 강한 독성을 갖고 있어 다양한 세포 및 조직에 손상을 일으켜 만성염증과 자가면역질환의 원인이 된다(비특허문헌 12, 14).

COX-2는 세포막의 인지질에서 유래한 아라키돈산(arachidonic acid)을 PGE2로 전환시켜 혈관확장과 투과성을 증가시키고, 감각신경세포에 작용하여 통증을 생성시키는 등 염증 반응에 매우 중요한 역할을 수행한다(비특허문헌 4, 6, 16).

풀색꽃무지(Gametis jucunda)는 딱정벌레목 풍뎅이과 꽃무지아과의 완전변태 곤충으로 농장물에 해를 끼치는 해충으로 분류되어 방제의 목적으로만 연구가 진행되어 있으며, 기능성에 대한 연구는 아직까지 전무한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 곤충 기능성 연구의 일환으로 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에 풀색꽃무지 에탄올 추출물을 처리하여 항염증 효능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물 및 이를 함유하는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지(Gametis jucunda)를 에탄올로 추출하여 수득되는 것이 특징이다.

상기 풀색꽃무지 추출물은 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 염증발현 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, NF-kB p65의 활성화를 억제하는 것이 특징이다.

본 발명의 염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 상기 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.

상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 특징이다.

상기 약학 조성물에는 통상적으로 사용되는 담체, 부형제 또는 희석제가 추가로 포함되는 것이 특징이다.

상기 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지가 1000 내지 2000㎍/㎖로 함유되어 있는 것이 특징이다.

본 발명의 염증성 질환 예방 및 개선용 식품 조성물은 상기 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물을 유효성분으로 함유하며, 상기 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지가 1000 내지 2000㎍/㎖로 함유되어 있는 것이 특징이다.

본 발명에 따른 항염증활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물을 포함하는 조성물은 곤충유래 천연자원으로서 세포독성이 없어 안전성이 우수할 뿐만 아니라 염증 관련 인자의 발현을 억제하여 항염증 효과를 가짐으로써 다양한 질병의 원인이 되는 염증의 예방 및 치료제로서 사용이 가능하다.

도 1은 풀색꽃무지 추출물을 RAW264.7세포에 농도별로 처리한 후 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 2는 풀색꽃무지 추출물을 처리하여 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 억제효과를 real-time PCR 수행 후 ddCT 방법을 통해 상대정량 분석하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.
(A) TNF-α mRNA
(B) IL-6 mRNA
도 3은 풀색꽃무지 추출물을 처리하여 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 억제효과를 ELISA 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
(A) TNF-α protein
(B) IL-6 protein
도 4는 풀색꽃무지 추출물을 처리하여 NF-κB p65의 활성화 억제효과를 나타낸 도면이다.
도 5는 풀색꽃무지 추출물을 처리하여 iNOS와 COX-2의 억제효과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 풀색꽃무지(Gametis jucunda)의 새로운 가치를 찾기 위해 다양한 질병의 원인이 되는 염증에 대한 효능을 확인함으로써 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물 및 이를 포함하는 조성물을 제공하게 된다.

먼저, 상기 항염증활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다.

설명하면, 풀색꽃무지(Gametis jucunda)를 동결건조시켜 수분을 제거한 후, 분쇄하여 분말형태로 제조한 다음 이 분말중량의 2~10배에 달하는 부피의 용매를 가하여 용해시킨 후 초음파 추출방법을 사용하여 추출한 다음, 원심분리하여 풀색꽃무지 추출물을 수득할 수 있다. 이때 상기 용매로는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합 용매를 사용하며, 바람직하게는 에탄올을 사용하나, 이에 제한되지 않는다.

상기의 제법으로 수득된 본 발명의 풀색꽃무지 추출물은 LPS로 염증이 유도된 세포를 대상으로 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 억제능과 염증발현 단백질(시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS))의 발현 억제능 및 NF-kB p65의 활성화 억제능을 확인한 결과, 우수한 항염증 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이에, 본 발명은 상기와 같이 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성질환 예방 및 치료용 약학조성물 또는 염증성 질환예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다.

이때, 상기 조성물의 유효성분인 상기 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지가 1000 내지 2000㎍/㎖로 포함되는 것을 특징으로, 바람직하게는 2000㎍/㎖로 포함되는 것이 좋다. 이는 상기 풀색꽃무지가 1000㎍/㎖ 미만으로 포함될 경우, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 억제능이 낮게 나타나 목적하는 항염증효과를 얻기에 미흡하며, 2000㎍/㎖를 초과하여 포함될 경우에는 세포독성이 나타날 수 있어 오히려 염증 예방 및 치료제로서의 사용이 어렵게 될 우려가 있기 때문이다.

이와 같이, 본 발명의 상기 약학 조성물을 염증성 질환 예방 및 치료의 목적으로 사용될 경우, 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증질환과 같은 염증관련 질환들을 예방 및 치료할 수 있게 된다. 이때, 상기 조성물에는 조성물 총 중량에 대하여 풀색꽃무지 추출물이 0.01 내지 50 중량%로 포함되는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 0.1~20중량%를 함유하는 것이 좋다. 이는 상기 풀색꽃무지 추출물이 0.01 중량%미만으로 함유되는 경우 항염증효과가 떨어져 본 발명이 목적하는 항염증용으로 사용하기 적합하지 않으며, 50 중량%를 초과하여 함유되는 경우 오히려 사용되는 유기용제로 인한 악영향이 발생될 우려가 있기 때문이다.

또한, 상기 약학조성물에는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 추가하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다. 즉, 이는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 선택될 수 있음을 의미한다.

상기 약학적으로 허용되는 담체로는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌실내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 관점에서 본 발명의 상기 풀색꽃무지 추출물을 염증성 질환 예방 및 개선의 목적으로 식품 조성물의 유효성분으로 사용될 경우에는 상기 풀색꽃무지 추출물을 상기 그대로 사용하거나 다른 통상의 식품 조성물의 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강, 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품용 조성물 제조시에는 유효성분의 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다.

그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

이러한 상기 식품 조성물은 염증개선 및 예방을 위한 목적으로 건강식품에 함유될 수 있으며 그 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육으로 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 풀색꽃무지 추출물 제조

풀색꽃무지는 용인 처인구 백암면에서 채집된 풀색꽃무지(Gametis jucunda)를 사용하였다.

상기 풀색꽃무지는 우선 흐르는 물에 2회 세척한 후, 동결건조기(Eyela, japan)을 이용하여 건조시켜 수분을 제거한 후, 이를 다기능 분쇄기(Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 풀색꽃무지 분말을 수득하였다.

이렇게 수득된 풀색꽃무지 분말은 70%에탄올에 용해시킨 후 초음파 파쇄기(LabaX, MA, USA)로 230 jule의 세기로 20초간 파쇄 후 4500rpm에서 10분동안 원심분리시킨 후, 상층액을 얻어 0.25㎛ syringe filter(Whatman, ND, USA)로 여과 후 건조하여 본 발명의 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE)을 제조하였다.

< 실험예 1> 풀색꽃무지 추출물의 세포독성여부 확인

상기 실시예1의 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, 이하GJE라 함)을 RAW 264.7 대식세포에 농도별(100, 500, 1000, 2000 μg/ml)로 처리한 후 MTS assay로 세포 생존율을 확인하였다.

1) 실험방법

RAW264.7세포는 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin) 100unit/㎖과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; Gibco,MD,USA)이 함유된 Dublecco's Modified Eagle Medium (Gibco, MD, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator; Theromo Scientific, IL, USA)에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 실시하였다.

세포 생존율을 측정하기 위하여 RAW264.7세포를 2×10⁵cell/㎖로 96 well plate에 분주하고 실시예 1에서 제조된 풀색꽃무지 추출물을 농도별(100, 500, 1000, 2000㎍/㎖)로 처리 후, 대조군으로는 항염증물질로 잘 알려진 강황추출물(상기 실시예1과 같은 방법으로 추출하여 수득함)을 사용하여, 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 24시간동안 배양하였다.

CellTiter 96^®aqueousnon-radioactive cell prolife ration assay regent(Promega, WI, USA)를 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂incubator에서 4시간 반응시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Beckman Coulter,CA,USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

2) 실험결과

도 1에 나타나 있듯이, 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE)는 2000 μg/ml의 농도까지 세포 생장에 영향을 주지 않아 독성이 없음을 확인하였다.

또한, 본 실험에서는 기존에 항염증 효능이 보고된 강황(C. longa)을 양성대조군으로 사용하였으며, 강황은 본 실험에서 사용한 풀색꽃무지 시료와 동일한 방법으로 에탄올 추출물(CLE) 제조 후 1000 μg/ml의 농도까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, 하기의 실험들에서 사용한 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE) 및 강황추출물(CLE)의 최고 농도는 각각 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 2000 및 1000 μg/ml로 사용하였다.

< 실험예 2> 풀색꽃무지 추출물의 염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향분석

풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE)의 항염증 효능을 분석하기 위해 RAW 264.7 세포에 LPS로 염증 유도 후 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE)를 처리하고 염증성 사이토카인의 발현을 전사체 및 단백질 수준에서 각각 real-time PCR 및 ELISA에 의해 확인하였다

1) 실험방법

① Real-time PCR 분석

염증성 사이토카인 유전자의 전사(transcription)에 미치는 풀색꽃무지 추출물의 효과를 검증하기 위해서 real-time PCR을 수행하였다. 100ng/㎖의 LPS(Sigma,MO,USA)로 RAW264.7 세포를 자극하고, 상기 실시예1의 풀색꽃무지 추출물을 농도별로 (100, 500, 1000, 2000㎍/㎖)로 처리하였으며, 대조군으로는 강황추출물을 세포독성을 나타내지 않는 1000㎍/㎖의 농도로 사용하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간동안 배양하였다.

세포를 PBS로 2회 세척 후 trizol reagent(Invitrogen,CA,USA)를 이용하여 세포에서 총 DNA을 추출한 후 high capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems,IL,USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA는 Power SYBR^® GreenMasenMix(Applied Biosystems,IL,USA)를 이용하여 7500 real-time Thermal Cycler(Applied Biosystems,IL,USA)를 통해 TNF-α 및 IL-6 유전자를 증폭시켰으며, 이때 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.

Primer 이름	Sequence
GAPDH	Forward	5'-GCCTCACCCCATTTGATGTT-3'
GAPDH	Reverse	5'-GGGAAGCCCATCACCATCT-3'
IL-6	Forward	5'-TTGGGAGTGGTATCCTCTGT-3'
IL-6	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'
TNF-α	Forward	5'-ACAGCACCGCAGTACCTGAG-3'
TNF-α	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'

GAPDH(Glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase)를 endogenous control로 사용하여 GAPDH 대비 TNF-α 및 IL-6 mRNA의 발현량을 ddCT 방법을 통해 상대정량 분석하였다.

② ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석

TNF-α 및 IL-6과 같은 염증성 사이토카인 생성에 미치는 풀색꽃무지 추출물의 효과를 검정하기 위해서 100ng/㎖의 LPS로 RAW264.7세포를 자극하고, 상기 실시예1의 풀색꽃무지 추출물을 농도별로(100, 500, 1000, 2000㎍/㎖)로 처리하였으며, 대조군으로는 강황추출물을 세포독성을 나타내지 않는 1000㎍/㎖의 농도로 처리하여, 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간동안 배양하였다.

이 후 배양액을 회수하여 TNF-α 및 IL-6 ELISA kit(Thermo Scientific,IL,USA)을 이용하여 TNF-α 및 IL-6의 사이토카인 생성량을 microplate reader(Beckman Coulter,CA,USA)를 통해 450nm의 파장에서 측정하였다.

2) 실험결과

도 2, 3에 나타나 있듯이, PAMPS의 일종인 LPS 처리시 대식세포 표면에 존재하는 TLR-4가 이를 인식하고 활성화되어 염증매개물질 중에 하나인 TNF-α와 IL-6를 발현시키므로 우선 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6에 대한 발현량을 전사체 수준에서 확인하였다.

즉, TNF-α와 IL-6 모두 LPS 단독처리군보다 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE) 동시처리시 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

또한, 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE)은 양성대조군으로 사용된 강황 추출물 보다 500 μg/ml 저농도에서도 억제함을 확인하였으며, 이 결과는 ELISA를 이용하여 단백질 발현량을 확인한 결과와 일치하는 것을 확인 할 수 있었다(도 3).

TNF-α는 내분비와 외분비를 통해 자신과 다른 대식세포의 TNF-α 수용체(TNFR)에 리간드(ligand)로 결합하여 NF-κB p50/p65를 활성화시켜 염증성 매개물질인 TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2를 발현시키며, 과도하게 분비되면 세포와 조직의 기능을 상실시킨다. IL-6는 JAK-STAT (Janus kinase-signal transducer and activator of transcription) 신호전달과정을 통해 염증매개물을 생성시키며, 백혈구와 후천성 면역(acquired immunity)과 관련된 림프구인 T 및 B 세포를 자극하여 급성염증을 만성염증으로 전환시킨다. 따라서, 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE)은 염증성사이토카인을 억제하는 항염증 효능을 갖고 있으므로, 항염증 제제로서 이용이 가능할 것으로 기대된다.

<실험예 3> 풀색꽃무지 추출물의 NF-κB p65 활성화 억제 확인

1) 실험방법

LPS에 의해 활성화되는 염증관련 전사인자 NF-κB p65에 대한 풀색꽃무지 추출물의 효능을 검증하기 위하여 LPS(Sigma, MO, USA) 100ng/㎖의 농도로 RAW264.7 세포를 자극하고, 실시예1의 풀색꽃무지 추출물을 농도별(100, 500, 1000, 2000㎍/㎖)로 처리한 후 37℃, 5% CO₂incubator에서 1시간동안 배양하였다.

배양된 세포는 PBS(phosphate buffered saline,Sigma,MO,USA)으로 2회 세척 후 포름알데하이드(Sigma,MO,USA)를 이용하여 상온에서 25분동안 세포를 고정시켰다.

고정된 세포는 계면활성제인 0.01% Triton X-100(Sigma,MO,USA)을 이용하여 항체의 세포막 투과성을 증대시킨 다음 5% 말혈청(horse serum; Vector Labs,CA,USA)을 이용하여 상온에서 1시간 동안 저해(blocking) 과정을 수행하였다.

NF-κB p65 1차 항체(Santa Cruz,CA,USA)를 1:1000의 비율로 희석하여 4℃에서 밤새 배양 후 상온에서 PBS로 10분씩 4회 세척하고 1:2000의 비율로 희석한 2차 항체 alexa fluor 488(Molecular Probes,MD,USA)로 2시간 동안 상온에서 반응시켰다.

반응된 세포는 PBS로 상온에서 10분씩 4회 세척 후 VECTA SHIELD(Vector Labs,CA,USA)용액과 함께 슬라이드글라스에 부착시켜 DMI6000B 형광현미경(Leica,NJ,USA)을 이용하여 확인하였다.

2) 실험결과

실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE) 처리 후 LPS 및 TNF-α에 의해 활성화되며 신호전달과정에서 염증매개물질의 상류에 존재하는 전사인자 NF-κB p65의 활성화 억제 여부를 확인하기 위해 LPS로 염증 유도된 RAW264.7세포에 풀색꽃무지 추출물을 농도별(100, 2000㎍/㎖)로 처리 후 면역형광염색을 통해 NF-κB p65의 세포 내 위치를 확인하였다.

NF-κB p65는 염증이 유도되지 않을 경우에는 IκBα와 결합된 상태로 세포질에 존재하여 염증매개물질관련 유전자 전사를 활성화시킬 수 없지만, LPS 및 TNF-α에 의한 신호전달이 활성화 되면 IκBα가 분해되고 NF-kB p65가 핵으로 이동하여 염증매개물질 유전자의 프로모터에 존재하는 NF-kB element에 결합하여 전사를 활성화 시킨다.

이에, 도 4에 나타나 있듯이, 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 2000 μg/ml 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE) 처리 후 NF-κB p65 항체로 면역형광염색 결과, NF-κB p65는 대부분 핵으로 이동되지 않고 세포질에 존재하였으므로 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE)에 의해 NF-κB p65 활성화가 억제되었음을 확인할 수 있었다.

또한, NF-κB p65 활성이 억제되었으므로 IL-1β와 같은 다른 염증성 사이토카인이나 면역세포의 주화성을 증가시키는 케모카인(chemokine)과 혈관확장을 시키는 브래디키닌(bradykinin) 등의 염증매개물의 생성도 추가 차단할 것이라 사료된다.

< 실험예 4> 풀색꽃무지 추출물의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 확인

1) 실험방법

염증성 효소인 iNOS와 COS-2의 생성에 미치는 풀색꽃무지 추출물(Gametis jucunda ethanol extract, GJE)의 효과를 검증하기 위해 100ng/㎖ 농도의 LPS로 염증 유도된 RAW264.7세포에 풀색꽃무지 추출물을 100, 500, 1000, 2000㎍/㎖의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양 후 세포에서 단백질을 분리하여 Western blot분석을 수행하였다.

세포를 PBS로 2회 세척 후 cell scraper(SPL Life Science,Korea)로 모은 다음 Cytobuster™Protein Extraction Reagent(Novagen,ND,USA)를 이용하여 세포를 분쇄한 후 12000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다.

회수한 상층액은 Bio Rad Protein Assay(Bio Rad,CA,USA)로 농도를 측정하고 10㎍/㎖의 농도로 맞춘 후 10% SDS-PAGE를 수행하였으며, 전기영동 후 PVDF membrane(GE Healthcare,NJ,USA)에 이동(transfer)하고 Blotting Grade Blocker(Bio Rad,CA,USA)를 TBST에 녹여 5%의 농도로 만든 다음 이를 이용하여 PVDF membrane을 1시간 동안 상온에서 blocking시켰다.

1차 항체 COX-2(Santa Cruz,CA,USA)와 iNOS(Abcam,MA,USA)는 1:1000으로 β-Actin(Sigma,MO,USA)은 1:10000의 비율로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후 다음날 TBST로 15분씩 4번 세척하고, 2차 항체 HRP-conjugated secondary antibody(Promega,WI,USA)는 1:3000의 비율로 40분 동안 상온에서 반응시킨 후 다시 TBST로 15분씩 4번 세척하였다.

Western Lightning^®Plus ECL(Perkin Elmer,MA,USA)을 PVDF membrane에 처리 후 암실에서 X-ray필름(Fujifilm,Japan)으로 감광시켜 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량을 확인하였다.

2) 실험결과

LPS 처리시 대식세포 표면에 있는 TLR-4 (toll like receptor-4)에 의해 활성화되어 발현되는 염증성 효소인 iNOS와 COX-2의 발현 억제를 통한 항염증 효능을 확인하기 위해, LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE)를 100, 500, 1000, 2000 μg/ml의 농도로 처리한 후 iNOS와 COX-2 단백질 발현량을 Western blot 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타나 있듯이, iNOS와 COX-2 단백질 모두 2000 μg/ml 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE) 처리시 단백질 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다.

NO는 염증반응에서 혈관확장과 외부 이물질에 대한 방어 기능을 수행하지만, 염증성 사이토카인에 의해 과도하게 분비된 NO는 DNA손상, 염증매개물 과다 생성을 통한 염증 증폭, 과도한 혈관확장으로 인한 패혈성 쇼크, 강한 세포독성으로 인한 세포 및 조직 괴사, 기능장애 등을 일으켜 만성염증 및 자가면역질환의 원인이 될 수 있다.

또한 NO는 COX-2와 함께 혈관신생(angiogenesis) 효과를 통해 종양생성에도 밀접한 관계가 있음이 보고되었다.

염증반응에서 생성된 NO는 iNOS 생성량을 통해 간접적으로 확인할 수 있으므로, 본 실험에서는 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE) 처리 후 Western blot 분석을 통해 iNOS 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과 2000 μg/ml 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE) 처리시 iNOS가 거의 발현되지 않음을 확인할 수 있었으며, iNOS의 발현은 LPS에 의한 NF-kB p65의 활성화에 의해 유도되기 때문에 이 농도에서 NF-kB p65의 활성이 차단되어 iNOS의 발현 감소가 이루어진 것으로 추정되었다(도 5).

NF-kB p65와 NO에 의해 생성된 COX-2는 염증과정에서 인지질을 대사시켜 생성된 아라키돈산에서 PGE2를 생성시키는 효소이고, COX-2에 의해 생성된 PGE2는 혈관확장, 통증 및 발열작용을 수행한다.

염증 유도된 RAW 264.7 세포에 2000 μg/ml 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE)처리시 COX-2가 감소된 이유는 이 농도에서 NF-kB p65의 활성화 억제를 통해 TNF-α 및 NO를 생성하는 효소인 iNOS 단백질 발현이 현저히 감소되었기 때문으로 사료된다.

비스테로이드성 진통제(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID)의 일종인 아스피린과 인도메타신(indomethacin)이 COX-2의 발현 억제를 통해 항염증 효능이 있음이 발견된 이후, 많은 NSAID가 발명되어 항염증 치료제로 사용되어 왔다.

그러나 최근 연구에 의하면 NSAID 장기간 투여 시 위장과 신장의 기능저하를 일으키며 특히, 혈관을 확장시키는 PGE와 프로스타글란딘(prostacyclin)의 생성을 억제하여 심혈관과 관련된 여러 부작용이 보고되고 있다.

따라서 최근에는 천연물 유래의 COX-2 억제제가 NSAID에 비해 생체에 잘 흡수되고 대사되므로 부작용이 좀 더 적을것으로 판단하여, 우유엉겅퀴 유래의 실리마린(silymarin)과 천연허브 6종을 혼합하여 만든 신바로(shinbaro) 등과 같은 천연물에서 COX-2 억제제를 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

따라서 본 발명에서 이용한 실시예 1의 풀색꽃무지 추출물(GJE)은 곤충 유래 천연물이며 TNF-α와 IL-6와 같은 염증성 사이토카인과 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하고 NF-kB p65의 활성화를 억제하므로 천연물 유래 항염증 물질로 개발될 수 있을 것이라 기대된다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

풀색꽃무지(Gametis jucunda)를 에탄올로 추출하여 수득되는,
항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물.
제1항에 있어서,
상기 풀색꽃무지 추출물은 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 염증발현 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, NF-kB p65의 활성화를 억제하는 것이 특징인,
항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물.
제1항 또는 제2항의 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물을 유효성분으로 함유하는,
염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 담체, 부형제 또는 희석제가 추가로 포함되는 것이 특징인,
염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지가 1000 내지 2000㎍/㎖로 함유되어 있는 것이 특징인,
염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항의 풀색꽃무지(Gametis jucunda) 추출물을 유효성분으로 함유하는,
염증성 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 풀색꽃무지 추출물은 풀색꽃무지가 1000 내지 2000㎍/㎖로 함유되어 있는 것이 특징인,
염증성 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.