KR102429980B1 - 풀무치 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
풀무치 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 풀무치 추출물은 신경세포에서의 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수하여 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증 등과 같은 각종 신경염증 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물이나 건강기능식품으로 용이하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수한 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하여 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염 등과 같은 각종 신경염증 질환의 예방, 개선 또는 치료 효능이 우수한 조성물에 관한 것이다.
중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 세 종류로 분류할 수 있다. 이 중, 소교세포는 분화된 대식세포(specialized macrophage)의 일종으로, 뇌에 널리 분포한다. 소교세포는 조직 잔해 및 죽은 세포들을 삼키는 식세포로서 작용할 뿐 아니라 뇌의 생체방어활동에 참여하는 역할을 한다. 또한, 소교세포는 만성뇌질환에 있어서 다양한 신경 독소 및 전염증 매개체를 분비함으로써 신경염증 질환을 증가시켜 신경세포사 및 탈수초의 원인이 된다. 뇌손상 또는 신경성염증 자극에 대한 반응으로, 소교세포는 산화질소(nitric oxide, NO), 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 등을 생산함으로써 신경염증 질환에 관여한다. 활성화된 소교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하며 미생물 및 세포파편(cell debris)을 포식하고 파괴한다.
그러나 염증세포로서의 소교세포의 역할이 항상 유익한 것은 아니며, 현재 조절되지 않은 소교세포의 활성화는 지속적으로 과도한 신경염증을 유발하여 퇴행성 신경질환을 포함하는 다양한 중추신경계 병리의 원인이 되는 것으로 여겨지고 있다(Gonzalez-Scarano and Baltuch, Annu Rev Nerosci 22:219-240, 1999). 즉, 기능적으로 활성화된 소교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하며, 이러한 소교세포의 활성화 및 신경염증과 관련된 질환으로는 뇌허혈, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색경화증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상 등의 다양한 신경학적 및 신경퇴행성 질환이 알려져있다(Allan SM, Rothwell NJ, Cytokines and acuteneurodegeneration. Nat Rev neurosci. 2001;2;734-744). 따라서, 소교세포의 염증성 활성화는 엄격하게 조절되어야 할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 풀무치 추출물을 이용하여 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 풀무치 추출물이 신경염증 억제 효능이 있음을 확인하고 이를 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증 등의 치료제로서 용이하게 사용가능함을 밝혀 본 발명을 완성할 수 있었다.
본 발명의 목적은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수한 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하여 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염 등과 같은 각종 신경염증 질환의 예방, 개선 또는 치료 효능이 우수한 조성물을 제공하는 데에 관한 것이다.
본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 풀무치 추출물은 풀무치를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다.
상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 풀무치 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증매개인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 풀무치 추출물은 IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 신경염증 질환은 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환일 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은 또한 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 풀무치 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 풀무치 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 풀무치 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.
또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 풀무치의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.
상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 풀무치 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 풀무치 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 풀무치 추출물 제조시, 풀무치의 건조 분말을 용매와 혼합한 후, 200~250J의 세기로 5~30초간 1~3회 파쇄한 후 추출을 시작할 수 있다. 또한 초음파 처리 후 10~60분간 4~30℃에서 방치하여 추출을 진행할 수도 있다. 상기 풀무치의 건조 분말은 동결건조나 4~30℃에서의 자연건조 방법을 통해 건조한 풀무치를 분말화하여 얻을 수 있다.
상기 풀무치 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물의 적용 질환은 신경염증과 관련된 질환으로서, 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염(네이버 지식백과, '신경염' 참조) 등과 관련이 있거나, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환일 수 있다. 이 질환들이 신경염이나 퇴행성 뇌신경 질환, 뇌손상 질환, 우울증이나 인지장애 등과 같은 상기 질환들과 관련이 있음은 대한민국 등록특허 제10-1815573호나 대한민국 등록특허 제10-1670827호 등에도 개시되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 풀무치 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 풀무치 추출물은 신경세포에서의 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수하여 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증 등과 같은 각종 신경염증 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물이나 건강기능식품으로 용이하게 사용할 수 있다.
도 1은 신경세포인 BV-2에 대해 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 세포독성을 MTS 어세이를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 NO(Nitric oxide)의 분비량 감소효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase)의 mRNA 발현 억제 결과를 나타낸다.
도 4는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 COX-2(cyclooxygenase-2)의 mRNA 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 단백질 발현 억제 효과(좌측) 및 이를 수치화하여 그래프(우측)로 나타낸 결과를 나타낸다.
도 6은 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 IL-6(interleukin-6) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 단백질의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 단백질의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 NO(Nitric oxide)의 분비량 감소효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase)의 mRNA 발현 억제 결과를 나타낸다.
도 4는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 COX-2(cyclooxygenase-2)의 mRNA 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 단백질 발현 억제 효과(좌측) 및 이를 수치화하여 그래프(우측)로 나타낸 결과를 나타낸다.
도 6은 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 IL-6(interleukin-6) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 단백질의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 신경세포인 BV-2에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 단백질의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1. 풀무치 추출물의 제조>
풀무치(Locusta migratoria)는 국립농업과학원 곤충산업과에서 실내 계대 사육한 해남 6세대를 사용하였다. 실험 곤충은 밀을 먹이로 사용하였으며 30℃, 65% R. H., 9L/15D, 1,800 Lux의 조건에서 사육하였다. 상기 풀무치(성충)를 물로 2회 세척한 후, 동결건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 건조시켜 수분을 제거한 후, 이를 다기능 분쇄기(Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 풀무치 분말을 수득하였다. 이렇게 수득된 풀무치 분말은 70%(v/v) 에탄올 수용액에 용해(100g/1L) 시킨 후 초음파 파쇄기(LabaX, MAm USA)를 이용하여 230J의 세기로 10초간 2회 파쇄 후 30분간 25℃에서 방치하고, 4500rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후, 상등액을 얻어 0.25㎛ syringe filter(Whatman, ND, USA)로 여과 후 centrifugal evaporator (CVE-3100, Tokyo, Japan)를 이용하여 완전히 건조함으로써 본 발명의 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)을 제조하였다.
<실시예 2. 풀무치 추출물의 세포 독성 확인>
미세아교세포 또는 소교세포라 불리는 신경세포의 일종인 BV-2를 5% fetal bovine serum(FBS)와 50㎍/㎖ gentamicin이 첨가된 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 이후의 실험에서는 이렇게 배양된 BV-2 세포를 실험에 이용하였다.
세포 독성은 MTS assay를 이용하여 세포 생존율을 측정함으로 확인하였다. BV-2 세포에 대한 풀무치 에탄올 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 96 well-plate에 2×104 cells/ well로 분주하여 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 풀무치 추출물을 100, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 추가 배양한 후 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) reagent를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 이에 대한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 참고하면, 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)이 2000 ㎍/㎖의 농도까지 세포 생장을 촉진 시키는 효과를 보이며 독성을 나타내지 않았으나, 2000 ㎍/㎖가 초과된 농도에서 부터는 조금씩 독성이 나타남을 확인할 수 있다. 따라서 이후 실험들에서 사용한 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)의 최고 농도는 BV-2 세포에 독성을 나타내지 않는 2000 ㎍/㎖ 이하의 농도로 사용하였다.
<실시예 3. 풀무치 추출물의 항신경염증 활성 검정 - I>
실시예 3-1. NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과 확인
정상적인 NO(Nitric oxide)는 신경 보호나 뇌발달에 있어서 매우 중요하다고 알려져 있으나, LPS(Lipopolysaccharide)나 interferon-gamma (IFN-γ), β-amyloid 등으로 인해 활성화된 미세아교세포로부터 과도하게 생성되어 세포독성과 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.
이에, BV-2 세포에 풀무치 추출물을 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 생성되는 NO의 분비량을 측정하였다. BV-2 세포는 4×104 cells/well로 96 well-plate에 분주하여 약 24시간 동안 배양한 후 풀무치 추출물을 100, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖의 농도로 1시간 처리한 후에 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상등액 100 ㎕를 취하여 Griess 시약과 반응 시킨 후 multi detector (Beckman, DTX 8800, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성량을 측정하였다. 생성된 NO의 농도는 표준물질인 sodium nitrate (NaNO2) 용액의 표준곡선을 기준으로 하여 계산하였고, 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, 풀무치 에탄올 추출물을 BV-2 세포에 농도별 (100~2000 ㎍/㎖) 로 처리한 결과 LPS 처리군의 경우 대조군에 비해 약 12배 정도 NO 생성량이 증가되었으나, 풀무치 에탄올 추출물 처리군에서는 농도 의존적으로 NO 분비량이 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있다. 특히 풀무치 추출물의 최고농도인 2000 ㎍/㎖ 의 농도에서는 LPS만 처리한 대조군에 비해 약 90% 이상의 감소 효과를 관찰할 수 있다. 이러한 결과는 풀무치 에탄올 추출물이 LPS에 의해 유도되는 BV-2 세포의 면역반응을 감소시킬 수 있는 면역반응 억제제로서의 활용 가능성을 보여준다.
실시예 3-2. iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 억제 효과 확인
iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 외부자극에 의해 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하고, 이렇게 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 유발한다. 염증상태에서는 iNOS의 생성뿐 아니라 COX를 활성화하여 prostaglandin과 같은 염증매개물질의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
따라서, BV-2 세포에 풀무치 추출물을 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 생성되는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 mRNA 발현량을 Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)을 이용하여 측정하였다.
이를 위해 BV-2 세포는 4×105 cells/ well로 6well-plate에 분주하여 약 24시간 동안 배양한 후 풀무치 에탄올 추출물을 100, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖의 농도로 1시간 처리한 후에 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 5시간 배양하였다. 배양한 BV-2 세포는 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척하고 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 total RNA를 추출한 후 동량의 RNA (2 μg) 로부터 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster city, CA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 염증관련 유전자의 발현은 Table 1에 제시한 각각의 primer와 함께 AMPIGENE qPCR Green Mix Lo-ROX (Enzo Life Sciences, USA) 를 이용하여 Real-time PCR로 확인하였고 이에 대한 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.
i-NOS Forward : 5'-CAGCACAGGAAATGTTTCAGC-3'
i-NOS Reverse : 5'-TAGCCAGCGTACCGGATGA-3'
COX-2 Forward : 5'-CAGACAACATAAACTGCGCCTT-3'
COX-2 Reverse : 5'-GATACACCTCTCCACCAATGACC-3'
GAPDH Forward : 5'-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3'
GAPDH Reverse : 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'
도 3 및 도 4를 참고하면, BV-2 세포에 LPS (100ng/㎖) 를 처리하여 염증반응을 유도 시켰을 때 대조군에 비해 약 5배 이상 증가하며, 풀무치 에탄올 추출물을 농도별 (100~2000 ㎍/㎖) 로 처리한 결과 농도의존적으로 iNOS 유전자와 COX-2 유전자의 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있다. 이 결과 풀무치 에탄올 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로써 항신경염증 효능이 있는 것이 입증된다.
실시예 3-3. i-NOS 및 COX-2의 단백질 발현 억제 효과 확인
다음으로는 풀무치 추출물이 갖는 i-NOS 및 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 이를 위해 BV-2 세포를 6well에 각 4×105 cells/well 세포를 준비한 후 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질은 BCA kit (Thermo Fisher)를 이용하여 정량하였으며, 이를 SDS-PAGE 겔(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)을 이용하여 전개하였다. 전개된 단백질들은 PVDF membrane으로 transfer 시킨 후 5%(w/v) skim milk로 1시간 동안 blocking하고, 1차 항체(1:1000)를 희석하여 4℃에서 18시간 동안 over night 한 다음, 0.05% TBST(TBST; 20mM Tris [pH 7.5], 145mM NaCl, 0.05(w/v)% Tween-20)로 10분 간격으로 3회 세척하고, 각각의 2차 항체를 1:10,000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 0.05% TBST로 10분간 3회 세척 후 ECL용액으로 반응시키고 signal의 확인은 Image analyzer FluorChem (Alpha Innotech, USA)을 이용하여 측정하였고 이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 좌측은 iNOS와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 단백질 발현 억제 효과를 확인한 결과이며, 우측은 이를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과를 나타낸다.
도 5를 참고하면, LPS처리에 의해 증가된 iNOS와 COX-2단백질의 발현은 풀무치 에탄올 추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하는 양상을 나타난다. 이에 풀무치 에탄올 추출물은 iNOS, COX-2 유전자와 단백질 발현의 억제를 통해 NO의 생성 및 신경염증 억제 활성을 가지는 것을 알 수 있다.
<실시예 4. 풀무치 추출물의 항신경염증 활성 검정 - II>
BV-2 세포에 풀무치 추출물을 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 생성되는 염증유발인자 사이토카인인 IL-6(interleukin-6)와 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 단백질 발현량, IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 mRNA 발현량을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay, 실시예 3-3 참조)와 Quantitative RT-PCR (실시예 3-2 참조)을 이용하여 확인하였고, 이에 대한 결과를 도 6과 도 7에 나타내었다.
이 때 Quantitative RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다.
IL-6 Forward : 5' -GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3'
IL-6 Reverse : 5' -AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3'
TNF-α Forward : 5'-ATGAGAAGTTCCCAAATGGC-3'
TNF-α Reverse : 5'-CTCCACTTGGTGGTTTGCTA-3'
IL-1β Forward : 5' -CCTTCCAGGATGAGGACATGA-3'
IL-1β Reverse : 5' -TGAGTCACAGAGGATGGGCTC-3'
GAPDH Forward : 5'-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3'
GAPDH Reverse : 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'
또한 ELISA 수행을 위해 BV-2 세포를 96 well plate에 각 4×105 cells/well 세포를 준비한 후 풀무치 추출물(LME)을 100, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖ 의 농도별로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 수거하여 TNF-α의 분비량을 ELISA kit (ThermoFisher, Waltham, MA)를 사용하여 측정하였다.
도 6을 참고하면, IL-6 와 TNF-α ELISA kit를 이용하여 확인한 결과 LPS단독 처리군에서 무처리 군에 비해 각각 800배와 2.5배 단백질 발현양이 증가되었으나 풀무치 추출물을 처리한 군에서 농도 의존적으로 최대 2~8배 감소됨을 관찰할 수 있다.
또한 도 7을 통해, BV-2 세포에 IL-6, TNF-α 그리고 IL-1β가 LPS만 처리한 경우 대조군에 비해 현저하게 증가하는 것이 확인되며, 풀무치 에탄올 추출물에 의해 농도 의존적으로 유전자의 발현이 억제되는 것을 알 수 있다.
이러한 결과는 풀무치 에탄올 추출물이 염증매개인자인 염증성 사이토카인 생성을 현저히 억제시킴으로써 신경염증 억제 효능을 갖고 있음을 입증한다.
<제제예 1. 약학적 제제>
본 발명의 풀무치 에탄올 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.
Claims (10)
- 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물로,
상기 추출물은 C1~C4 알코올 추출물인, 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 풀무치 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증매개인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 풀무치 추출물은 IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 신경염증 질환은 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로,
상기 추출물은 C1~C4 알코올 추출물인, 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 풀무치 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증매개인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제6항에 있어서,
상기 풀무치 추출물은 IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제6항에 있어서,
상기 신경염증 질환은 단신경염, 다발성 단신경염, 다발신경염, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 학습장애, 인지장애, 기억력손상, 정신분열증 및 근위축성측색경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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