상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 과민성 피부 질환 치료제를 제공한다.
상기 과민성 피부 질환은 아토피 피부염, 알레르기성 습진, 소아 습진, 굴전부 습진, 범발 신경 피부염 또는 태선화 피부염으로 이루어지 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물은 물, 알콜, DMSO, 에틸 아세테이트 또는 물, 알콜, DMSO 및 에틸 아세테이트의 혼합 용매 등으로 추출하여 제조될 수 있다. 추출 방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법이 가능하며, 상기에서 알콜은 에탄올 또는 메탄올이 바람직하다. 이때, 증류수 추출은 고온에서 열탕추출과정을 거치는 것이 바람직하며 알코올, DMSO 및 에틸 아세테이트 추출은 상온에서 추출작업을 거치는 것이 바람직하며, 추출액을 진공회전증발기를 이용하여 감압농축하고 동결 건조하여 분말상태의 한약재 추출물을 제조할 수 있다.
또한, 추출에 사용되는 진교의 양은 0.5-1g/㎖인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역글로불린(Immunoglobulin) Ig E 생성 저하제를 제공한다.
또한, 본 발명은 진교 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 세포 증식 촉진제를 제공한다.
본 발명에 따른 진교 추출물은 자유 라디칼을 소거하고 Fe3+을 Fe2+로 전환시키는 환원력이 있다(표 1, 2).
본 발명에 따른 진교 추출물은 면역글로불린 Ig E를 감소시키며(표 3), 면역 세포 중 B 세포의 생장을 증진시키는 효과가 있다(표 4).
따라서, 본 발명에 따른 진교 추출물은 자유 라디칼을 소거하고 환원력을 지니고 있어 항산화 효과를 나타내고, 과민성 질환의 대표 인자인 면역글로불린 Ig E를 감소시키며, 면역 세포 중 B 세포의 생장을 증진시키는 면역 항진 효과가 있으며, 또한 세포 독성이 없어 아토피 피부염으로 대표되는 과민성 피부 질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 예방제 및 치료제는 상기 진교 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 진교 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 진교 추출물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 진교 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 과민성 피부 질환 예방 또는 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 진교 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 100㎎/㎏이고, 하루 수회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 과민성 피부 질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 과민성 피부 질환 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 진교 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 진교 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01~0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 화장품, 목욕용품, 비누, 의약품 연고류, 동물 의약품 또는 팩제품의 원료로 사용하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명의 진교 추출물을 유효성분으로 함유하는 과민성 피부 질환 치료제는 용액제, 현탁제, 스프레이제, 패취제, 패드제, 크림제, 연고제, 겔제, 정제 또는 환제로 제조될 수 있다.
용액제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면 물, 에틸알코올, 이소프로필알코올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 동백유, 알로에베라, 글리세린, 천연옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유, 아몬드유 및 참깨유, 글리세롤, 글리세롤 포름알코올, 테티라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있으며, 보존제로서 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 솔브산 등을 포함할 수 있다.
현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상 희석제 (예: 물, 에틸알코올 및 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 및 현탁제 (예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 소르비탄 에스테르, 셀룰로스 유도체 및 수소화 식용유지), 미세 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
연고제, 크림제 및 겔제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 동물성 및 식물성 지방, 왁스 파라핀, 전분, 타르가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화 아연 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
또한, 투여방법은 일반적으로 환부에 도포하는 방법이 사용될 수 있으며, 제형에 따라 바람직한 투여방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물의 일일 투여량은 투여대상, 투여방법, 증상에 따라 결정되지만, 일반적으로 조성물에 포함되어 있는 진교 추출물이 0.01 내지 100 ㎍/㎖의 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 투여 회수는 1일 2회 이상이 바람직하나 증상 정도에 따라 투여 회수 또한 조절될 수 있다. 그러나, 상기 투여량은 변화시킬 필 요가 있으며, 특히 치료할 객체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여기간 또는 간격을 고려해서 변화시킬 수 있다.
과민성 피부 질환을 효과적으로 치료하기 위해서는 적합한 외용제형을 선택하는 것이 중요하다. 과민성 피부 질환을 치료하기 위해 진교 추출물을 적당히 희석하여 피부에 직접 도포할 수도 있으며, 본 발명에서는 상기 과민성 피부 질환 치료제를 환부에 효과적으로 적용될 수 있는 연고제를 제공한다.
본 발명의 연고제는 상기 기재된 과민성 피부 질환 치료제를 무기물질과 배합한 다음, 이를 지용성 기제로 코팅하여 제조한다. 상기 무기물질은 항균성, 소염효과, 표피재생 효과 등이 우수한 소재를 사용하는 것이 바람직하고, 이들의 구체적인 예로는 산화아연, 탄산아연, 산화철 등이 있다.
또한, 수용성 물질인 본 발명의 과민성 피부 질환 치료제를 안전하게 함침할 수 있는 세라믹 담체를 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세라믹 담체로는 제올라이트, 활석, 석고, 모려분 및 이들의 혼합물이 바람직하게 사용된다. 이러 한 세라믹 담체는 수용성 성분의 함침성이 우수하여 피부에 수용성 성분의 공급을 원활히 할 수 있다.
또한, 본 발명의 진교 추출물을 5 ㎍/㎖의 용량으로 랫트에 단회 도포하여 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰한 결과, 상기 도포량으로는 독성이 나타나지 않아 본 발명의 진교 추출물은 무해한 생약재임을 알 수 있었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 한약재 추출물의 제조
한약재들은 서울시 경동시장 소재 속리산한약방에서 제공받아 실험에 사용하 였다.
1-1: 진교 추출물의 제조
이물질을 제거하고 세척, 건조시킨 진교 추출물은 0.5-1g/㎖ 무게를 측정하였고, DMSO, 증류수, 에탄올, 메탄올, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 증류수의 경우 24시간 60℃에서 열탕추출과정을 거쳤으며, DMSO, 에탄올, 메탄올과 에틸 아세테이트는 상온에서 24시간 추출작업을 거친 후 상층액을 취하였다. 상층액은 회전식진공농축증발기(vacuum rotary evaporator)를 이용하여 진공 감압 농축하여 실험에 사용하였다.
1-2: 비교 한약재 제조
진교 추출물과의 효과 비교를 위하여 감초, 천궁, 승마 및 호장근 추출물을 실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
실험예 1: 진교 추출물의 항산화 효과 측정
1-1: DPPH(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분석
DPPH(1,1-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl)는 보라색의 화합물로서 그 자체가 매우 안정한 자유 라디칼이며, 수소 양자-라디칼 소거제(hydrogen proton-radical scavenger)에 의하여 노란색의 디페닐피크릴하이드라진(diphenylpicrylhydrazine)으로 되므로 본 실험에서는 여러 가지 항산화 기작 중 수소 원자 또는 일전자(one electron) 공여능 측정을 통해 항산화 활성을 지니는지를 판단하였다. 먼저 싸이비오 콘트롤 2.01(CyBio Control 2.01)을 이용하여 리퀴드 핸들러(liquid handler, CyBi-Well 2000)를 움직일 수 있는 프로그램을 만들고 리퀴드 핸들러를 조정하여 96 웰 플래이트에 DPPH와 추출물을 각각 넣고 멀티레벨 카운터(multilabel counter, Wallac VICTOR²)로 흡광도를 측정하는 방법을 이용하였다. DPPH는 200 μM이 되도록 100%의 에탄올에 녹인 다음 199 ㎕ 씩을 96 웰 플래이트에 넣었다. 그리고 각 용매로 추출한 추출물 10 ㎍을 각각 물, DMSO에탄올, 메탄올 또는 에틸아세테이트에 녹여 1 ㎕ 넣고 잘 혼합한 후 30분 동안 상온에서 반응시키고 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성 (%)은 아래 의 수학식 1로부터 계산하였으며, 대조군으로 어떤 한약재도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
표 1에서 보듯이, 진교를 증류수, DMSO로 추출했을 때 약 70%의 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, 에탄올, 에틸 아세테이트로 추출했을 때 약 30%의 효과를 나타내었으나, 메탄올로 추출했을 때는 라디칼 소거 활성이 나타나지 않았다. 항산화 효과가 있다고 공지된 감초, 천궁 추출물과 비교함으로써 증류수, DMSO로 추출한 추출물의 경우 자유 라디칼 소거 효과가 좋음을 확인하였다.
<수학식 1>
DPPH 라디칼 소거 활성 (%) = (1-DAS/DAC) × 100
(상기 식에서, DAS는 시료 첨가군의 흡광도, DAC는 대조군의 흡광도이다)
DPPH 라디칼 소거 활성 (%)
|
추출 용매 |
한약재 |
물 |
DMSO |
에탄올 |
메탄올 |
에틸아세테이트 |
진교 |
73.072 |
70.879 |
38.753 |
0 |
30.361 |
감초 |
49.148 |
60.120 |
90.751 |
51.184 |
69.737 |
천궁 |
68.685 |
60.442 |
29.071 |
75.343 |
32.151 |
1-2:
FRAP (Ferric Reducing/Anti-oxidant Power) 분석
FRAP 분석은 3.6의 낮은 pH에서 Fe3+-TPTZ(ferric tripyridyltriazine) 복합체가 환원제(antioxidant)에 의해서 파란색의 Fe2+-TPTZ(ferrous tripyridyltriazine) 복합체로 될 때 흡광도를 측정하여 검색하고자 하는 화합물에 대한 환원력(ferric reducing ability)을 보는 것이다[Benzie and Stratin, 1996]. 먼저 3.1 g의 C2H3NaO2 · 3H2O와 16 ㎖의 아세트산(C2H4O2)을 넣어서 1 ℓ의 아세테이트 완충용액 (pH 3.6, 300 mM)을 만들었다. 그리고 40 mM HCl로 10 mM의 TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)를 제조하였고, 증류수로 20 mM의 FeCl3 · 6H2O를 제조하였다[Benzie and Stratin, 1996]. FRAP 분석을 위한 반응액(working solution)은 100 ㎖ 아세테이트 완충용액, 10 ㎖ TPTZ 용액 및 10 ㎖ FeCl3 · 6H2O를 혼합하여, 즉 각각 10 : 1 : 1의 비율로 섞어 실험에 사용하였다. 그리고 96 웰 플래이트에 FRAP 반응액 190 ㎕를 넣고, 추출물들 400 ng을 각각 물, DMSO, 에탄올, 메탄올 또는 에틸아세테이트에 녹여 10 ㎕를 넣었다. 그 후 30분 동안 반응시킨 후 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP 반응액 (working solution)은 항상 실험 전에 만들어 사용하였다.
표 2에서 보듯이, 진교를 증류수, DMSO 또는 메탄올로 추출했을 때 용액 내 Fe2+의 농도가 약 5.4로 나와 감초 및 천궁과 같은 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 한약재에 비해 우수하게 나타났다. 에탄올 및 에틸 아세테이트로 추출한 경우도 다른 용매로 추출했을 때보다 효과가 떨어지나 다른 한약재에 비해서는 비교적 높게 나타났다.
환원력(Fe2+/ℓ의 평형 농도(mmol))
|
추출 용매 |
한약재 |
물 |
DMSO |
에탄올 |
메탄올 |
에틸아세테이트 |
진교 |
5.392 |
5.424 |
1.878 |
5.348 |
0.991 |
감초 |
2.081 |
4.365 |
3.808 |
1.233 |
1.259 |
천궁 |
2.848 |
5.148 |
0.841 |
2.807 |
0.617 |
실험예 2: 진교 추출물의 면역글로불린(immunoglobulin) Ig E 생성량에 미치는 영향
과민성 질환 치료 효과가 있는지 여부를 알아보기 위해 메탄올로 추출한 진교 추출물이 과민성 질환에 있어서 대표적인 과민성 유발 요인인 Ig E의 생성량에 미치는 영향을 실험하였다.
96 웰 플래이트의 각 웰에 1 ㎎/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)를 20 ㎕, 500 ng/㎖ 농도의 IL-4 및 한약재 추출물을 각각 20 ㎕씩 처리하였다. 그 후 BALB/c 마우스 암컷 비장(spleen)을 적출하여 단일세포로 만들어 RPMI 1640 배지(RPMI 배지 418 ㎖, HEPES (10x 용액) 7.5 ㎖, 2-메르캅토에탄올 0.5 ㎖, 소듐 바이카보네이트 15 ㎖, 페니실린/스트렙토마이신 (100x 용액) 5 ㎖, 우 태아 혈청 50 ㎖)에 현탁시킨 후 96 웰 플래이트에 2 × 106 세포/㎖로 처리하였고, 각 웰 당 최종 부피는 200㎕로 하였다. 37℃, CO2 배양기에서 7일간 배양하였다. 7일 후 각 웰의 상등액을 100 ㎕씩 취하여 Ig E ELISA 키트인 BD 파민젠(BD pharmingen, 10975 Torreyana Rd.)을 이용하여 Ig E 양을 측정하였다. 측정은 ELISA 측정기(reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 수학식 2를 이용하여 Ig E 생성 감소율을 계산하였다. 이때, 대조군은 어떤 한약재도 첨가하지 않은 군으로 하였다.
<수학식 2>
Ig E의 생성 감소율(%) = 100-(1-AS/AC) × 100
(상기 식에서, AS는 시료 첨가군의 흡광도, AC는 대조군의 흡광도이다)
표 3에서 보듯이, 진교 추출물은 과민성 대표 인자인 Ig E의 생성을 100% 감소시킴을 확인하였으며, Ig E를 감소시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있어 당업계에서 아토피 치료제에 사용되고 있는 승마, 호장근에 비해서도 Ig E의 생성을 감소시키는 효과가 뛰어남을 확인하였다.
Ig E 생성 감소 효과
한약재 |
Ig E 생성 감소율(%) |
진교 |
100 ± 1.11 |
승마 |
36 ± 3.33 |
호장근 |
41 ± 7.22 |
실험예 3: 면역세포 증식(Cell proliferation) 분석
96 웰 플래이트에 각각 B 세포 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎎/㎖, T 세포 유도 물질인 Con A (concanavalin A) 100 ㎍/㎖의 농도로 각각10 ㎕씩 처리하였다. 그 후 한약재들을 최종 농도가 1 ㎍/㎖이 되도록 처리하고, 마우스 비장에서 적출하여 단일 세포화한 면역 세포를 RPMI 1640 배지(RPMI 배지 418 ㎖, HEPES (10x 용액) 7.5 ㎖, 2-메르캅토에탄올 0.5 ㎖, 소듐 바이카보네이트 15 ㎖, 페니실린/스트렙토마이신 (100x 용액) 5 ㎖, 우 태아 혈청 50 ㎖) 현탁시켜 2 × 106 세포/㎖ 농도로 만들어 각 웰에 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 처리하였다. 그 후 37℃, CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 배양 후 MTS(tetrazolium, Promega) 용액을 각 웰 당 20 ㎕ 씩 처리하고, 37℃, CO2 배양기에서 2~4 시간 방치한 후 ELISA 측정기(reader)기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 면역증강효과는 하기 수학식 3을 이용하여 계산하였으며, 유도물질을 처리하지 않은 경우, LPS만 처리한 경우, Con A만 처리한 경우를 모두 포함하여 대조군과 비교하여면역세포 증식이 100% 이상일 경우면역증강 효과가 있다고 판단하였다.
표 4에 보듯이, 진교 추출물은 유도 물질을 처리하지 않았을 경우 면역 세포량의 변화에 영향을 미치지 못했으며, LPS를 첨가하여 B 세포를 유도했을 때 대조군에 대해 100% 이상의 증식 효과를 나타내었고, Con A를 첨가하여 T 세포를 유도했을 때 그 증식량에 영향을 미치지 못하였다. 따라서, 진교 추출물은 B 세포의 증식 촉진 효과가 있을 것으로 확인되었다. 반면에 Ig E 생성 감소 효과가 있었던승마 및 호장근은 면역세포의 증식에 별다른 영향을 미치지 못하거나 증식을 억제시키는 결과가 나타났다.
면역 증식능
한약재 |
구분 |
유도물질 비처리 |
B cell 증식 |
T cell 증식 |
진교 |
증식능(%) |
83.74 ± 15.04 |
116.45 ± 2.63 |
107.69 ± 4.04 |
증감여부 |
N |
U |
N |
승마 |
증식능(%) |
93.38 ± 2.89 |
104.07 ± 11.03 |
76.64 ± 8.94 |
증감여부 |
N |
N |
D |
호장근 |
증식능(%) |
88.21 ± 4.88 |
98.03 ± 1.71 |
99.81 ± 6.73 |
증감여부 |
N |
N |
N |
N: 변화없음, U: 증가, D: 감소 |
<수학식 3>
면역 증강 효과(%) = AB/AC * 100
(상기 식에서, AB: 시험군 증식도, AC: 대조군 증식도이며, 대조군± 10% 내외는 변화 없음으로 표시하였다)
실험예 4: 세포 독성(Cell cytotoxicity) 분석
NCTC 클론 929 (L-929) 세포를 T-75 플라스크에서 배양하였다. 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 처리하여 세포를 떨어뜨린 후 현미경을 이용하여 세포수를 측정하였다. 96 웰 플래이트를 이용하여 각 웰에 세포수가 1× 104 세포가 들어가도록 세포를 10% FBS가 첨가된 MEM 배지로 희석하여 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 분주하였다. CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 세포가 제대로 안착되었는지 확인하고 배지를 버린다. 한약재들을 농도에 맞게 각 웰에 처리한 후 10% FBS가 첨가된 MEM 배지를 이용하여 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 하였다. 다시 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 모두 버리고 건조시킨 후 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액(crystal violet solution)을 이용하여 웰에 남아있는 세포를 모두 염색시켰다. 세포를 염색한 후 남은 크리스탈 바이올렛 용액을 모두 버린 후 건조시켰다. 33% 아세트산으로 각 웰에 일정량씩 처리한 후 크리스탈 바이올렛 용액을 유출시켰다. 유출된 용액을 다른 96 웰 플래이트에 옮긴 후 ELISA 측정기(reader)기를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 어떤 한약재도 처리하지 않은 군으로 하였으며, 하기 수학식 4를 이용하여 세포 생존율을 구하였다.
진교 추출물에 대해서 1㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도에서 세포 독성 측정 결과, 하기 표 5를 보듯이 진교 추출물은 한약재를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 100㎍/㎖의 농도에서도 세포량이 증가하는 것으로 나타나 진교 추출물은 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.
<수학식 4>
세포 생존율 (%) = AS/AC × 100
(상기 식에서, AS: 시료 첨가군의 흡광도, AC: 대조군의 흡광도)
농도 |
1 ㎍/㎖ |
100 ㎍/㎖ |
대조군 |
100.0 ± 6.93 |
100.0 ± 6.93 |
진교 |
127.5 ± 15.76 |
115.5 ± 2.27 |
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1: 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
진교 추출물 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
진교 추출물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
진교 추출물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 2: 연고제제
2-1: 지용성(W/O 제형) 연고
조성 |
함량(%) |
진교 추출물 |
0.01-10.0 |
스테아릴 알콜 |
7.0 |
스테아린산 |
2.2 |
스쿠알렌 |
3.4 |
옥틸두오데칸올 |
5.0 |
올리브유 |
6.0 |
글리세린모노하우릴 지방산 에스텔 |
10.0 |
이소프로필 아디페이트 |
2.0 |
테고 |
0.3 |
카복실비닐폴리머 |
3.0 |
프로필렌 글리콜 |
5.0 |
코직산 |
0.05 |
알파-케토글루타민산 |
0.2 |
시스테인 |
0.2 |
파라벤류 |
0.3 |
멸균 정제수 또는 0.02M 인산 또는 충용액 |
잔부 |
총량 |
100 |
연고조제 시 상기 표 6의 조성 성분 중 카복시비닐폴리머 및 코직산을 제외한 나머지 성분을 60℃이상에서 유화시킨 다음 교반하면서 카복시 비닐폴리머를 가하였다. 냉각 후 적당한 점도를 갖을 때 코직산 등 나머지 수상성분을 교반하면서 균질이 되도록 서서히 가한 다음 성숙을 위해 방치한 후 완제품으로 하였다.
2-2: 친수성(O/W형) 연고
조성 |
함량(%) |
진교 추출물 |
0.01-10.0 |
백색바세린 |
25.0 |
스테아릴알콜 |
20.0 |
프로필렌글리콜 |
12.0 |
프로필렌미스스틴산 |
0.1 |
소디움 글리세린 모노라우렐 |
0.2 |
폴리옥시에틸렌경화피마자유 |
4.0 |
베타인 함유 양이온성 유화제 |
0.2 |
모노스테아린산글리세린에스텔 |
0.1 |
파라옥시안식향산프로필 |
0.1 |
정제수 |
잔부 |
총량 |
100 |
상기 표 7의 조성으로 실시예 2-1과 같은 상법으로 제조하여, 수중유형(O/W)연고제를 얻었다.
제제예 3: 크림
조성 |
함량(%) |
진교 추출물 |
0.01-10.0 |
유동파라핀 |
6.0 |
스쿠알란 |
4.0 |
소르비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
밀랍 |
10.0 |
카프필릭/카프릭프리글리세라이드 |
5.0 |
부틸렌글리콜 |
6.0 |
프리에탄올아민 |
3.0 |
방부제 |
2.0 |
향료 |
미량 |
정제수 |
잔부 |
총량 |
100 |
상기 표 8의 조성으로 진교 추출물을 함유하는 크림을 통상의 방법에 따라 제조할 수 있었다.