본 발명은 이러한 견지에서, 피부노화에 근본적 물질을 찾고자하여 자연의 여러 가지 천연물질들 중에서 노화예방에 유효한 물질을 검색한 결과, 마늘과 가시 오갈피로부터 추출한 추출물이 매우 우수한 프리 라디칼 소거작용, 항산화작용, 세포막 보호작용 및 세포 증식 작용 등의 효능을 나타냄을 발견하였으며 마늘의 자극적인 냄새와 혼합 추출물의 안정성, 안전성 문제를 동시에 해결하였다. 또한 화장료 조성물에서 일정농도 이상 배합하여 사람 피부에 직접 도포한 실험 결과에서도 뚜렷한 피부 탄력 및 노화로 기인한 피부상태가 개선되는 효과를 발휘하게 됨을 발견하게 되었다. 본 발명은 프리라디칼 소거작용, 항산화작용, 세포막 보호작용 및 세포 증식 작용 효과를 가짐으로 인해 피부노화를 근본적으로 막을 수 있는 무취마늘추출물과 가시 오갈피 혼합 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
마늘은 백합과에 속하는 온화한 기후를 좋아하는 다년생 채소로 거의 연간 공급이 가능한 채소이고 우리나라 국민의 식생활에 있어서 꼭 필요한 조미료이다. 이러한 마늘은 혈액 순환을 촉진하며, 살균작용, 빈혈증, 냉증에 좋다고 알려져 왔다. 연구된 약리학적 효과를 보면 노화방지, 면역력과 저항력 강화, 살균, 항균작용, 피로회복, 체력 증진, 알레르기 억제, 호르몬 분비촉진 작용 등 국내외에 무수히 많은 연구가 되어 있다. (약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, 향약대사전, 영림사, 신민교)
또한, 가시 오갈피는 오갈피 나무과에 속하는 낙엽성 관목으로 껍질을 약재로 많이 쓰고 있다. 인삼의 효능을 능가하는 효능을 가지고 있어 본초강목에 따르면 "한 묶음의 가시오갈피를 얻는 것이 한 마차의 황금을 얻는 것보다 낫다"고 극찬하고 있다. 항노화, 면역기능증진, 만성피로회복, 피부미용, 염증소멸, 항스트레스, 세포의 산성화 방지 등에 뛰어난 약리 효능을 지니고 있다. (한국가시오갈피 재배협회 자료, 토종약초장수법, 태일출판사, 최진규)
본 발명의 무취마늘 추출물 제조 방법은 다음과 같다.
일차로 생마늘을 껍질을 벗기고 상처가 없는 마늘을 선별하여 정제수로 깨끗이 씻은 후 끓는 정제수에 5-10분 침지시킨다. 다음 10℃ 이하의 찬물에 냉침시킨 후 물을 뺀다. 이렇게 전처리 된 마늘을 물, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 용매를 5∼10배 부피량을 가한다. 추출 방법으로는 5-25℃에서 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용한다. 추출된 액을 여과한 후 0.1∼0.5%의 활성탄을 넣고 30분∼5시간 가량 혼합한 후 30∼50℃에서 방치하여 잔류 마늘냄새를 탈취한다. 이렇게 추출한 무취 마늘 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 그 건조중량으로서 0.01-1%, 바람직하게는 0.1-0.5%의 양으로 화장료에 첨가하는 것이다.
가시 오갈피 추출물 제조 방법은 다음과 같다.
일차로 가시 오갈피 뿌리 껍질을 완전 건조한 후 건조중량에 대하여 추출 용매로서 물, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 용매를 1-20배 부피량을 가한다. 추출 방법으로는 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50-95℃, 3-10시간 가열하여 추출하거나 5-37℃에서 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이렇게 추출한 가시 오갈피 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 그 건조중량으로서 0.01-3%, 바람직하게는 0.2-1%의 양으로 화장료에 첨가하는 것이다.
본 발명의 무취 마늘 추출물과 가시 오갈피 추출물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 영양에센스, 유화형 파운데이션과 같은 화장료 제형에 부가된다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다.
무취마늘 추출물의 제조
실시예 1.
전처리된 마늘 500g을 물 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지 믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 34g(건조중량)을 얻었다.
실시예 2.
전처리된 마늘 500g을 30%에탄올 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지 믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 31g(건조중량)을 얻었다.
실시예 3.
전처리된 마늘 500g을 30% 부틸렌글리콜 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지 믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 39g(건조중량)을 얻었다.
실시예 4.
전처리된 마늘 500g을 30% 프로필렌글리콜 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 30g(건조중량)을 얻었다.
실시예 5.
전처리된 마늘 500g을 30% 글리세린 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지 믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 33g(건조중량)을 얻었다.
실시예 6.
전처리된 마늘 500g을 메탄올 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지 믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 29g(건조중량)을 얻었다.
실시예 7.
전처리된 마늘 500g을 에틸아세테이트 4kg에 넣고 5-25℃에서 7일간 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 이 추출물에 활성탄 0.2%를 넣고 1시간 동안 아지 믹서로 혼합한 다음 35℃에서 방치시킨다. 다음으로 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 5g(건조중량)을 얻었다.
가시 오갈피 추출물의 제조
실시예 8.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 물 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 72g(건조중량)을 얻었다.
실시예 9.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 30% 에탄올 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 70g(건조중량)을 얻었다.
실시예 10.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 30% 부틸렌글리콜 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 78g(건조중량)을 얻었다.
실시예 11.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 30% 프로필렌글리콜 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 65g(건조중량)을 얻었다.
실시예 12.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 30% 글리세린 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 75g(건조중량)을 얻었다.
실시예 13.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 30% 메탄올 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 63g(건조중량)을 얻었다.
실시예 14.
가시오갈피 1kg을 완전 건조시킨 다음 30% 에틸아세테이트 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃, 5시간 가열 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과한다. 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번, 5번 여과지로 여과 한 후 최종 0.4㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 이 여액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 80℃로 감압 농축하여 68g(건조중량)을 얻었다.
무취마늘 추출물과 가시 오갈피 추출물의 혼합물 제조
실시예 15.
실시예 3의 무취 마늘 추출물 고형분 5g과 실시예 10의 가시 오갈피 추출물 고형분 5g을 혼합하여 부틸렌글리콜 30% 수용액 100g에 용해시켰다.
실시예 16.
실시예 3의 무취 마늘 추출물 고형분 3g과 실시예 10의 가시 오갈피 추출물 고형분 7g을 혼합하여 부틸렌글리콜 30% 수용액 100g에 용해시켰다.
실시예 17.
실시예 3의 무취 마늘 추출물 고형분 7g과 실시예 10의 가시 오갈피 추출물 고형분 3g을 혼합하여 부틸렌글리콜 30% 수용액 100g에 용해시켰다.
실시예 18.
실시예 3의 무취 마늘 추출물 고형분 4g과 실시예 10의 가시 오갈피 추출물 고형분 6g을 혼합하여 부틸렌글리콜 30% 수용액 100g에 용해시켰다.
실시예 19.
실시예 3의 무취 마늘 추출물 고형분 6g과 실시예 10의 가시 오갈피 추출물 고형분 4g을 혼합하여 부틸렌글리콜 30% 수용액 100g에 용해시켰다.
실시예 20.
실시예 3의 무취 마늘 추출물 고형분 2g과 실시예 10의 가시 오갈피 추출물 고형분 8g을 혼합하여 부틸렌글리콜 30% 수용액 100g에 용해시켰다.
실험예 1. 항산화 효과 실험
항산화 효과 측정은 펜톤반응 (Fenton reaction)에 의한 지질과산화 반응계(lipid peroxidation system)을 이용한 티오부틸레이트아세트산(TBA) 시험으로 측정 하였다. 에틸리놀레이트 10㎕, 0.02% 도데실황산염, 염화제이철 10㎛ol, 과산화수소 2㎛ol을 함유하는 25mM 트리스 완충용액/ 0.75mM 칼륨 완충용액 5ml에 각 실시예의 추출물의 도데실메칠황산염 용액을 가한 후 55℃에서 16시간 배양 후, 4 % 부틸히드록실톨루엔 50㎕를 가한 후 반응을 정지시켰다. 다음 이 용액 0.3ml을 시험관에 넣고 0.05M 염산 3.0ml, 0.67% 티오부틸레이트아세트산 용액을 가하고 30분간 끓였다. 이 반응액을 냉각시킨 후 85% 부탄올 4.0ml을 가하고 원심 분리 후 부탄올 등의 흡광도를 535nm에서 측정하여 항산화 효과(%)를 구하였다. 이때 대조시험을 동시에 실시하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 게시하였다.
실시예 16의 추출 혼합물에 대한 항산화 효과는 도 1에 그래프로 도시하였다.
표 1. 항산화 효과
실 시 예 |
반응액중에 함유시킨 추출 혼합물의최종 농도(㎍/㎖) |
항산화 효과(%) |
실시예 1 |
1,000100 |
7525 |
실시예 2 |
1,000100 |
8723 |
실시예 3 |
1,000100 |
8929 |
실시예 4 |
1,000100 |
8535 |
실시예 5 |
1,000100 |
8431 |
실시예 6 |
1,000100 |
7215 |
실시예 7 |
1,000100 |
7019 |
실시예 8 |
1,000100 |
8734 |
실시예 9 |
1,000100 |
7015 |
실시예 10 |
1,000100 |
9039 |
실시예 11 |
1,000100 |
8825 |
실시예 12 |
1,000100 |
9133 |
실시예 13 |
1,000100 |
8239 |
실시예 14 |
1,000100 |
8825 |
실시예 15 |
1,000100 |
9042 |
실시예 16 |
1,000100 |
9547 |
실시예 17 |
1,000100 |
9019 |
실시예 18 |
1,000100 |
9034 |
실시예 19 |
1,000100 |
9229 |
실시예 20 |
1,000100 |
9223 |
실험예 2. 프리 라디칼 소거 효능 실험
60 ㎛의 디펜닐피크릴히드라질(DPPH)용액 2ml에 각 실시예의 추출물을 각 농도별로 상온에서 10분간 반응 시킨후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 프리라디칼 소거작용 (%)를 구했다. 이때 대조시험을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 2에 기재하였고, 실시예 16의 추출 혼합물에 대한 프리 라디칼 소거 결과는 도 2에 그래프로 도시하였다.
표 2. 프리 라디칼 소거작용 효과
실 시 예 |
반응액중에 함유시킨 추출 혼합물의최종 농도(㎍/㎖) |
프리라디칼 소거작용(%) |
실시예 1 |
10010 |
8834 |
실시예 2 |
10010 |
8923 |
실시예 3 |
10010 |
9243 |
실시예 4 |
10010 |
7942 |
실시예 5 |
10010 |
8924 |
실시예 6 |
10010 |
8735 |
실시예 7 |
10010 |
8138 |
실시예 8 |
10010 |
8938 |
실시예 9 |
10010 |
9144 |
실시예 10 |
10010 |
9039 |
실시예 11 |
10010 |
8432 |
실시예 12 |
10010 |
8824 |
실시예 13 |
10010 |
8035 |
실시예 14 |
10010 |
8942 |
실시예 15 |
10010 |
9443 |
실시예 16 |
10010 |
9850 |
실시예 17 |
10010 |
9038 |
실시예 18 |
10010 |
9139 |
실시예 19 |
10010 |
9240 |
실시예 20 |
10010 |
9036 |
실험예 3. 항염증 실험
마우스 좌측 귀를 대조부위, 우측 귀를 시험부위로 하여 추출 혼합물을 적용 전 에탄올로 귀를 깨끗하게 세척하고 시료 20㎕를 1일 1회 4일간 지속적으로 도포하고 마지막 도포 1시간 후에 좌측 귀에 에탄올을 우측 귀에는아라키돈산(Arachidonic acid)을 2㎎/ear을 도포하여 1시간 후 귀의부종(ear edema) 정도를 마이크로미터로 양쪽 귀를 3회씩 반복 측정하였다.
항염효과는 아라키돈산(Arachidonic acid) 처리군을 기준으로 부종억제 정도로 판정하였으며 그 결과를 표 3에 나타내었다.
※ 억제율(%) = (A―B) / A × 100
A : 대조군귀의 평균두께(아라키돈산 처리귀의 두께-비처리 귀의두께)
B : 추출 혼합물 도포군 귀의두께(시료처리귀의 두께-비처리귀의 두께)
실시예 16의 추출 혼합물에 대해 측정된 항염 효과는 도 3에 그래프로 도시하였다.
표 3. 항염 효과
시료 |
반응액중에 함유시킨최종농도(㎍/ml) |
용매 |
귀두께(㎛) |
억제율(%) |
시료처리전 |
시료처리후 |
Indomethacin |
1.0 |
에탄올 |
320 |
465 |
42.5 |
아라키돈산 |
2㎎/ear |
에탄올 |
299 |
551 |
- |
실시예 1 |
1.0 |
에탄올 |
269 |
486 |
13.8 |
실시예 2 |
1.0 |
에탄올 |
241 |
446 |
17.8 |
실시예 3 |
1.0 |
에탄올 |
285 |
489 |
18.9 |
실시예 4 |
1.0 |
에탄올 |
285 |
497 |
15.9 |
실시예 5 |
1.0 |
에탄올 |
259 |
467 |
17.4 |
실시예 6 |
1.0 |
에탄올 |
285 |
504 |
12.4 |
실시예 7 |
1.0 |
에탄올 |
296 |
510 |
13.8 |
실시예 8 |
1.0 |
에탄올 |
284 |
505 |
12.4 |
실시예 9 |
1.0 |
에탄올 |
294 |
511 |
13.8 |
실시예 10 |
1.0 |
에탄올 |
295 |
498 |
19.6 |
실시예 11 |
1.0 |
에탄올 |
320 |
515 |
18.3 |
실시예 12 |
1.0 |
에탄올 |
295 |
503 |
17.4 |
실시예 13 |
1.0 |
에탄올 |
268 |
483 |
14.7 |
실시예 14 |
1.0 |
에탄올 |
310 |
513 |
19.5 |
실시예 15 |
1.0 |
에탄올 |
270 |
473 |
19.8 |
실시예 16 |
1.0 |
에탄올 |
283 |
489 |
22.0 |
실시예 17 |
1.0 |
에탄올 |
296 |
503 |
18.6 |
실시예 18 |
1.0 |
에탄올 |
295 |
495 |
20.6 |
실시예 19 |
1.0 |
에탄올 |
295 |
495 |
20.6 |
실시예 20 |
1.0 |
에탄올 |
296 |
497 |
20.5 |
실험예 4. 세포막 보호 실험
실험에 사용된 적혈구(백혈구 제거된 상태)는 뉴질랜드산 알비노(Albino) 토끼로부터 채혈하여 사용하였다. 적혈구 현탁액은 700nm에서 O.D가 0.6이었고, 적혈구 수는 1.5×107cells/ml 이었다.
추출 혼합물 50㎕을 적혈구 현탁액에 첨가하고 암소에서 30분간 예비 배양(pre-incubation)시킨 후, 광증감제(rose-bengal)를 가하고 광조사 하였다. 15분간 광조사 후, 후 배양(post-incubation)에 의한 적혈구의 파괴정도를 15분 간격으로 700nm에서 투광도(% transmittance)로부터 구하였다. 추출 혼합물의 광용혈에 미치는 효과는 후 배양(post-incubation) 시간과 용혈 정도를 나타내는τ 50 으로 나타냈다.τ 50 값은 적혈구 세포가 50% 용혈 되는데 소요되는 시간(분)으로 하였다. 대조군은 1,3-부틸렌글리콜이다. 결과를 표 4에 기재하였다.
실시예 16의 추출 혼합물에 대한 세포막 보호 효과 측정 결과는 도 4에 그래프로 도시하였다.
표 4. 세포막 보호 효과
실 시 예 |
반응액중에 함유시킨 시료의최종 농도(㎍/㎖) |
세포막 보호작용(τ 50 : min) |
Control |
100 |
20 |
실시예 1 |
100 |
186 |
실시예 2 |
100 |
175 |
실시예 3 |
100 |
215 |
실시예 4 |
100 |
192 |
실시예 5 |
100 |
163 |
실시예 6 |
100 |
154 |
실시예 7 |
100 |
170 |
실시예 8 |
100 |
250 |
실시예 9 |
100 |
236 |
실시예 10 |
100 |
285 |
실시예 11 |
100 |
225 |
실시예 12 |
100 |
255 |
실시예 13 |
100 |
210 |
실시예 14 |
100 |
260 |
실시예 15 |
100 |
290 |
실시예 16 |
100 |
305 |
실시예 17 |
100 |
295 |
실시예 18 |
100 |
300 |
실시예 19 |
100 |
298 |
실시예 20 |
100 |
295 |
실험예 5. 세포증식 효과 실험
96 microwell plate 에 5% 어린 송아지 혈청(FBS) 용액 100㎕씩 넣은 다음, 2% FBS 가 함유된 DMEM 배지에 시료를 일정농도 분산시켜 묽혀 100㎕씩 다시 첨가하였다. 혈구계를 이용하여 신생아의 포피(foreskin)조직에서 얻은 섬유아세포를 웰당 4000개씩 100㎕배지에 분산시켜 가한 후 7일간 배양 하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거 하고 다시 5%PBS(인산염 완충액) 200㎕씩을 가하여 세척하고 DMSO를 웰당 150㎕씩 가한 후 10분간 흔들어 녹인 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 추출 혼합물을 첨가하지 않고 같은 방법으로 실험을 진행한 것을 대조군으로 하여 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포증식 효과를 비교하였다. 그 결과를 하기 표 5에 게재하였다.
실시예 16의 추출 혼합물에 대한 세포증식 효과의 결과는 도 5에 도시하였다.
표 5. 세포증식 효과
실시예 |
반응액중에 함유시킨 시료의최종농도(㎍/ml) |
세포 증식 효과(%) |
실시예 1 |
10 |
105 |
실시예 2 |
10 |
107 |
실시예 3 |
10 |
113 |
실시예 4 |
10 |
108 |
실시예 5 |
10 |
103 |
실시예 6 |
10 |
109 |
실시예 7 |
10 |
105 |
실시예 8 |
10 |
110 |
실시예 9 |
10 |
107 |
실시예 10 |
10 |
116 |
실시예 11 |
10 |
108 |
실시예 12 |
10 |
109 |
실시예 13 |
10 |
104 |
실시예 14 |
10 |
102 |
실시예 15 |
10 |
116 |
실시예 16 |
10 |
121 |
실시예 17 |
10 |
115 |
실시예 18 |
10 |
117 |
실시예 19 |
10 |
111 |
실시예 20 |
10 |
118 |
처방예 1.
무취 마늘 추출물 및 가시오갈피 추출물을 함유한 화장료중 화장수(스킨 로션)의 처방예는 다음과 같다. 여기에 무취 마늘, 가시 오갈피 추출물은 실시예 16의 것을 말한다.
번호 |
원 료 |
제형예 1 |
비교제형예 1 |
1 |
무취 마늘, 가시 오갈피 추출 혼합물 |
10.0 |
- |
2 |
글리세린 |
3.0 |
3.0 |
3 |
부틸렌 글리콜 |
2.0 |
2.0 |
4 |
프로필렌 글리콜 |
2.0 |
2.0 |
5 |
폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유 |
1.00 |
1.0 |
6 |
에탄올 |
10.0 |
10.0 |
7 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
0.1 |
8 |
방부제 |
미량 |
미량 |
9 |
색소 |
미량 |
미량 |
10 |
향료 |
미량 |
미량 |
11 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
〈제조방법〉
제형예 1: 11번에 2,3,4,8번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5번을 60℃정도 가열하여 용해시킨후 10번을 투입 교반하여 11번에 투입한다. 마지막으로 1,6,7,9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.
비교제형예 1: 11번에 2,3,4,8번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5번을 60℃정도 가열하여 용해시킨후 10번을 투입 교반하여 11번에 투입한다. 마지막으로 6,7,9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.
처방예 2.
무취 마늘 추출물 및 가시오갈피 추출물을 함유한 화장료중 영양로숀의 처방예는 다음과 같다. 여기에 무취 마늘, 가시 오갈피 추출물은 실시예 16의 것을 말한다.
번호 |
원 료 |
제형예 2 |
비교제형예 2 |
1 |
무취 마늘, 가시 오갈피 추출 혼합물 |
10.0 |
- |
2 |
밀납 |
1.00 |
1.0 |
3 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
1.5 |
4 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
0.5 |
5 |
유동파라핀 |
5.0 |
5.0 |
6 |
스쿠알란 |
5.0 |
5.0 |
7 |
소르비탄 스테아레이트 |
1.00 |
1.00 |
8 |
글리세릴 스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 |
1.00 |
1.00 |
9 |
친유성 모노스테아린산 글리세린 |
0.50 |
0.50 |
10 |
스테아린산 |
1.50 |
1.50 |
11 |
부틸렌글리콜 |
5.00 |
5.00 |
12 |
프로필렌글리콜 |
5.00 |
5.00 |
13 |
카르복시비닐폴리머 |
0.1 |
0.1 |
14 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
0.2 |
15 |
방부제 |
미량 |
미량 |
16 |
색소 |
미량 |
미량 |
17 |
향료 |
미량 |
미량 |
18 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
〈제조방법〉
제형예 2 : 11,12,13,15,18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7,8,9,10,14를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 35℃에 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
비교제형예 2 : 11,12,13,15,18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7,8,9,10,14를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
처방예 3.
무취 마늘 추출물 및 가시오갈피 추출물을 함유한 화장료중 영양크림의 처방예는 다음과 같다. 여기에 무취 마늘, 가시 오갈피 추출물은 실시예 16의 것을 말한다.
번호 |
원 료 |
제형예 3 |
비교제형예 3 |
1 |
무취 마늘, 가시 오갈피 추출 혼합물 |
10.0 |
- |
2 |
밀납 |
5.00 |
5.00 |
3 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
1.5 |
4 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
0.5 |
5 |
유동파라핀 |
10.0 |
10.0 |
6 |
스쿠알란 |
10.0 |
5.0 |
7 |
소르비탄 스테아레이트 |
1.00 |
5.0 |
8 |
글리세릴 스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 |
1.00 |
5.0 |
9 |
친유성 모노스테아린산 글리세린 |
0.50 |
0.50 |
10 |
스테아린산 |
1.50 |
1.50 |
11 |
부틸렌글리콜 |
5.00 |
3.00 |
12 |
프로필렌글리콜 |
5.00 |
3.00 |
13 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
0.2 |
14 |
방부제 |
미량 |
미량 |
15 |
색소 |
미량 |
미량 |
16 |
향료 |
미량 |
미량 |
17 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
〈제조방법〉
제형예 3 : 11,12,14,17를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7,8,9,10,13를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 35℃까지 냉각되면 1번을 투입한다. 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
비교제형예 3 : 11,12,,14,17를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7,8,9,10,13를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
처방예 4.
무취 마늘 추출물 및 가시오갈피 추출물을 함유한 화장료중 맛사지 크림의 처방예는 다음과 같다. 여기에 무취 마늘, 가시 오갈피 추출물은 실시예 16의 것을 말한다.
번호 |
원 료 |
제형예 4 |
비교제형예 4 |
1 |
무취 마늘, 가시 오갈피 추출 혼합물 |
10.0 |
-
|
2 |
밀납 |
10.0 |
10.0 |
3 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
1.5 |
4 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.8 |
0.8 |
5 |
유동파라핀 |
40.0 |
40.0 |
6 |
스쿠알란 |
5.0 |
5.0 |
7 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
4.0 |
8 |
카르복시 비닐폴리머 |
0.2 |
0.2 |
9 |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
10 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
11 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
12 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
0.2 |
13 |
방부제 |
미량 |
미량 |
14 |
색소 |
미량 |
미량 |
15 |
향료 |
미량 |
미량 |
16 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
〈제조방법〉
제형예 4 : 8,9,10,11,12,13,16를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 35℃까지 냉각되면 1번을 투입한다. 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
비교제형예 4 : 8,9,10,11,12,13,16를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성 시킨다.
처방예 5.
무취 마늘 추출물 및 가시오갈피 추출물을 함유한 화장료중 영양 에센스의 처방예는 다음과 같다. 여기에 무취 마늘, 가시 오갈피 추출물은 실시예 16의 것을 말한다.
번호 |
원 료 |
제형예 5 |
비교제형예 5 |
1 |
무취 마늘, 가시 오갈피 추출 혼합물 |
10.0 |
- |
2 |
시토 스테롤 |
1.70 |
1.70 |
3 |
폴리글리세릴 2-올레이트 |
1.50 |
1.50 |
4 |
세라마이드 |
0.7 |
0.7 |
5 |
세테아레스-4 |
1.2 |
1.2 |
6 |
콜레스테롤 |
1.5 |
1.5 |
7 |
디세틸포스페이트 |
0.4 |
0.4 |
8 |
농글리세린 |
5.0 |
5.0 |
9 |
선플라우어오일 |
15.0 |
15.0 |
10 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
0.2 |
11 |
산탄검 |
0.2 |
0.2 |
12 |
방부제 |
미량 |
미량 |
13 |
향료 |
미량 |
미량 |
14 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
〈제조방법〉
제형예 5 : 원료물질 2,3,4,5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 10,11,12,13를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.
비교제형예 5 : 원료물질 2,3,4,5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 7, 8 및14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 10,11,12,13를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.
처방예 6.
무취 마늘 추출물 및 가시오갈피 추출물을 함유한 화장료중 유화형 화운데이션의 처방예는 다음과 같다. 여기에 무취 마늘, 가시 오갈피 추출물은 실시예 16의 것을 말한다.
번호 |
원 료 |
제형예 6 |
비교제형예 6 |
1 |
무취 마늘, 가시 오갈피 추출 혼합물 |
10.0 |
- |
2 |
밀납 |
2.0 |
2.0 |
3 |
사이크로메치콘 |
2.0 |
2.0 |
4 |
유동파라핀 |
5.0 |
5.0 |
5 |
스쿠알란 |
5.0 |
5.0 |
6 |
스테아린산 |
2.0 |
2.0 |
7 |
친유성 모노스테아린산 글리세린 |
3.0 |
3.0 |
8 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
4.0 |
9 |
글리세린 |
4.0 |
4.0 |
10 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
11 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
12 |
트리에탄올아민 |
1.0 |
1.0 |
13 |
알루미늄마그네슘실리케이트 |
0.5 |
0.5 |
14 |
안료 |
12 |
12 |
15 |
방부제 |
미량 |
미량 |
16 |
향료 |
미량 |
미량 |
17 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
〈제조방법〉
제형예 6 : 9,10,11,12,13,14,15,17를 혼합, 교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7,8를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 35℃까지 냉각한 뒤 1번을 투입한다. 25℃까지냉각한 뒤 숙성시킨다.
비교제형예 6 : 9,10,11,12,13,14,15,17를 혼합, 교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2,3,4,5,6,7,8를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
실험예 6. 피부 상태 개선효과 확인 실험
제형예 3과 비교제형예 3의 영양크림에 대한 피부도표시 피부상태 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 20∼55세의 여성층으로서 정상, 지성, 건성, 복합성 피부의 소유자 50명을 각각 25%씩으로 구성하여 피부상태 개선과 피부의 유수분 상태를 조사하였다. 동일인에게 안면 윗쪽 부분에는 제형예 3의 영양크림을, 안면 오른쪽 부분에는 비교제형예 3의 영양크림을 매일 아침 세안 후 피부에 1일 1회 20일간 도포한 후 피부상태 개선을 확인하기 위하여 피부상태 개선 정도를 측정하였다. 시험결과를 표 6에 나타내었다.
표 6
|
피부상태 개선 |
비 고 |
인원수 |
% |
제형예 3 |
매우 좋다 |
29 |
58.0 |
|
좋다 |
15 |
30.0 |
보통이다 |
6 |
12.0 |
그저 그렇다 |
- |
- |
비교제형예 3 |
매우 좋다 |
- |
- |
좋다 |
9 |
18.0 |
보통이다 |
18 |
36.0 |
그저 그렇다
|
23
|
46.0
|
상기 조사결과와 같이 무취 마늘 추출물과 가시 오갈피 추출물을 첨가하여 제조한 제형예 3의 화장료가 첨가되지 않고 제조한 비교제형예 3보다 피부 개선효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
실험예 7. 피부에 대한 탄력성 증가 시험
제형예 2와 비교제형예 2의 영양로션을 피부에 도포했을 때 피부의 탄력성이 증가되는 효과를 측정하기 위하여 20세∼55세의 여성층으로서 정상, 지성, 건성, 복합성 피부의 소유자 20명에게 안면 왼쪽부분에는 제형예 2의 영양로션을, 안면 오른쪽부분에는 비교제형예 2의 영양로션을 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하여 사용하게 한 후 1주, 2주, 3주 및 4주후에 피부 탄력 측정기기(Ballistometer)를 이용하여 피부의 탄력성을 측정하였다. 측정결과는 하기 표 7 및 도 6에 나타내었다.
표 7
|
실시예 2의 화장료 |
비교예 2의 화장료 |
비고 |
T0 |
T1 |
T2 |
T3 |
T4 |
T0 |
T1 |
T2 |
T3 |
T4 |
탄력성 |
튀어오름 수 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
|
진폭 |
첫번째 |
1.9 |
5.8 |
6.5 |
7.3 |
8.1 |
1.7 |
3.1 |
3.7 |
3.8 |
4.0 |
두번째 |
1.5 |
4.0 |
5.5 |
6.5 |
7.3 |
1.6 |
2.2 |
2.9 |
2.9 |
3.2 |
세번째 |
0.0 |
3.2 |
4.1 |
5.6 |
6.1 |
0.0 |
0.0 |
2.3 |
2.5 |
2.8 |
네번째 |
0.0 |
0.0 |
2.6 |
4.9 |
5.6 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
평 균 |
0.85 |
3.25 |
4.675 |
6.075 |
6.775 |
0.825 |
1.325 |
2.225 |
2.30 |
2.50 |
(주) T0;사용전
T1; 1주 사용후
T2; 2주 사용후
T3; 3주 사용후
T4; 4주 사용후
이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 무취 마늘 추출물과 가시 오갈피 추출물을 함유하는 제형예 2의 영양로션이 첨가하지 않고 제조된 비교제형예 2의 영양로션에 비해 무취 마늘 추출물과 가시 오갈피 추출물의 피부상태 개선효과에 의해 피부탄력 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 8.
피부탄력성에 대한 추출 혼합물의 영향을 실험하기 위해 20명의 왼쪽눈 가장자리에 하루에 두번 제형예 5를 적용하였다. 오른쪽 눈 가장자리는 비교제형예 5를 적용하였다. 각각 처리하고 난 14일 후 피부 표면의 피부 탄력성을 Cutometer SEM 474에 의해 측정 하였다. Cutometer SEM 474에 의한 피부 탄력도 측정은 주름의 깊이를 측정하는 것으로서, 값이 적을수록 탄력성이 좋은 것이다. 탄력도 값은 대조군에 비해 감소한 값을 %로 나타내었으며, 피검자 20명의 평균값을 결과에 나타내었다. 대조군은 시료를 처리하기 전의 측정값이다. 결과는 하기 표 8 및 도 7에 게시하였다.
표 8.
시 료 |
피부 탄력도(주름깊이 감소) 효과(%) |
15일 |
30일 |
제형예 5 |
8.5 |
19.3 |
비교제형예 5 |
2.3 |
5.9 |