KR101751590B1 - 마늘대 추출물을 함유하는 항염증성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마늘대(Allium sativum L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마늘대 추출물을 함유하는, 항염증 조성물에 관한 것이다.

Description

마늘대 추출물을 함유하는 항염증성 화장료 조성물{An anti-inflammatory Cosmetic Composition comprising the extracts of Allium sativum L. stems}

본 발명은 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증성 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.

산화 스트레스는 노화 및 각종 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 자가면역반응과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는데, 그 대표적인 것으로 산화 스트레스에 의한 염증 반응인 아토피, 비염, 천식, 알레르기 등이 있다.

염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 프로스타글라딘 (prostaglandins), 하이드록시에이코사테트라에노익에시드 (hydroxyeicosatetraenoic acid), 류코트리엔 (leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과정이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증반응은 오히려 점막 손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 일으킨다 (Willoughby, D. A., Ann. Rheum. Dis., 34(6) 471, 1975)

염증반응이 일어나면 NO(nitric oxide), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6), 프로스타클라딘 E2(PGE₂), iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등 염증 매개물질을 분비하며 염증 뿐만아니라 만성질환에서도 깊숙이 관여하고 있기 때문에 염증반응을 억제하는 물질은 만성질환을 예방하거나 억제하기 위한 기능성 물질로 사용될 가능성이 높다

산화질소(Nitric oxide, NO)는 여러 조직과 세포들에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 합성되며 혈관확장, 신경전달, 혈액응고, 면역기능 조절 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. NOS는 크게 cNOS와 iNOS의 두 가지 그룹으로 나눌 수 있다. 즉, 신경(neuronal), 혈관내피(endothelial) NOS는 cNOS에 속하며 이는 Ca^{2 +}-calmodulcin 의존성이며 평상시에도 지속적으로 NO를 분비하고 있어 항상성을 조절한다. 반면에 iNOS는 IFN-γ, IL-1, TNF-α 등의 사이토카인(cytokine)이나 박테리아의 LPS(lipopolysaccharide)에 의해서 활성화되며 연개반응을 통해 장시간 동안 대량의 NO를 생성하게 된다. 이 NO는 대식세포(macrophage)의 세포독성활성(cytotoxic activity)에 큰 영향을 미치므로 미생물이나 종양세포로부터 숙주를 방어하는 중요한 역할을 하고 있다. 하지만, 과생성된 NO에 의해서 류마티스 관절염 같은 염증반응이 악화시키므로 유해한 작용을 나타내게 된다. 위와 같이 자극된 iNOS는 대식세포(macrophage)와 간세포(hepatocytes)에 존재하게 되며, 염증이 다른 병원균들과 관여하는 동안 NO 생성은 현저하게 증가하고, 세포독성을 나타나게 된다. 더욱이 정상적인 NO의 자유 라디칼(free radical)과 과산화질소를 생성하기 위한 산소(oxygen)와의 커다란 반응으로 산화력의 상실을 야기할 수 있는 강력한 전-산화제 분자(pro-oxidant molcule)인 NO를 만든다. 그러므로 염증성 자극의 반응에서 NO생성의 저해는 염증성 질병에서 치료적 방법으로 사용될 수 있다

자유 라디칼 및 다른 반응성 산소종들은 음식물내의 외인성 화합물 또는 인체내에서의 내인성 대사 과정에 의해 생성된다. 라디칼들은 생분자들을 산화시켜 산화적 손상(oxidative damage)을 일으켜 세포 사멸이나 조직 손상에 이르게 할 수 있다. 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 암(cancer), 기종(emphysema), 간경변(cirrhosis) 및 관절염(arthritis)이 산화적 손상과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 산화적 손상은 인간 질병에서 매우 중요한 병리학적 역할을 하며 항산화 보충제 또는 항산화물질을 포함하는 식품의 섭취는 인체에서 산화적 손상을 감소시키기 때문에 매우 중요하다. 최근 들어, 비타민 C, E, 세사몰(sesamol) 및 카르노스산(carnosic acid) 등과 같은 식품내의 천연 항산화물질이 소비자들에게 제공되어 왔다.

지금까지 일류가 개발한 약제 중 가장 강력한 항염증 작용을 지니고 있는 약제는 스테로이드 제제이다. 그러나 장기적으로 사용할 때 반드시 부작용을 수반하게 된다. 따라서 천식 치료에 있어 스테로이드제는 처음 사용할 때 놀라울 정도의 효과를 발휘하여 증상을 완전 소실시켜버리지만 이는 잠시일 뿐이고, 증상은 스테로이드 사용을 중지함과 함께 다시 나타나며 반복사용과 함께 증상은 더욱 심해져 간다. 스테로이드제의 부작용으로는 둥근 다혈성의 얼굴, 체액의 저류, 부신억제, 감염에 대한 감수성의 증가와 기타 정신병, 백내장, 녹내장, 소화성궤양, 창상치유지연, 초기 감염의 재활성화 등의 많은 부작용을 가지고 있다(Check WA & Kaliner MA, Am. Rev.Respir. Dis., 141:44-51. 1990).

따라서 천연식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약품이나, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취할 수 있으며 염증을 억제할 수 효과가 있고, 용이하게 식품에 이용할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 폐자원으로 인식되는 마늘대를 활용하면서도, 부작용을 초래하지 않는, 염증성 질환 치료에 효과적인 천연식물 추출물 유래 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 마늘대에서 추출한 마늘대 추출물이 우수한 NO 생성 억제능 및 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokines) TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6), 프로스타클라딘 E2(PGE₂) 및 염증성 매개물질 iNOS (inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2)의 생성 억제능을 가지는 점을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

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본 발명의 주된 목적은 마늘대 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 마늘대 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 마늘대 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강 기능성 식품을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 추출물은 마늘대의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물일 수 있다..

상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물이 바람직하고, 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매로부터 가용한 추출물이 바람직하며, 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물이 바람직하다.

특히, 본 발명의 마늘대 추출물은 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 열수추출물 또는 에탄올추출물인 것이 가장 바람직하다.

그리고, 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 상기 마늘대 추출물은 0.1 내지 50% 중량으로 포함될 수 있다. 바람직하게는 상기 마늘대 추출물은 90~110g/mL, 가장 바람직하게는 약 100 g/mL 농도로 사용한다.

상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염,근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환 등을 포함한다. 특히, 피부염 또는 아토피에 유용한 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로서, 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

이처럼, 본 발명은 마늘대 추출물의 항산화 및 항염증 기능, 보다 구체적으로는 NO 생성 억제능 및 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE₂ 및 염증성 매개물질 iNOS, COX-2의 생성 억제능을 이용하는 다양한 용도를 모두 포함한다.

본 발명에 따른 마늘대 추출물을 함유하는 조성물은 우수한 항염증 및 항천식 활성을 가지고, 세포독성이 거의 없으므로, 염증관련 질환, 알레르기 및 천식 등의 예방 및 치료를 위한 의약품, 화장품, 가공식품, 기능성 식품, 식품첨가제, 기능성 음료, 또는 음료첨가제 등의 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

또한, 폐자원으로 인식되는 마늘대를 활용함으로써, 농산 부산물인 마늘대의 활용가치를 올리고 기능성 소재로서의 발굴을 위한 기본적인 자료로 사용할 수 있다.

도 1은 마늘대 열수추출물(ASSW) 및 에탄올추출물(ASSE)의 전자 공여능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 마늘대 열수추출물(ASSW) 및 에탄올추출물(ASSE)의 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 측정한 그래프이다.
도 3은 생쥐 대식세포주 RAW 264.7 세포에서 마늘대 열수추출물(ASSW) 및 에탄올추출물(ASSE)의 생존능에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 NO 생성에 대한 마늘대 열수추출물(ASSW)(A) 및 에탄올추출물(ASSE)(B)의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 LPS로 자극된 사이토카인들의 생성에 대한 마늘대 열수추출물(ASSW) 및 에탄올추출물(ASSE)의 효과를 나타낸 그래프이다[A: IL-6, B: IL-1β, C : TNF-α, D : PGE₂ , ASSW(a), ASSE(b)].
도 6은 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 수준에서 마늘대 열수추출물(ASSW)의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 수준에서 마늘대 에탄올추출물(ASSE)의 영향을 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"염증"이란 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다.

"추출물"은 마늘대의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"극성용매 가용 추출물"은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"비극성용매 가용 추출물"은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

"약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 마늘대 추출물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

"건강 기능식품"이란, 일반 식품에 본 발명의 마늘대 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '건강 기능식품'이라 정의한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 마늘대 추출물의 용도에 관한 것으로, 마늘대 추출물이 내포하고 있는 특정 생리활성 및 기능의 발휘에 관한 것이다.

마늘(Allium sativum L.)은 백합과(Lilliaceae) 파속(Allium)에 속하는 인경작물로서 중앙아시아와 지중해연안 지방으로 전해지고 있으며 우리 나라를 비롯한 중국, 인도, 미국 및 남부유럽등지에서 광범위하게 재배되고 있다. 식재료로 인기가 많으며 마늘 추출물은 고콜레스테롤증, 당뇨병, 혈전증과같은 심혈관계 질병 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 항균, 항산화, 항발암성의 효과를 지니고 있다.

마늘의 성장을 위해서는 5월 초순경부터 마늘대를 뽑아주어야 하는데 이 시기에 제거하지 않게 되면 구근의 성장이 이루어지지 않고 잎줄기도 질기어져 식용할수 없게 된다. 마늘 재배 농가의 부산물인 마늘대는 수확초기에 절임 등으로 일부 이용되나, 그 대부분은 마늘밭에 그대로 폐기 처분되고 있는 실정으로 마늘의 재배량이 증가됨에 따라 그 부산물인 마늘대의 폐기량은 늘어나게 되지만 이에 대한 대책이나 이용방안을 제시하기 위해 수행된 연구는 마늘대를 첨가한 식빵의 제조 정도뿐 거의 없는 실정이다.

즉, 마늘 자체에 대한 항균, 항산화 등의 효과는 종래 몇몇 보고가 있었으나, 폐자원으로 인식되는 이러한 마늘대의 항산화 및 항염증 기능을 규명하고 이의 이용 가능성을 확인한 것은 본 발명자들에 의해서 처음으로 이루어졌다.

본 발명의 마늘대 추출물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있다.

일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

i) 마늘대에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

ii) 단계 i)의 추출물을 여과하는 단계; 및

iii) 단계 ii)의 여과한 추출물을 감압농축한 후 건조하는 단계.

상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 마늘대 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 3 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 iii)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

구체적인 예로서, 본 발명의 마늘대 추출물 또는 조추출물은 마늘대 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올을 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간, 바람직하게는 30 내지 50 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수추출법으로 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 마늘대 조추출물을 얻을 수 있다.

다른 구체예로서, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 50~100% 에탄올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 마늘대의 열수추출물 및 에탄올추출물을 수득하였다.

따라서, 본 발명은 상기 마늘대 추출물을 제조하는 방법을 포함한다.

상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다.예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 추출방법은 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 마늘대 추출물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

본 발명은 상기 제조한 마늘대 추출물의 다양한 항산화 및/또는 항염증 기능에 관한 것이다.

그리고, 본 발명의 일 실시예들을 통해 LPS로 염증을 유도한 Raw 264.7 세포에 대한 열수추출물(ASSW)과 70%에탄올 추출물(ASSE)의 효과를 관찰함으로써, 다음과 같은 구체적인 기능을 확인하였다.

(i) 본 발명의 마늘대 추출물은 페놀성 화합물을 유효성분으로 함유하고 있다.

페놀성 화합물은 페놀성 수산기(phenolic hydroxyl)를 갖기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여 항산화, 항암, 항염증 및 항알레르기 작용 등의 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 이런 페놀성 화합물들은 염증 반응에 관여하는 효소 활성 뿐만 아니라 효소 발현을 조절하여 항염증성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 일상적으로 섭취하고 있는 식용식물에서 천연 항산화제를 탐색하는 연구각 활발히 진행되고 있으며, 현재 알려진 천연 항산화 영양성분으로는 β-carotenem 비타민 E, 비타민 C 등의 비타민과 Se 같은 미량무기질 및 페놀계 화합물들로 이들의 항암효과 또한 항산화 능력에 기인한다고 보고되고 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 마늘대 열수추출물(ASSW)의 폴리페놀 함량은 37.08±1.51 mg(TAE)/g, 에탄올추출물(ASSE)의 폴리페놀 함량은 44.7±1.32 mg(TAE)/g 이 함유되어있음을 확인하였다.

(ii) 본 발명의 마늘대 추출물은 우수한 전자공여능을 가지는 항산화능을 보유한다.

항산화 효과에 널리 사용되는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 분자중에 있는 여분의 전자를 공유함으로서 안정한 자유라디칼의 성질을 가지고 있고, DPPH 용액이 다른 물질과 혼합되면 환원이 많이 될수록 보라색을 잃게 되는 상태를 나타낸다.

이를 이용한 본 발명의 일 실시예인 DPPH 실험과 ABTS+ 실험에서는, 마늘대의 ASSW 및 ASSE 모두에서 전자공여능이 농도의존적으로 증가하였다. DPPH의 경우 1,000 μg/mL에서 대조군인 Vit.C의 반정도의 효과로 항산화능이 있다는 것이 확인되었고, ABTS+의 경우 500 μg/mL 이상부터 대조군인 Vit.C와 비슷한 효과를 나타냄으로서 ASSW, ASSE 모두 항산화능이 있다는 것을 확인하였다.

(iii) 본 발명의 마늘대 추출물은 세포독성을 나타내지 않으면서 우수한 NO 생성 저해능을 보유한다.

본 발명의 일 실시예에서 MTT측정을 통해 세포 독성을 가지지 않음을 확인하였고, 나아가 ASSW, ASSE 모두 25 μg/mL에서부터 유의적으로 NO 분비량이 감소함을 확인하였다. 특히 100 μg/mL의 농도에서 약 18%, 23%의 억제 효과를 보였다.

(iv) 본 발명의 마늘대 추출물은 염증성 사이토카인의 분비를 억제한다.

산화적 스트레스로 인하여 인체에 나타나는 피부 관련 질환의 대다수가 염증을 동반하는데, 이로 인해 노화가 촉진되며, 피부 질환이 더욱 악화되고, IL-1β, TNF-α, IL-6와 같은 염증성 사이토카인이 생성된다.

PGE₂ 또한 NO와 마찬가지로 손상된 부위나 조직에서 통증과 발열의 전달에 주로 관여하는 중요한 염증매개물질로서 COX-2에 의해 합성되는데 과량 생산되면 과도한 면역반응을 야기하여 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 대장암과 같은 각종 염증성 질환을 유발시키게 된다.

IL-6는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 다양한 요인에 의해 합성되어 분비되면서 급성 혹은 만성 염증질환의 발생 및 진행 과정에서 중요한 역할을 하며, TNF-α는 염증 반응 초기에 해당 부위로 호중구를 유도하며, 급성 염증 반응을 일으키고 악화 시키는 인자이고, IL-1β는 대식세포를 활성화시키고, 림프구 및 호중구의 내피세포 접착을 항진시키며, 케모카인의 생성을 유도하여 염증 부위에 염증세포의 침윤을 상승시킨다.

본 발명의 마늘대 추출물은 상기 대식세포의 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-1β 및 PGE₂의 분비량을 농도 의존적으로 억제한다(실시예 6). 특히, 본 발명의 일 실시예에서 PGE₂에 대해 ASSW, ASSE 100 μg/mL의 농도에서 약 55%, 60%의 감소 효과를 보였다.

(v) 본 발명의 마늘대 추출물은 iNOS 및 COX-2 생성도 억제한다.

iNOS(Inducible nitric oxide synthase)에 의해 L-아르기닌으로부터 생성되는 무기 유리체로 정상적인 상태에서는 신경전달, 혈관 확장, 면역 반응 등의 생리적인 기능을 조절하는 중요한 역할을 하지만, 염증 반응에서 과발현된 NO는 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 일으키고 염증을 심화시켜 다양한 세포 및 조직손상을 일으켜 만성 염증 질환 및 자가면역질환 등을 초래하는 것으로 알려져 있다. iNOS의 발현은 세포내 Ca^{2 +} 농도와 관계없이 세균성 독소 또는 염증 및 면역반응, 허혈, 조직손상, 산화성 스트레스 등에 따라 유리되는 여러 종류의 사이토카인(IL-1β, TNF-α 등)에 의해서 유전자 전사단계에서 유도되며, 이에 따라 NO가 대량 생성 유리될 경우에는 질병의 병태생리에 중요한 인자로 관여할 수 있다.

COX-2는 염증 반응뿐만 아니라 혈액응고, 신장기능, 혈관조절 및 면역 반응 등에 관여하고, 염증성 사이토카인이 분비되면 COX-2가 활성화 된다. 또한 COX-2는 염증조직, 악성 종양조직에서 정상세포에 비해 많은 양의 프로스타글라딘의 생성을 유도하여 혈관 생성을 촉진하고 세포의 증식을 도울 뿐 아니라 면역능력을 억제함으로써 암세포 성장에 좋은 환경을 제공하여 COX-2의 발현은 또 다른 질병의 병원성과 직접적인 연관성을 시사하고 있다.

본 발명의 마늘대 추출물, 특히, ASSE는 100 μg/mL의 농도에서 iNOS의 발현량이 현저하게 억제됨을 확인하였고, COX-2의 경우 농도의존적으로 저하되어 특히 50 μg/mL, 100 μg/mL의 구간에서 단백질 발현 저해효과가 있음을 확인하였다.

이와 같이, 마늘대 추출물은 염증 유발에 의해 급격히 증가하는 NO 및 TNF-α의 생성을 억제하고, iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하며, IL-1β, IL-6와 PGE₂ 사이토카인의 양을 현저하게 감소시키는 기능을 가진다.

그러므로, 일 관점에서, 본 발명은 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 "염증성 질환"은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환 등을 포함한다. 바람직하게는 피부염, 알레르기, 아토피이고, 가장 바람직하게는 아토피이다.

본원에서 정의되는 염증성 질환의 예방 및 개선 효과는 NO 생성을 억제하며, TNF-α, IL-6, PGE₂ 및 IL-1β 등의 생성을 억제하는 활성을 통하여 작용함을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 자외선 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 마늘대 추출물을 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 마늘대 추출물은 90~110g/mL, 가장 바람직하게는 약 100 g/mL 농도로 사용한다.

본 발명의 마늘대 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체,부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 마늘대 추출물을 포함하는 조성물은 이미 사용되고 있는 스테로이드성 약물, 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 마늘대 추출물을 함유하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제,캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제,감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 마늘대 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능 식품에 관한 것이다.

기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 마늘대 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 마늘대 추출물의 항천식, 항알레르기, 항아토피 또는 비염 억제 효과 등를 이용하여 염증, 알레르기, 아토피 또는 천식 예방 및 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다. 또한, 이를 이용한 기능성 강화식품 등을 제조할 수 있을 것이다.

즉, 본 발명의 마늘대 추출물을 함유하는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강기능성식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.

이를 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

일 구체예로서, 본 발명의 상기 추출물은 천식 또는 알레르기 질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제,방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 마늘대 추출물 함유 조성물은 생약 성분이기 때문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이처럼, 본 발명은 마늘대 추출물의 항산화 및 항염증 기능, 보다 구체적으로는 NO 생성 억제능 및 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE₂ 및 염증성 매개물질 iNOS, COX-2의 생성 억제능을 이용하는 다양한 용도를 모두 포함한다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다

실험 재료

1. 재료 및 시료 추출

마늘대는 국내산을 구입하여 재료로 사용하였다. 열수추출물(ASSW)의 용매는 시료 중량의 10배 양을 가하여 85℃에서 4 시간씩 3회 반복 추출하였고, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 시료 중량의 10배의 용매를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 여과 및 농축 후 동결건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.

2. 시약 및 기기

(1) 항산화능 및 항염증 측정 시약

항산화능과 항염증 측정 실험에 사용된 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), K₂S₂O₈(potassium peroxodisulfate), ABTS(Diammonium 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)), 타닌산(C₇₆H₅₂O₄₆), p-디메틸아미노벤즈알데하이드, 소듐 니트레이트, 그리스 시약(griess reagent), 리파 버퍼(ripa buffer), 지질다당류(lipopolysaccharide), 프로테아제 저해제(protease inhibitor) 등은 Sigma Chemical Co. Ltd(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, 페놀 시약은 Junsei chemical co.,Ltd(Tokyo, JAPAN), 소듐 카르보네이트 무수물(Na₂CO₃)는 DUKSAN(Kyngkido, KOREA). PGE₂ 와 사이토카인 측정을 위한 ELISA kit는 R&D systems Inc.,(Minneapolis, MIN, USA)에서 구입하였으며 1차 항체인 iNOS, COX-2, β-액틴과 2차 항체들은 Santa Cruz(Biotech, CA, USA)에서 구입하였다.

(2) 세포 생존율 측정에 사용된 세포 주 및 시약

세포 생존율 측정에 사용된 세포주 Raw 264.7은 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정 시약 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS(fetal bovine serum), 0.25% 트립신-EDTA, 0.4% 트립판 블루 스테인은 (Gibco BRL Co, Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였고, MTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)는 (Sigma Chemical Co. Ltd, St. Louis, MO, USA), ELISA 키트는(Mouse ELISA set, R&D Systems, Minneapolis, MN 55413, USA) 에 구입하여 사용하였다.

(3) 실험에 사용된 기기

기기는 회전식 진공 증발농축기(rotary vacuum evaporator)(Eyela CA-1112. Japan), 원심분리기(Vision, Korea), 동결 건조기(freeze drier)(Ilsin, Korea),현미경, microscope(Olympus optical Co, Japan), CO₂ 인큐베이터(Hanb aek Scientific Co. Korea), pH 측정기(HANNA instruments, Korea), BOD 인큐베이터 (Vision scientific Co., Korea), 오토클레이브(Hanbaek Scientific Co., Korea), ELISA 리더기(Molecular Devices, USA)를 사용하였다.

실험 방법 .

1. 세포 배양

본 실험에 이용한 Raw 264.7 세포의 배양은 10% FBS과 1% 페니실린/스트렙토마이신(100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 적응시켜 계대 배양하였다.

2. MTT 분석법에 의한 세포 독성 확인

세포 독성 측정은 Carmichael(Carmichael J et al., Cancer Res. 47(4), 936-942)의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.7 세포들은 은 96 웰 플레이트에 5×10⁴ cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02mL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

마늘대 10, 25, 50, 100, 250, 400 μg/mL 농도별로 24 시간 동안 처리하였다. 여기에 2.5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 웰 당 DMSO 0.1 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 리더기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

3. NO(Nitric oxide) 저해활성 측정

NO 측정은 세포의 상청액(supernatant)에서의 NO의 양을 니트라이트(nitrite, 아질산염) 및 니트레이트(nitrate, 질산염)로서 측정을 하였다.

니트라이트에 대한 니트레이트로 환원된 후의 안전한 형태인 그리스 시약(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 웰 플레이트에 2×10⁶개의 세포를 컨플루언스가80%일 때, 1X PBS로 2번 세척한 후 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 다음 LPS(lipopolysacchride) 10 μg/mL을 대조군을 뺀 모든 웰에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 24시간 후에 상청액을 모아 그리스 시약으로 10분간 반응시킨 후에 540nm에서 흡광도로 측정하였다.

LPS는 그람-음성 박테리아의 세포외막에 존재하며, 대식세포 (macrophage) 또는 단핵세포 (monocyte)에서 산화질소 (nitric oxide), 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokines), 프로스타글란딘 E2와 같은 다양한 전구염증성 인자들을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Lee et. al., Bio. Pharm. Bull. 27(5), 617, 2004)

4. 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 분비량 측정

Raw 264.7 세포를 2×10⁵ cells/mL 로 조절한 후 6 웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 전 배양하였다. 세포에 1 μg/mL의 LPS와 추출물을 동시에 처리하여 24시간 재배양하였다. 세포배양액 내의 IL-6, TNF-α, IL-1β, PGE₂ 사이토카인의 분비량을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.

5. 웨스턴 블랏을 통한 단백질 발현 측정

세포를 1X PBS로 2회 세척 후 RIPA 버퍼 10 mL에 complate mini 1 tab를 가하여 70 μL로 용해해서 4℃ 12,000rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 정량하여 20 μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE에서 전기 영동하여 분리하였다.

분리된 단백질은 Powerpac HC 기기 (BIO RAD, USA)를 이용하여 PVDF 멤브레인에 옮긴 다음 실온에서 30분 동안 블로킹 버퍼 (TBST 중 5% 스킴 밀크)에서 인큐베이션시켰다. 1차 항체를 희석하여 2시간 동안 반응한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 멤브레인을 HRP가 중합된 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 60분 동안 반응시켰다. 3회 세척한 뒤 Davinch-k western imaging system 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.

실시예 1 : 총 폴리페놀 함량 확인

우선, 본 발명의 마늘대 열수추출물 및 에탄올추출물의 폴리페놀 함량을 확인하였다. 타닌산을 기준물질로 지정한 후 표준곡선을 그리고 마늘대의 폴리페놀 함량을 측정하여 표 1에 나타내었다.

샘플	총 페놀양(mg TAE/g)
증류수 추출물	37.08 ± 1.51
70% EtOH 추출물	44.7 ± 1.32

이처럼, 마늘대 열수추출(ASSW)은 37.08 mg/g, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 44.7 mg/g을 나타내었다.

실시예 2 : 전자공여능 확인

본 발명자들은 517 nm의 흡광도에서 자유라디칼 소거 활성능력을 통하여 남아있는DPPH의 비율로 항산화의 기능을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 마늘대 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성능력이 도 1과 같이 나타났다.

ASSW, ASSE 모두에서 농도의존적으로 증가하였으며 1,000 μg/mL에서 ASSW의 경우 44%, ASSE의 경우 50.83%를 나타냈다. 전자공여능의 능력은 ASSW보다 ASSE에서 약간 높은 효과를 보였다.

이러한 결과를 통해 본 발명의 마늘대 추출물은 항산화 효과도 기대할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3 : ABTS + 라디칼 소거 활성 확인

ABTS [Diammonium 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] 라디칼 이온은 추출물의 항산화 활성을 측정하는데 사용되는 파장대를 이용하여 측정하는 실험중 하나로 사용되어오고 있고, ABTS와 과황화 칼륨(potassium persulfate)의 반응을 통하여 푸른색/녹색의 ABTS+ 발색을 띠며, 645 nm, 734 nm, 815 nm의 파장대에서 최대 흡수율을 나타낸다고 보고되어지고 있다.

이에 본 발명의 마늘대 열수추출 및 70% 에탄올 추출물의 ABTS+ 전자공여능을 상기 설명한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 모든 추출물에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며 1,000 μg/mL에서 ASSW의 경우 96.85%, ASSE의 경우 97.79%를 나타내었다. 그러나, 대조군인 Vit.C에서는 1,000 μg/mL에서 99.70%의 ABTS+ 전자공여능을 나타내었다.

이처럼, 최고 농도인 1,000 μg/mL에서 본 발명의 마늘대 추출물과 대조군 Vit.C의 활성이 비슷한 것을 확인함으로써, 본 발명의 마늘대 추출물의 ABTS+ 소거능력이 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 대식 세포( Raw 264.7)의 생존율

마늘대 추출물의 샘플처리 농도에 따른 대식 세포 독성을 MTT 분석법을 이용하여 생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, 마늘대 열수추출물(ASSW)은 100 μg/mL까지는 세포 생존도에 거의 영향을 없었으나, 250 μg/mL 이상에서부터는 농도의존적으로 세포성장률이 저하되었다.

또한, 70% 에탄올추출물(ASSE) 역시 100 μg/mL까지 세포 생존도에 영향이 없었으나, 그 이상의 농도에서는 처리 농도 의존적으로 생존도가 억제되었다.

이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 마늘대 추출물의 항염증 효능 상대적 비교를 위하여 100 μg/mL로 농도를 설정하였다.

실시예 5 : NO 저해 활성 측정 결과

LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 마늘대추출물 농도별(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 상등액속에 있는 NO의 양을 측정하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, ASSW, ASSE 모두 25 μg/mL에서부터 유의적으로 분비량이 감소하였고, 특히 100 μg/mL의 농도에서 약 18%, 23%의 억제 효과를 보였다.

실시예 6 : IL -6, IL -1β, TNF -α, PGE ₂ 생성 억제 효과

대식세포의 염증성 사이토카인 분비량에 미치는 본 발명의 마늘대 추출물의 영향을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 마늘대 ASSW(a), ASSE(b)는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 유의적으로 감소시켰다. 특히, IL-1β는 100 μg/mL의 농도에서, IL-6는 100 μg/mL의 농도에서, TNF-α 는 100 μg/mL의 농도에서 각각 유의한 감소를 나타냈다.

PGE₂는 ASSW 100 g/mL의 농도구간에서 발현량이 현저하게 감소하였으며, ASSE는 농도 의존적으로 발현량이 감소 되어 100g/mL에서 33.87%의 저해율을 나타내었다(도 5의 D).

본 발명의 마늘대 추출물 ASSE는 ASSW 보다 염증 관련 사이토카인의 생성 억제가 다소 높았지만, 두 추출물 모두 다른 염증 세포들의 이주를 비롯하여 활성과 분화도 감소시킬 수 있음을 시사하였다.

실시예 7 : iNOS 및 COX -2 생성 억제 효과

본 발명의 마늘대 추출물 ASSW, ASSE의 iNOS, COX-2 단밸질 발현에 대한 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 열수 추출물(ASSW)의 iNOS, COX-2 발현은 100 μg/mL의 농도구간 까지 일정하게 나타났다(도 6),

그리고, 70% EtOH의 추출물에서 iNOS의 발현은 100 μg/mL 농도구간에서 현저하게 억제되었고, COX-2의 발현은 농도의존적으로 저하되어 특히 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도에서 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 7).

이러한 결과를 통해, 본 발명의 마늘대 에탄올 추출물의 경우가 조금 더 높은 항염증 효과를 보이지만, 결론적으로 본 발명의 마늘대 추출물은 항산화능과 항염증 효과를 가지고 있는 바. 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있을 것임을 알 수 있었다.

이와 같이, 일응 효과가 유사할 것으로 예측되는 갈파래의 종류인 구멍갈파래 및 마늘대지만, 각각의 추출물은 NO 생성억제, IL-6 생성억제, PGE2 생성억제 및 MDC 생성억제 능력에 있어서는 본 발명의 마늘대 추출물이 더욱 현저한 효과를 나타내는 바, 염증성 질환의 치료 및 예방에 보다 효과적임을 알 수 있다.

Claims (12)

1. 마늘대(Allium sativum L.) 열수 추출물 또는 70% 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하고, 이 때, 상기 마늘대 추출물을 50 μg/mL 이상 100 μg/mL 이하의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는,
   피부염, 알레르기, 아토피로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.
   
2. 마늘대(Allium sativum L.) 열수 추출물 또는 70% 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하고, 이 때, 상기 마늘대 추출물을 50 μg/mL 이상 100 μg/mL 이하의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는,
   피부염, 알레르기, 아토피로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 질환 예방 및 개선용 약학적 조성물.
   
3. 마늘대(Allium sativum L.) 열수 추출물 또는 70% 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하고, 이 때, 상기 마늘대 추출물을 50 μg/mL 이상 100 μg/mL 이하의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는,
   피부염, 알레르기, 아토피로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염증성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
   
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