KR101739425B1

KR101739425B1 - 미나리 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101739425B1
Application number: KR1020150085317A
Authority: KR
Inventors: 윤지영; 이보영; 정승일; 김선영; 김상준; 유강열
Original assignee: 재단법인 전주농생명소재연구원; 전주시
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2017-05-26
Also published as: KR20160078212A

Abstract

본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물은 TNF-α, IL-1β. IL-6, iNOS, COX-2의 생성을 억제함으로써, 염증의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 천연 유래의 물질로 인체에 안전하며 장기간 사용하여도 부작용이 없기 때문에, 염증 완화 및 치료에 유용하다.

Description

미나리 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 조성물{Composition for preventing or improving inflammatory disorders comprising fraction of Oenanthe javanica ethanol extract as effective component}

본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

미나리는 우리 식생활에서 다량 섭취되는 야채로서 독특한 향미 및 약리작용 효과가 있어 기능성 식품소재나 향신료로 활용도가 높은 식품 소재이다. 미나리(Oenanthe javanica (BL.) DC.)는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본식물로서 수생 또는 호습성의 식물로 7, 8월에 흰 꽃이 피며, 우리나라를 비롯하여 대만·일본·자바·인도 및 아시아 대륙에 걸쳐 분포되고 있다. 미나리는 물에서 자라는 '나리'라는 뜻으로 우리나라 최초의 국어사전인 훈몽자회(1527)에 '미나리'로 표기된 이래 현재까지 사용되고 있다. 한문으로 수근(水芹), 근채(芹菜), 수영(水英) 등으로 표기되며 중국에서도 동일한 이름이 사용되고 있다.

미나리가 약용으로 사용되는 부위는 잎과 줄기로서 가을에 채취하여 햇볕에 말려서 보관한다. 중국에서 가장 오래된 약물학 전문서인 신농본초경(神農本草經)에서는 '여자의 적옥(赤沃)을 치료하며, 지혈하고 정(精)을 기르며 혈맥을 보호하고 기를 보익하며 사람이 살찌고 건강하게 하고 식욕을 왕성하게 한다' 하였다.

동의보감에서는 '성질이 평(平)하고 맛이 달고[甘] 독이 없다. 갈증을 멎게 하고, 정(精)을 보충해 주고 살을 찌게하며, 술을 마신 후 생기는 열독을 제거하고 대소변을 잘나가게 한다. 또한 여자의 붕루, 대하와 어린이가 갑자기 열이 나는 것을 치료할 수 있다'고 소개하고 있다. 또한, 황도연의 방약합편에서는 '훈신채로 분류하며 달고 평(平)해 정(精)과 수(髓)를 보하고, 대, 소장을 좋게 하며 답답한 증을 멎게 한다'고 하였다.

미나리에는 미네랄 중에서 칼륨이 많이 들어 있어 소금을 많이 먹는 우리 식단에 적합하다. 미나리의 함유성분(수분 93%, 단백질 2%, 지질 0.1%)은 다른 채소와 비슷하나 비교적 풍부한 카로틴, 엽록소, 섬유질 등은 장의 활동을 촉진하므로 변비, 치질 등 소장과 대장 질환의 완하제로 효과가 좋다. 또한 미나리는 비타민 A, B₁, B₂, C 등이 다량 함유되어 있고, 플라본, 이소람네틴, 페르시카린 등의 화합물이 포함되어 있다. 미나리의 독특한 향기를 내는 정유의 주성분은 α-피넨, 마이르센 등이며, 입맛을 돋우어 줄 뿐만 아니라 정신을 맑게 하고 피를 깨끗하게 하는 효능을 갖고 있다. 또한, 미나리의 추출물에서 분리된 페르시카린은 간을 보호하는 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

염증 치료를 위해 널리 사용되고 있는 아스피린, 인도메타신과 같은 종래의 염증 억제 성분은 위장 장애, 항진성 혈관 확장 등의 부작용이 알려져 있고, 물질 P를 비롯한 신경 펩타이드계 성분에 대한 길항제, 브라디키닌 등 키닌류에 대한 길항제, 사이클로옥시게나아제 억제제 등이 대표적이지만, 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

한국등록특허 제1471818호에는 피부자극완화 및 피부염증 완화용 화장료 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0583747호에는 생약추출물과 향료를 포함하는 여드름 또는 염증 방지용 화장료 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 부작용이 적은 약용 식물 유래 염증 완화 및 치료용 소재를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 미나리 에탄올 추출물로부터 분획한 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트 분획물이 항염증 활성이 에탄올 추출물보다 증진된 효과가 있음을 확인하여, 상기 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 특정 분획물은 NO 생성과 염증 유도 사이토카인의 발현을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, iNOS 및 COX-2의 생성을 억제하여, 우수한 피부염증 완화 효과를 나타내므로, 피부 트러블 예방 및 개선, 홍조 개선, 피부염 예방 및 개선 등의 용도에 효과적으로 적용할 수가 있다. 또한, 염증의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 천연 유래의 물질로 인체에 안전하며 장기간 사용하여도 부작용이 없기 때문에, 염증 완화 및 치료에 유용하다.

도 1은 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 제조과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물의 제조과정을 도식화한 것이다.
도 3은 미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리한 후 RAW 264.7 세포의 생존율을 분석한 결과로, (A)는 미나리 에탄올 추출물(OJE), (B)는 미나리 에탄올 추출물의 헥산 분획물(OJE-Hx), (C)는 미나리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(OJE-BuOH), (D)는 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물(OJE-MC), (E)는 미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(OJE-EA)의 RAW 264.7 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다(*는 p값이 0.05 미만으로, 정상군(CON) 대비 본 발명의 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 처리군이 통계적으로 유의하게 세포 생존률을 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 4는 RAW 264.7 세포에서 미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리하여 LPS로 유도된 NO 생성량을 감소시키는 정도를 분석한 결과로, (A)는 미나리 에탄올 추출물(OJE), (B)는 미나리 에탄올 추출물의 헥산 분획물(OJE-Hx), (C)는 미나리 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(OJE-BuOH), (D)는 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물(OJE-MC), (E)는 미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(OJE-EA)의 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성량을 감소시키는 정도를 나타낸 그래프이다(*는 p값이 0.05 미만으로, 정상군(CON) 대비 LPS 처리군의 NO 생성량이 통계적으로 유의하게 증가된 것을 의미하고, #은 p값이 0.05 미만으로, LPS 처리군 대비 LPS 처리와 본 발명의 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 처리군이 통계적으로 유의하게 NO 생성량을 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 5는 미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리한 후 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 iNOS, COX-2, p-IκBα, IκBα 발현량을 비교한 것으로, (A)는 미나리 에탄올 추출물(OJE)을 처리한 후, LPS로 유도된 iNOS, COX-2, p-IκBα 및 IκBα 발현량을 확인한 것이고, (B)는 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물(OJE-MC)을 처리한 후, LPS로 유도된 iNOS, COX-2 발현량을 확인한 것이며, (C)는 미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(OJE-EA)을 처리한 후, LPS로 유도된 iNOS, COX-2 발현량을 확인한 것이다.
도 6은 미나리 에탄올 추출물(OJE)의 처리에 따른 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 IkBα의 발현 정도를 형광 현미경으로 관찰한 것이다.
도 7은 미나리 에탄올 추출물(OJE)을 농도별로 처리한 후 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량을 비교한 그래프이다(*는 p값이 0.05 미만으로, 정상군(CON) 대비 LPS 처리군에서 통계적으로 유의하게 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량이 증가한다는 것을 의미하고, #은 p값이 0.05 미만으로, LPS 처리군 대비 LPS 처리와 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 처리군이 통계적으로 유의하게 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량을 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 8은 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물(OJE-MC)을 농도별로 처리한 후 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량을 비교한 그래프이다(*는 p값이 0.05 미만으로, 정상군(CON) 대비 LPS 처리군에서 통계적으로 유의하게 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량이 증가한다는 것을 의미하고, #은 p값이 0.05 미만으로, LPS 처리군 대비 LPS 처리와 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물을 처리한 군에서 통계적으로 유의하게 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량이 감소한다는 것을 의미한다).
도 9는 미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(OJE-EA)을 농도별로 처리한 후 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량을 비교한 그래프이다(*는 p값이 0.05 미만으로, 정상군(CON) 대비 LPS 처리군에서 통계적으로 유의하게 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량이 증가한다는 것을 의미하고, #은 p값이 0.05 미만으로, LPS 처리군 대비 LPS 처리와 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군에서 통계적으로 유의하게 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현량이 감소한다는 것을 의미한다).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 미나리 에탄올 추출물의 분획물은 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 건강기능식품이 개선 효과를 나타내는 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 본 발명의 유효 성분의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 유효 성분을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 효용을 나타내는 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에서, 상기 분획물은 바람직하게는 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

또한, 본 발명의 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에서, 상기 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물은 NO(nitric oxide), TNF-α, IL-1β. IL-6, iNOS, 또는 COX-2의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

피부 조직은 과도한 자외선이나 오염 물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 따끔거림, 가려움 등의 피부 자극 및 염증 반응이 유발된다. 체내로부터 배출되는 피지 성분, 땀 성분 및 피부 외용 제품 내의 계면활성제, 지방산, 고급알코올, 단백질 등의 물질은 피부 상재균(resident flora)에 의해 분해되어 독성이 강한 물질로 변화함으로써 이들로 인해 염증 반응이 유도될 수도 있다. 피부에서의 염증 반응에서도 혈관 확장, 혈류 변화, 백혈구의 조직 내 침윤과 같은 생리적 현상이 나타나며 이로 인해 발적, 발열, 팽윤, 통증 등의 증상뿐만 아니라, 혈관 투과성의 증가와 함께 항체, 보체 및 대식 세포 등이 염증 부위로 집중되면서 홍반의 원인이 되기도 한다. 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물은 염증을 유발하는 물질인 NF-α, IL-1β, IL-6 등의 생성을 억제하는 효과가 있으므로 피부에서 일어나는 염증의 예방 및 완화에 효과가 있고, 천연 유래의 물질로 인체에 안전하며 피부에 부작용이 없다.

상기 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스 등으로 다양하게 제형화될 수 있다. 또한, 상기 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물은 본 발명의 분획물 외에 본 발명의 목적을 해치지 않는 범위 내에서 화장료에 통상적으로 사용되는 성분들과 배합될 수 있다.

또한, 본 발명은 미나리(Oenanthe javanica) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 미나리 에탄올 추출물의 분획물은 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물이 효용을 나타내는 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 미나리 에탄올 추출물의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 미나리 에탄올 추출물의 분획물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 미나리 에탄올 추출물의 분획물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

1. 미나리 에탄올 추출물 제조

30g의 미나리를 50 메쉬(mesh)로 분쇄(micro hammer-cutter mill, MHK Trading Co., Bucheon, Korea)하여 그 분말을 100%의 에탄올로 70℃에서 6시간씩 3회 추출한 후, 여과지(filter paper, Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축기(EYELA,N-1100 series, Tokyo, Japan)에서 농축하여 9g의 에탄올 추출물을 획득하였다(도 1).

2. 미나리 분획물 제조

상기 방법으로 제조된 미나리 에탄올 추출물을 증류수에 현탁 후, 현탁액과 헥산을 1:1의 비율로 분획 깔대기에 넣고, 헥산 층과 물 층을 분획하였고, 헥산 층을 다시 감압 농축하였다. 또한, 상기와 동일한 방법으로, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올로 각각 분획한 후, 상기 분획된 각각의 분획 층을 다시 감압 농축하였다(도 2).

농축된 추출물은 동결건조기(Ilsin, Korea)를 이용하여 건조 시료로 제조하였고, 동결건조된 시료에 대하여, 하기와 같이 수득율을 계산하였다.

수득율(%) = [동결건조 시료의 무게(g)/초기 건조 시료의 무게(g)]×100

3. 항염증 활성

(1) 시약

DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)과 FBS(fetal bovine serum), 페니실린, 스트렙토마이신은 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하였고, MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, CellTiter 96^®AQ_ueous One Solution Cell Proliferation Assay), 그리스(Griess) 시약 시스템은 Promega(Madison, USA)에서 구입하였다. LPS(Lipopolysaccaride), DMSO(dimethyl sulfoxide)는 Sigma Chemical Co.(St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였고, TNF-α 및 IL-1β, IL-6의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트는 R&D systems(DuoSet ELISA Development Systems, MN, USA)에서 구입하였다. iNOS, COX-2, IκBα, p-IκBα, GAPDH 항체는 Cell Signaling Technology, Inc.(MA, USA)에서 구입하였다.

(2) 세포 배양

실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 페니실린/스트렙토마이신 100unit/㎖와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

(3) 세포 생존율 분석

미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물이 RAW 264.7 세포에서 세포독성이 있는지 여부를 분석하기 위해 MTS 어세이를 실시하였다. 96웰 플레이트에 3×10⁵ cells/well로 분주하고, 미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리하였다. 24시간 배양한 후에 각각 세포 배양액 용량의 10%의 MTS 용액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 배양한 후, 마이크로플레이트 리더(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

(4) NO(Nitric oxide) 농도 측정

미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리하고, 30분 후에 LPS를 각 세포에 처리하여 24시간 후 배양액에 분비된 NO를 측정하였다. 96웰 플레이트에 세포 배양 상등액과 그리스 시약(G2930, Promega, USA)를 1:1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응 시킨 후 마이크로플레이트 리더(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

(5) 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6) mRNA 발현 분석

RAW 264.7 세포를 6cm의 배양 용기에 1×10⁵cells/dish씩 분주한 후, 24시간 배양하여 세포를 안정화시켰다. 상기 RAW 264.7 세포에 미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리하고, 30분 후에 LPS(500ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척하고, Tripure Isolation Reagent(Roche 11 667 165 001)를 이용하여 RNA를 분리하였다.

5㎍의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied biosystem 4368814)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 1㎕의 cDNA, 1㎕의 taqman primer, 10㎕의 Taqman Universal Master Mix II(Appiled biosystem), 8㎕의 3차 증류수를 넣고 실시간(real-time) PCR을 수행하였다. 정량 중합효소 반응에 쓰인 TaqMan 유전자는 주문 후 사용하였고, 분석하고자 하는 특이적 유전자의 정보는 표 1에 나타내었다.

또한 실시간 PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.

실시간 PCR을 위한 사이토카인의 TaqMan 유전자 정보

Gene symbol	Gene description	TaqMan gene expression assay number	Reference sequence
TNF-a	tumor necrosis factor alpha	Mm00443258_m1	NM_013693.3
IL-1b	interleukin 1 beta	Mm01336189_m1	NM_008361.3
IL-6	interleukin 6	Mm00446190_m1	NM_031168.1
Hprt1	Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (reference gene)	Mm01545399_m1	NM_013556.2

(6) 면역블롯팅(Immunoblotting) 분석

미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 이용하여 iNOS와 COX-2, IκBα, p-IκBα 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 배양 후, 62.5mM Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 2mM 페닐-메틸술포닐 플루오라이드, 프로테아제 저해제(completeTM, Roche, Manngeim, Germany), 1mM Na₃VO₄, 50mM NaF과 10mM EDTA을 함유하는 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액을 15,000×g로 4℃에서 30분간 원심 분리하여 단백질이 포함된 상층액을 얻었다. 정량한 20㎍의 단백질을 1% SDS-PAGE에 전기영동 시킨 후, PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(BIO-RAD, Richmond, CA, USA)으로 옮겼다. 그리고 멤브레인은 5% BSA(bovine serum albumin)이 함유된 TTBS(0.1% 트윈 20 + TBS) 용액을 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. iNOS, COX-2, IκBα, p-IκBα, GAPDH에 대한 1차 항체를 멤브레인에 노출시키고, 2차 항체인 호스래디쉬 퍼옥사이드-복합 항-토끼 또는 항-마우스 IgG를 반응시키고, ECL 검출 시약(Millipore, MA, USA)를 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다.

(7) 면역형광염색(immunofluorescence staining) 분석

RAW 264.7 세포를 커버 슬립이 깔린 24웰 세포 배양 플레이트에 분주하고 24시간이 지난 후, 각 그룹에 따라 시료를 처리하였다. 이후 각 시간에 따라 0.5시간, 24시간이 지난 후, 그룹별로 커버 슬립 위의 세포를 PBS로 3번 세척해 주고, 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 20분 동안 고정시켜 주었다. 다시 PBS로 3번 세척한 후, 0.5% Triton X-100을 15분간 처리한 후, 3% BSA로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 이후 1차 항체로 IκBα(1:125, Cell signaling, #4814)를 1% BSA/PBS에 희석하여 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다.

PBS로 5분간 세척한 후 2차 항체(1:200, Jackson Immuno Research, WestGrove, PA)를 1% BSA/PBS에 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 PBS로 5분씩 3번 세척한 후, 커버 슬립을 형광 용액(DAKO cytomation, Carpinteria, CA)으로 고정시킨 후, 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 형광 염색된 IκBα를 관찰하였다.

(8) 통계처리

본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치±표준편차(mean ± S.D.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

실시예 1. 미나리 에탄올 추출물 및 용매별 분획물에 대한 수득율 분석

동결건조된 미나리 에탄올 추출물 및 용매별 분획물에 대하여 수득율을 하기 표 2에 나타내었다. 수득률은 추출 전 건조시료의 무게를 기준을 계산하였다.

미나리 에탄올 추출물 및 이의 분획물에 대한 수득율

시료	건조 시료량(g)	동결건조 시료량(g)	수득률(%)
미나리 에탄올 추출물	30	9.00	30.00
헥산 분획물	9	2.70	30.00
메틸렌클로라이드 분획물	9	0.23	2.56
에틸아세테이트 분획물	9	0.66	7.30
부탄올 분획물	9	1.36	15.15

실시예 2. 미나리 에탄올 추출물 및 이의 분획물이 RAW 264.7 세포의 세포생존율에 미치는 영향

미나리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 62.5, 125, 250, 500, 1,000㎍/㎖의 농도로 RAW 264.7 세포에 처리하고 24시간 후 MTS로 세포 생존율을 관찰하였다.

미나리 에탄올 추출물의 경우, 500㎍/㎖의 농도 이상에서 미나리 에탄올 추출물의 대식세포주의 세포 생존율이 86.58±3.48%로 나타났다. 따라서, RAW 264.7 세포에서 500㎍/㎖의 농도 이하로 처리되는 경우 세포독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다(도 3A).

미나리 헥산 분획물은 125㎍/㎖의 농도 이상에서 세포독성이 나타났고(도 3B), 미나리 부탄올 분획물의 경우, 거의 세포독성이 없는 것으로 나타났고(도 3C), 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군에서는 500㎍/㎖의 농도 이하에는 RAW 264.7 세포에서 세포독성이 없고, 1,000㎍/㎖의 농도에서 세포독성이 관찰되었다(도 3D 및 도 3E).

실시예 3. 미나리 에탄올 추출물 및 이의 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS 로 유도된 NO 생성에 미치는 영향

미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물이 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 62.5, 125, 250, 500, 1,000㎍/㎖의 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 RAW 264.7 세포에 처리하여 생성되는 NO 생성량을 측정하였다.

미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 전처리하고, LPS로 자극하여 24 시간 후에 세포 배양액에서 NO의 생성량을 측정한 결과, LPS만 처리한 군에서는 LPS 자극 없이 미나리 에탄올 추출물 단독 처리군과 비교하여 NO의 생성량이 현저하게 증가하였으며, 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 전처리하고 LPS를 처리한 실험군에서는 62.5㎍/㎖ 이상에서 농도 의존적으로 유의성 있게 NO의 생성을 억제하였다(도 4).

실시예 4. 미나리 에탄올 추출물 및 이의 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS 로 유도된 iNOS, COX -2, IκBα 발현에 미치는 영향

NO 생성 억제 기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 면역 블롯 분석을 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질 발현량을 조사하였다. LPS 처리시에는 iNOS 단백질 발현이 강하게 유도되었으나, 500ng/㎖의 LPS 처리하고, 62.5, 125, 250, 500㎍/㎖의 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 처리한 실험군에서 LPS에 의한 iNOS의 발현량이 농도 의존적으로 현저히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 5).

산화촉진제(pro-oxidant)나 전염증 자극(pro-inflammatory stimuli)에 의해 MEKK-1, NF-κB의 활성화를 경유하여 생성되는 COX-2는 프로스타글란딘 합성을 증가시켜 염증반응에 있어서 중추적 역할을 한다. 본 실험에서 LPS 처리시에는 COX-2 발현량이 강하게 유도되었으나, 500ng/㎖의 LPS 처리하고, 62.5, 125, 250, 500㎍/㎖ 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 처리한 실험군에서 COX-2 발현량이 농도 의존적으로 현저히 줄어들었다(도 5).

바이러스, 박테리아 감염시 유도되는 염증반응에 의해 활성화 되는 NF-κB는 iNOS나 TNF-α 유전자의 발현에 관련된다. 정상 상태에서 NF-κB는 세포질에서 저해분자(inhibitory molecule)인 IκBα, IκBβ, IκBε, p105, p100 등과 결합하여 비활성형으로 존재하지만, LPS의 자극에 의해 IκBα가 저하되면 NFκB signaling cascade가 활성화되고, NFκB가 핵으로 이동하여 COX-2, iNOS, BclXL, cIAPs 등의 전사를 유도한다. 본 실시예 4에서는 IκBα의 phosphorylated form을 측정하여 IκBα 분해(degradation)에 의한 NF-κB 기전을 확인하였다. LPS 처리시에는 p-IκBα 발현이 유도되었으나, 62.5, 125, 250, 500㎍/㎖ 미나리 에탄올 추출물의 전처리는 LPS에 의한 pIκBα 발현량을 억제시켰으며, IκBα의 발현량은 p-IκBα와 정반대의 양상이 관찰되었다(도 5 및 6). IκBα의 phosphorylated form과 total form의 발현 양상을 살펴 본 결과, 미나리 에탄올 추출물은 IkBα의 분해(degradation)를 억제하여 NFκB의 핵으로의 이동(translocation)을 억제함으로써 염증반응을 억제하는 것으로 사료된다.

실시예 5. 미나리 에탄올 추출물 및 이의 분획물이 염증성 사이토카인 mRNA 발현에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도되는 각종 전염증성 및 염증성 사이토카인들의 발현에 대한 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물이 미치는 영향을 조사하기 위하여, 전염증성 및 염증성 사이토카인의 mRNA 발현에 대한 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물의 영향을 관찰하였다. 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물을 전처리한 후, LPS로 자극하고 24시간 후에 세포를 수집하였다. 수집된 세포 내 mRNA를 분리 정제하여 실시간 PCR 기법으로, TNF-α, IL-1β, IL-6 mRNA 발현 양을 분석하였다.

그 결과 미나리 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트 분획물 처리군에서 농도의존적으로 상기의 mRNA 발현 양이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(도 7 내지 도 9).

Claims

TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 미나리 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.