KR101798586B1

KR101798586B1 - 백미 추출물을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101798586B1
Application number: KR1020160018036A
Authority: KR
Inventors: 김선숙; 주연수; 홍인기; 최신욱; 서수련
Original assignee: 강원대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2017-12-12
Also published as: KR20170096532A

Abstract

백미 추출물을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 백미 추출물을 포함하는 조성물의 칼시뉴린 조절 단백질 발현 유도와 아토피 피부염을 포함한 염증 억제 효과에 관한 것이다.

Description

백미 추출물을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR TREATING ATOPIC DERMATITIS COMPRISING Cynanchi atrati Radix EXTRACT}

아토피 피부염은 심한 가려움증과 피부건조증을 동반하는 만성 염증성 피부 질환으로 주로 유아기나 소아기에 시작된다. 소아의 10-20% 정도가 아토피 피부염을 앓고 있으며, 성인이 되면 호전되거나 없어지는 경우가 많으나 1-3% 정도는 성인이 되어서도 증상이 계속되는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염의 발병 원인은 아직까지 확실하게 밝혀져 있지 않으나 유전적, 환경적, 면역학적 요인 등이 관여한다고 보고되고 있으며, 특히 환경적인 요인에 의해 전세계적으로 아토피 피부염 발병률이 급증하고 있다. 아토피 피부염 환자들의 경우 면역 세포들의 과도한 활성화가 관찰되는데, 최근에는 아토피 피부염에서 나타나는 과도한 염증 반응을 억제함으로써 증상을 개선하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다.

현재 아토피 피부염 치료제로는 스테로이드제, 항히스타민제, 면역억제제 등이 사용되는데 이들은 각각 인체에 심각한 부작용을 초래할 수 있어 지속적인 사용에 어려움이 있다. 또한 아토피 피부염을 앓고 있는 환자의 대부분이 유아와 소아이므로 치료제 적용에 주의가 필요하다. 따라서, 부작용이 적고 유아에서도 어려움 없이 사용 가능한 새로운 물질에 대한 연구는 꾸준히 요구되고 있다.

RCAN1 (Regulator of calcineurin 1)은 인간의 21번 염색체의 Down Syndrome Critical Region (DSCR)에 위치하고 있는 유전자이다 (Hattori, M., Fujiyama, A., Taylor, T.D., Watanabe, H., Yada, T., Park, H.S., Toyoda, A., Ishii, K., Totoki, Y., Choi, D.K., et al. (2000). Nature 405, 311-319.). RCAN1은 Calcium/Calmodulin-dependent serine/threonine phosphatase인 칼시뉴린 (Calcinuerin)과 결합하여 그 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Chan, B., Greenan, G., McKeon, F., and Ellenberger, T. (2005). Proc Natl Acad Sci USA 102, 13075-13080). 칼시뉴린은 신경계와 심혈관계, 면역계의 발달과 성숙에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 아토피 피부염 치료제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유효량의 백미 추출물을 포함하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유효량은 1 ㎍/㎖부터 10 ㎍/㎖ 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 유효량의 백미 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 유효량의 백미 추출물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 유효량의 백미 추출물을 포함하는 칼시뉴린 조절 단백질 발현 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 추출물은 칼시뉴린 조절 단백질 전사를 촉진하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 세포에 백미 추출물을 처리하여 해당 세포 내에서 칼시뉴린 조절 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 처리는 인 비트로에서 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 유효량의 백미 추출물을 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 백미 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 백미로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 백미의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.

상기 백미으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법,압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 백미 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 백미 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다.또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 백미 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

상기의 백미 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해,유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당,옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물

에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 백미 추출물은 조성물에 1 내지 10μg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 백미 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 염증 질환으로는, 아토피 피부염 이외에 관절염, 류머티즘성 관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 동맥경화증, 염증성 내장 질병, 궤양성 대장염, 골다공증, 크론(Crohn) 병, 뇌척수염, 수막염, 췌장염, 복막염, 골수염, 뇌염, 뇌막염, 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 맥관염, 임파구 맥락수막염, 사구체신염, 포도막염, 회장염, 간 염증, 신장염증, 천식, 통증, 패혈성 쇼크, 국소 빈혈, 궤양, 다중경화증, 경화증, 출혈성쇼크, 아나필락틱 쇼크, 화상,감염, 박테리아성 감염, 비루스성 감염, 진균성 감염 및 기생성감염, 건선, 레이슈마니아증,주혈흡충증, 혈액투석증, 발작, 심폐 혈관이식, 국소 빈혈, 재환류 질환, 혈색소증, 혈색소병증, 당뇨병, 알츠하이머(Alzheimer) 병, 파킨슨(Parkinson) 병, 타가이식거부증 및 자가면역질환 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 백미 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스,슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛,식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강 보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 백미 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 백미 추출물은 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 염증 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 백미 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 염증 질환 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 백미 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 백미 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 백미 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 백미 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며,또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 백미 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 염증 질환 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 백미 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 백미 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 백미 추출물을 투여하는 것을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로,이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 백미 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 백미 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내,동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 에탈올을 용매로 사용하여 추출된 백미 (Cynanchi atrati Radix)의 유효성분이 염증 반응을 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다. 백미는 박주가리과의 백미꽃 (Cynanchum atratum Bunge) 또는 만생백미 (Cynanchum versicolar Bunge)의 뿌리로 만든 한약재이다. 백미추출물이 대식세포의 염증 반응을 억제할 수 있는지 확인하고, 어떤 기전으로 염증 반응을 억제하는지 확인하고자 하였다. 백미추출물을 대식세포에 농도별로 처리하자 RCAN1의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었고 이러한 증가가 전사수준에서 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 염증 반응을 유발하는 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 증가하는 염증성 사이토카인의 발현량이 백미추출물에 의해 감소하는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 백미추출물에 의해 RCAN1의 발현량이 증가하는 것을 확인하였고 이러한 증가는 백미추출물에 의해 RCAN1의 transcription activity가 증가하기 때문임을 확인하였다. 또한 염증 반응을 유발하는 LPS에 의해 증가하는 염증성 사이토카인인 IL-1β와 IL-6의 발현량이 백미추출물에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 이는 LPS에 의해 유도되는 NF-κB 활성이 백미추출물에 의해 억제되기 때문이며, RCAN1의 shRNA를 이용하여 세포 내 RCAN1의 발현량을 knockdown시키자 백미추출물에 의한 NF-κB 활성 억제효과가 사라지는 것을 확인하였다. 이를 통해 백미추출물에 의한 염증 반응 억제 기전이 RCAN1 의존적임을 확인하였다.

Cyclosporin A, FK506과 같은 칼시뉴린 억제제들은 기존에 아토피 피부염 환자들의 가려움증 억제를 위해 환부에 도포하는 방식의 치료제로 사용되고 있다. RCAN1의 경우 endogenous 칼시뉴린 조절 단백질로 알려져 있으므로, 본 발명 결과에서 확인한 바와 같이 백미에 의한 RCAN1의 증가는 아토피 피부염에서 칼시뉴린 억제제들과 유사한 완화 효과를 보일 수 있을 것으로 사료된다. 또한 부작용으로 인한 장기간 적용이 어려운 기존의 칼시뉴린 억제제들과 달리 부작용이 적은 천연 추출물 유래 성분으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것으로 사료된다.

RCAN1이 염증 반응을 억제할 수 있음은 이전의 몇몇 연구를 통해 보고된바 있다. RCAN1이 결여된 마우스의 경우 박테리아를 통해 유도된 폐렴에 의한 치사율과 염증성 사이토카인의 발현이 증가되었다 (Junkins, R.D., MacNeil, A.J., Wu, Z., McCormick, C., and Lin, T.J. (2013). J Immunol 190, 5178-5186.). 또 다른 연구에서는 RCAN1이 결여된 마우스로부터 분리한 골수유래 비만세포 (bone marrow-derived mast cell)에서는 줄기세포인자 (stem cell factor)처리시 IL-6와 TNF의 발현량이 정상마우스로부터 분리한 골수유래 비만세포에 비해 증가되었다 (Wu, Z., Li, Y., MacNeil, A.J., Junkins, R.D., Berman, J.N., and Lin, T.J. (2013). J Immunol 191, 5885-5894). 이와 같이 RCAN1은 다양한 인자에 의해 유도되는 염증 반응을 억제할 수 있으므로, 지속적인 연구를 통해 백미추출물에 의한 염증 반응 억제를 다양한 분야에 응용할 수 있을 것으로 예상된다.

백미에 의한 RCAN1 의 발현 증가

백미에 의한 염증 완화 효과를 확인하기 위해 백미가 RCAN1의 발현을 유도할 수 있는지 확인하였다. Raw 264.7 세포주에 백미 추출물을 농도별로 24시간 동안 처리한 후, RCAN1 단백질의 발현량을 Western blot을 통해 확인하였다 (그림 1 A, B). RCAN1 단백질은 백미 1 ㎍/㎖부터 10 ㎍/㎖ 처리시까지 농도의존적으로 증가하였다가 이후에는 오히려 감소하였는데 이는 고농도에서는 오히려 세포 독성에 의해 세포 사멸을 유발하기 때문인 것으로 보인다 (그림 1. A, B). 또한 백미가 RCAN1의 mRNA 발현량 역시 농도의존적으로 증가시킬 수 있음을 RT-PCR을 통해 확인하였다 (그림 1 C, D).

백미에 의하여 RCAN1의 mRNA 발현량의 변화를 확인하였으므로, 백미가 RCAN1의transcription에 영향을 미칠 수 있는지 reporter gene assay를 통해 확인하였다. RCAN1-luciferase reporter vector 를 transfection한 후, 24시간 뒤 백미를 농도별로 처리하였다 (그림 2). 그 결과 백미의 농도의존적으로 luciferase activity가 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 백미 추출물이 RCAN1의 발현을 transcription 수준에서 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

백미에 의한 염증반응 억제 효과

백미추출물에 의한 염증반응 억제 효과를 확인하기 위해 Raw 264.7세포주에 백미 10 ㎍/㎖을 30분 간 전처리 하였다. 이후 대표적인 염증반응 유발 물질인 LPS를 10 ng/㎖ 처리하여 3 시간 뒤, 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-1β와 IL-6의 mRNA 양을 RT-PCR을 통해 확인하였다 (그림 3 A, B). 그 결과 LPS에 의해 증가했던 IL-1β와 IL-6의 mRNA 양이 백미를 전처리 하자 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 IL-1β의 단백질 수준에서도 확인할 수 있었다 (그림 3 C, D). 본 결과를 통해 백미추출물이 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시킴으로써 염증 반응을 억제할 수 있음을 확인하였다.

백미에 의한 NF -κB 활성 억제 효과

LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인의 발현량 증가는 전사 인자인 NF-κB의 활성화에 의해 유도된다는 사실이 이미 알려져 있다 (Cogswell, J.P., Godlevski, M.M., Wisely, G.B., Clay, W.C., Leesnitzer, L.M., Ways, J.P., and Gray, J.G. (1994). J Immunol 153, 712-723;McDonald, P.P., Bald, A., and Cassatella, M.A. (1997). Blood 89, 3421-3433). 이전 실험에서 LPS에 의한 염증성 사이토카인 발현량이 백미추출물에 의해 감소되는 것이 NF-κB 활성화와 관련이 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 Raw 264.7 세포주에 NF-κB-luciferase reporter vector를 transfection한 후, 24시간 뒤 백미 10 ㎍/㎖을 30분 간 전처리하였다. LPS를 10 ng/㎖ 처리하고 3시간 뒤 reporter gene activity를 측정하였다 (그림 4). 그 결과 LPS에 의해 증가했던 NF-κB reporter gene activity가 백미추출물에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 백미추출물이 NF-κB 활성 억제를 통해 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

백미에 의한 NF -κB 활성 억제는 RCAN1 의존적

백미추출물에 의한 NF-κB 활성 억제가 백미추출물에 의해 발현량이 증가된 RCAN1과 관련이 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 Raw 264.7 세포주에 NF-κB-luciferase reporter vector와 RCAN1의 shRNA 또는 scrambled shRNA를 transfection하였다. 24시간 뒤 백미 10 ㎍/㎖을 30분 간 전처리한 후 LPS를 10 ng/㎖ 처리하고 3시간 뒤 reporter gene activity를 측정하였다 (그림 5). 그 결과 백미추출물에 의해 감소했던 NF-κB reporter gene activity가 RCAN1의 shRNA를 cotransfection 하였을 때 다시 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 백미에 의한 NF-κB 활성 억제는 RCAN1 의존적인 것임을 알 수 있다.

아토피 모델에서 백미에 의한 염증 완화 효과

백미추출물에 의한 염증 완화 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 oxazolone을 처리한 아토피 모델 마우스를 이용하였다. 이를 위해 백미추출물 처리군에는 oxazolone 처리 30분 전 백미추출물 10 ㎍/㎖을 양 쪽 귀에 20 ㎕씩 발라준다. 이후 0.3% oxazolone을 양 쪽 귀에 20 ㎕씩 발라주는데 이 과정을 7일 간 반복한다. Oxazolone 단독 처리군 마우스의 경우 oxazolone 처리에 의해 귀의 피부 조직에 병변을 육안으로 확인할 수 있는 반면, 백미추출물을 발라준 마우스의 경우 oxazolone 처리 후에도 귀의 피부 조직에서 특별한 병변을 확인할 수 없었다 (그림 6A).

또한, 이 모델에서는 oxazolone 처리에 의해 귀 조직에 염증 반응이 일어나면서 조직의 swelling이 동반되는데, 이를 비교하기 위해 귀 조직의 두께를 확인하였다 (그림 6B). 그 결과 oxazolone 단독 처리군은 시간이 지날수록 swelling이 심화되어 귀 조직의 두께가 증가되는 것을 확인할 수 있었으나, 백미추출물을 전처리한 마우스들의 경우 귀 조직의 두께가 처리전과 비교하여 크게 변하지 않은 것을 확인하였다. 이를 통해 백미추출물이 아토피 피부염의 염증 반응을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명을 통하여 백미가 RCAN1의 발현량을 증가시킴으로써 NF-κB 활성을 억제하는 것임을 확인하였고, 본 발명를 통해 백미추출물이 염증 반응을 억제할 수 있고 이것이 RCAN1 의존적으로 일어나는 현상임을 확인하였으며, 이러한 결과들은 백미추출물에 의한 아토피피부염을 포함한 염증 반응 억제를 다양한 분야에 응용할 수 있을 것으로 예상된다.

도 1은 백미는 RCAN1의 발현을 유도한다는 것을 나타낸 그림.
도 2는 백미는 RCAN1의 transcription을 증가시킨다는 것을 나타낸 그림.
도 3은 백미는 염증성 사이토카인의 발현을 억제한다는 것을 나타낸 그림.
도 4는 백미는 NF-κB 활성을 억제한다는 것을 나타낸 그림.
도 5는 백미에 의한 NF-κB 활성 억제는 RCAN1 의존적이다는 것을 나타낸 그림.
도 6은 백미 추출물은 아토피 마우스 모델의 염증을 완화시킨다는 것을 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 Lipopolysaccharide (LPS)와 anti-RCAN1 항체, 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one (Oxazolone)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Anti-IL-1β 항체는 Cell Signaling Technology에서, anti-GAPDH 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다.

실시예 1: 백미 추출물

건조된 백미를 구입하여 분쇄기를 이용하여 분말로 만들어 준비한 후, 추출용매로 70% 에탄올을 첨가하였다. 이때, 추출용매의 양은 백미 분말의 건조 중량 1 g 당 10 ~ 30ml로 하였다. 추출은 실온에서 3시간 동안 침적 추출하였다. 추출물을 filter paper(Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japan)를 이용하여 여과한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 50℃로 감압농축하였다.

실시예 2. 세포 배양

Raw 264.7 세포주는 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin을 첨가한 DMEM을 사용하여 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 배양하였다.

실시예 3. Western blot

Lysis buffer [20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 10 mM NaF, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 1 ㎍/㎖ leupeptin, 1 ㎍/㎖ aprotinin and 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride] 를 처리하여 세포를 lysis 하였다. Total cell lysate 로 10% SDS-PAGE 를 수행한 후 단백질을 nitrocellulose membrane 으로 transfer 하였다. Membrane 은 TBS-T buffer [20 mM Tris-Cl (pH 7.6), 137 mM NaCl and 0.05% Tween-20] 를 사용하여 30분 간 blocking하여 준 후 1차 항체를 TBS-T buffer에 희석하여 4℃에서 overnight 하였다.

실시예 4. Reporter gene assay

세포에 luciferase reporter gene을 Lipofectamine 3000으로 transfection 한 후 Dual luciferase assay system (Promega)를 이용하여 luciferase activity를 측정하였다. Firefly luciferase activity는 renilla luciferase activity 값을 사용하여 보정하였다.

실시예 5. RNA 분리 및 RT- PCR

1) RNA 분리

Transfection 후 24시간 동안 배양한 세포를 얻어서 RiboEx (GeneAll) 1㎖을 처리한 후 상온에서 5분간 방치하였다. 여기에 200㎕의 chloroform을 첨가하여 섞어준 후 상온에서 2분간 방치하였다. 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 isopropyl alcohol을 500㎕ 첨가하여 10분간 상온에서 방치한 뒤 다시 원심분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 pellet을 75% 알코올로 씻어주고 원심분리 하였다. 이렇게 얻은 RNA pellet을 DEPC (Dietyl Pyrocarbonate) -treated dH₂O (RNase-free water)로 용해시켰다. UV spectrophotometer로 RNA 농도를 측정하고 -20℃에 보관하였다.

2) Reverse transcription

외가닥 cDNA 합성을 위해 준비된 각 RNA 1 ㎍을 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM MgCl₂, 각각 1 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP와 20U의 RNaseOUT (ribonuclease inhibitor: Invitrogen), 0.1 ㎍의 oligo(dT)₁₅ (Promega)를 포함하는 buffer 20㎕가 담긴 PCR 튜브에 넣고 37℃에서 1시간 동안 역전사시킨 후 95℃에서 10분 동안 heat-inactivation 시키고 4℃에서 안정화시켰다.

3) Primer 준비

β-actin forward : 5'-CATGTTTGAGACCTTCAACACCCC-3'

β-actin reverse : 5'-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCTAG-3'

RCAN1 forward : 5'-TGCTTGTGTGGCAAACGATG-3'

RCAN1 reverse : 5'-AGGAACTCGGTCTTGTGCAG-3'

IL-1β forward : 5'-ACGTGTTCTTTGAGGCTGAC-3'

IL-1β reverse : 5'-CTTCTTTGGGTATTGTTTGG-3'

IL-6 forward : 5'-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3'

IL-6 reverse : 5'-TTCTGCAAGTGCATCATCGT-3'

4) Polymerase Chain Reaction

역전사 반응이 끝난 cDNA를 PCR buffer [10 mM Tris, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 각각 200 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP] 에 넣고 primer (Bioneer Corp.)를 각각 10 pmol의 농도로 넣은 후 PCR을 수행하였다.

실시예 6. Oxazolone -유도된 아토피 피부염 모델

생후 8주의 ICR 마우스의 복부에 1.5% oxazolone을 100 ㎕ 발라준다. 7일 후, 양쪽 귀에 DMSO와 백미 10 ㎍/㎖을 20 ㎕씩 발라준다. 30분 후, 0.3% oxazolone을 20 ㎕ 발라준다. 이 과정을 7일간 반복한다. Oxazolone은 acetone과 olive oil을 3:1로 섞은 용액에 녹인 후 빛을 차단하여 보관한다. Oxazolone을 발라준 3시간 뒤, 귀 조직의 두께를 디지털 캘리퍼스 (Mitutoyo)를 이용하여 측정한다.

본 발명의 Western blot analysis와 RT-PCR 결과는 Image J software를 이용하여 정량화하였다. 타겟 밴드의 강도는 GAPDH와 β-actin의 강도와 비교하여 수치화하였다. 수치화된 데이터는 3개 이상의 독립적인 결과값의 표준편차를 표기하였다.

Claims

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세포에 백미(Cynanchi atrati Radix) 추출물을 인 비트로에서 처리하여 해당 세포 내에서 칼시뉴린 조절 단백질 1(Regulator of calcineurin 1;RCAN1)의 발현을 유도하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 처리 농도는 1 ㎍/㎖부터 10 ㎍/㎖ 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 처리 농도는 10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
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