KR100937255B1 - 흑마늘을 이용한 저분자량의 분획된 생리활성 농축분획액의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 숙성 흑마늘로부터 단계적으로 여과하여 무균화된 나노크기의 분획된 생리활성 농축분획액의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 숙성되어 반 건조된 점질성의 흑마늘을 고농도로 액상화하여 단계적인 나노여과를 통해 특정 저분자량 크기 별로 분획하고 제균여과를 함으로써 크기별 특정 분자량의 분획된 생리활성 농축분획액의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 흑마늘은 유효성분을 유지하면서 제균여과되어 위생적이고 장기보존 가능할 뿐만 아니라, 저분자량화 되어 빠른 체내 흡수 효율성과 저분자량 농축액으로 다양한 용도로 적용 가능할 것으로 기대된다.

흑마늘, 나노여과, 생리활성, 제균여과, 저분자량화

Description

흑마늘을 이용한 저분자량의 분획된 생리활성 농축분획액의 제조방법{Fractionation Method for Low Molecular Weight Bioactive Black Garlic Concentrates by Stepwise Nano-filtration of Mature Black Garlic}

본 발명은 숙성 흑마늘로부터 단계적으로 여과하여 무균화된 나노크기의 분획된 생리활성 농축분획액의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 숙성되어 반 건조된 점질성의 흑마늘을 고농도로 액상화하여 단계적인 나노여과를 통해 특정 저분자량 크기 별로 분획하고 제균여과를 함으로써 크기별 특정 분자량의 분획된 생리활성 농축분획액의 제조방법에 관한 것이다.

마늘(Allium sativum L.)은 파, 양파, 부추, 달래 등과 함께 식물분류학적으로 백합과(Liliaceae) 알리움속(Allium)에 속하는 다년생 구근 식물로, 5천 년 이상 재배되어 온 인류 최초의 경작식물 중의 하나이다. 마늘의 1차 기원지는 중앙아시아, 2차 기원지는 지중해지역인 것으로 알려져 있고, 여기로부터 세계로 보급되어 오래전부터 조미 향신료와 의약품으로 널리 이용되어 왔다.

이러한 마늘은 옛날부터 강장, 강정 식품으로 우리 선조들이 널리 이용해 왔으나 오늘날 주로 조미, 향신료, 건강 보조 식품 및 기능성 식품으로 이용되고 있 으며, 과거 10년 간 보고되어 온 예방 효과 식품류 37종 중 마늘이 가장 좋은 것으로 보고했으며, 마늘의 수용성 추출물에 쥐 간암의 증식을 억제하는 물질이 있다고 입증하였다.

마늘의 기능성은 알리신(디아릴 치오설피네이트), 메틸 아릴, 1-프로페닐 아릴, 아릴 1-프로페닐, 1-프로페닐 메틸, 디메틸 치오설피네이츠 화합물이 가장 큰 역할을 한다. 약리 효과로는 항균작용, 항돌연변이작용, 동맥경화개선작용, 면역 증강 및 항암 작용, 이뇨 작용 및 정장 작용, 혈압과 콜레스테롤 저하 효과, 칼슘 흡수의 증진, 비타민 C의 보호작용, 각기병의 치료효능, 항산화 작용과 지구력과 스테미나 증진 작용등의 보고가 있다. 치오설피네이트 화합물의 주요 성분인 알리신(C3H5-S-S(O)-C3H5)은 마늘이 갖는 항균작용, 세포대사 억제 등의 중요한 생화학적 활성을 갖는 가장 잘 알려진 황화합물로서 총 치오설피네이트 중 60∼80%를 차지한다. 마늘의 스테미나 효과의 주된 요인은 스코르디닌의 작용과 알리신 작용이 있다. 마늘은 타 식품에 비해 열량이 많고 탄수화물과 칼슘, 철, 비타민 B1, B2, C 등을 많이 함유하고 있다.

상기 마늘이 함유하고 있는 알리신은 마늘의 주성분으로 알려진 성분으로 실온에서 매우 불안정하여 2 내지 16시간 만에 알리신의 성분이 절반으로 줄어들게 되고 다른 효소들의 작용에 의하여 다른 황화합물로 전환이 되어 마늘 특유의 복합적인 냄새를 야기하게 되는 것으로 알려져 있으며, 또한 물에 대한 용해도가 매우 낮다.

따라서 마늘 특유의 냄새나 자극을 감소시키고 인체에 마늘 함유 성분이 갖 는 고유의 효능을 발휘하는데 더욱 효과적인 마늘의 처리방법들이 개발되어 왔다.

국내 공개특허 제1995-23328호는 마늘을 물에 넣고 고온에서 추출 여과한 후 사이클로덱스트린을 가하고 교반하여 제조하는 것을 특징으로 하는 무취 마늘 엑기스의 제조방법을 개시하고 있고, 국내등록특허 제205498호는 마늘에 유기산 또는 유기산 수용액을 첨가하여 분획, 여과하여 얻은 무취 마늘 추출물을 함유하여 항균효과 및 방부력이 증가된 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있고, 국내등록특허 제571496호는 설탕-과당-올리고당의 혼합용액에 마늘을 넣어 자연발효시킨 1차, 2차 발효추출액을 혼합하고, 이 혼합물을 마늘껍질액과 혼합 후 다시 3차 발효하여 제조된 발효액을 이용한 무취의 기능성 마늘 발효음료 및 그 제법을 개시하고 있으나 상기와 같은 가공제품은 첨가물을 사용하거나 추출물로 제조함으로써 마늘이 가지는 고유의 기능 및 효능성을 감소시킬 뿐만 아니라 그 효능을 더 이상 증대시킬 수가 없는 한계가 있었다.

또한, 국내등록특허 제530386호는 일정온도와 습도에서 자기 발효시켜 마늘 본래의 유효성을 손상시키는 일 없이 항산화력 및 폴리페놀 함량이 증가된 숙성마늘의 제조방법을 개시하고 있으나, 숙성된 마늘의 효과가 충분치 않으며 그 효능을 더 이상 증대시킬 수가 없는 한계가 있고, 국내등록특허 제663168호는 통마늘을 이용한 발효발아 홍마늘의 제조 방법을 개시하고 있으나, 상기 두 특허는 모두 완성된 젤 형태의 숙성마늘의 외피와 내피를 일일이 수작업으로 제거해야하는 공정상의 번거로움과 소비자의 복용의 불편함 및 이에 수반되는 미생물과 같은 오염물질 등의 비위생적인 문제 및 비경제성과 같은 문제가 있었다.

또한 통마늘 자체를 숙성하기 때문 각종 이물질이 포함될 수 있어 비위생적이고, 생마늘 생산과정에서 병해피해를 입었을 경우 속을 볼 수 없어 양질의 상품을 보장할 수 없는 문제가 있었다.

이와같은 마늘에 관한 연구는 식생활 수준의 향상에 따라 그 소비 수요가 계속 증가하고 있으며, 저장 중 손실 경감 및 상품성 보존으로 고품질의 신선한 마늘의 장기 안정 저장 기술의 개발이 요구되고 있으나, 마늘 추출물을 이용한 제품의 유효 성분과 제품 저장 과정 중의 성분 변화에 대한 연구는 미비한 실정이다.

또한, 마늘을 이용한 마늘음료, 마늘쥬스, 마늘환, 다진마늘의 변색반지, 무취화마늘제조, 마늘고추장, 마늘캔디, 과립형 마늘분말이 다수 특허 출원된 바 있으나 마늘의 유효성분을 효과적으로 추출하고 이를 고품질의 건강식품소재로 활용할 수 있는 마늘정제 제조수단이 없었다.

이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 발명된 것으로, 숙성되어 반 건조된 점질성의 흑마늘을 원료로 하여 고농도로 액상화하여 나노크기의 여과막으로 구성된 여과장치로 단계적으로 나노여과를 하여 1만 달톤 초과, 3천 달톤 내지 1만 달톤, 및 3천 달톤 미만의 특정 저분자량 크기 별로 분획한 후, 최종적으로 각 분획을 제균여과를 함으로써 특정한 세가지의 분자량 크기별로 나누어진 위생적이고 장기보존 가능한 고효율의 무균화된 흑마늘 농축분획액의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 숙성 흑마늘로부터 단계적으로 여과하여 무균화된 나노크기의 분획된 생리활성 농축분획액의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 흑마늘 생리활성 농축액은 특정 저분자량으로 크기별 분획을 통하여 흑마늘의 유효성분을 유지한 고효율의 무균화된 흑마늘 농축분획액의 제조방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은,

흑마늘을 이용한 분획된 생리활성 농축분획액을 제조하는 방법에 있어서,

a) 마늘피를 제거한 흑마늘을 숙성 후 반 건조하는 단계;

b) 반 건조된 점질성의 숙성 흑마늘을 수용화하는 단계;

c) 상기 수용화된 숙성 흑마늘의 상층액을 제균여과하는 단계; 및

d) 상기 제균 여과된 숙성 흑마늘을 1만 달톤 (10k Dalton)의 한외여과하는 단계;를 포함하는 흑마늘을 이용한 분획된 생리활성 농축분획액 제조방법을 제공한다.

본 발명의 흑마늘을 이용한 분획된 생리활성 농축분획액 제조방법의 1 단계는 마늘의 외피 및 내피를 제거하는 단계이다.

본 발명에서 사용한 마늘은 생마늘을 그대로 사용하거나, 발아마늘, 건조마늘, 냉장 및 냉동 마늘 등을 사용할 수도 있으며, 수확기 이후 저장된 마늘을 저장 기간에 상관없이 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 마늘의 외피는 통마늘 외피 및 쪽마늘 외피를 모두 포함하며, 내피는 쪽마늘 외피 내부에 마늘을 싸고 있는 얇은 반투명한 막을 의미한다. 상기 마늘의 외피 및 내피의 제거를 용이하게 하기 위하여 마늘을 껍질 채 건조시키거나, 물에 불려 1차적으로 오염될 수 있는 각종 미생물과 곰팡이의 생육 및 박멸함으로써 살균효과를 기대할 수 있으며, 2차적으로 마늘의 각종 효소의 화학적, 효소적 반응을 차단하여 더 이상의 성분 변화를 막을 수 있게 저해하는 효과가 있다.

상기 마늘피가 제거된 마늘은 40 내지 90%의 습도 및 20 내지 50의 저온에서 과일유래의 자연 효소를 이용하여 1년 6개월 내지 2년 동안 저온 숙성한 마늘을 원료로 하여 믹서로 잘게 부순 후 수용화한다.

상기 수용화는 숙성 흑마늘에 대한 음용수 바람직하게는 의약품 제조용수의 용매비 5 내지 40(w/v)의 조건으로 첨가하고 바람직하게는 10 내지 20(w/v)로 하여 믹서로 완전히 갈아서 수용화된 농축액을 제조한 후, 일차적으로 2000 내지 5000rpm으로 10 내지 30분간 원심분리하고 바람직하게는 2500rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득한다.

상기 의약품 제조용수를 흑마늘액 제조용수로 사용함으로써 물로부터 유래될 수 있는 금속미량원소나 엔도톡신 등의 품질저하 성분을 최소화시킴으로써 다른 흑마늘 제품과 차별화가 가능하다.

상기 수득된 상층액은 1 내지 5㎛ 이상의 여과막으로 바람직하게는 3 내지 5㎛ 여과막으로 입자를 제거 한 후, 다시 0.22㎛ 여과막으로 제균여과하여 다음 단계를 진행한다.

상기 제균여과된 숙성 흑마늘을 1만 달톤으로 한외여과를 하여 1만 달톤 초과하는 숙성 흑마늘 여과액은 0.22㎛ 여과막으로 제균여과하는 단계를 더 포함하여 흑마늘을 이용한 1만 달톤 초과하는 1분획된 생리활성 여과분획액을 제조하며, 상기 1만 달톤 미만의 숙성 흑마늘 여과액은 수득한 후, 다음 단계로 3천 달톤의 나노여과 단계를 통해 3천 달톤 내지 1만 달톤의 2분획된 생리활성 여과분획액 및 3천 달톤 미만의 생리활성 여과분획액을 각각 수득한다. 상기 나노여과된 3천 달톤 미만 및 3천 달톤 내지 1만 달톤의 숙성 흑마늘 여과액을 0.22㎛ 여과막으로 제균하는 단계를 더 포함하여 3천 달톤 내지 1만 달톤의 2분획된 생리활성 여과분획액 및 3천 달톤 미만의 3분획된 생리활성 여과분획액을 제조한다.

상기 한외여과를 통한 흑마늘을 이용한 분획된 생리활성 농축분획액은 남아 있는 마늘 고유의 냄새도 제거되고, 단계적으로 특정 분자량 크기별로 분획을 통해 흑마늘이 갖고 있는 수용성 생리활성 유용인자들을 보다 효율적으로 농축하게 되어, 항산화력, 암예방, 콜레스테롤 저하, 동맥경화 개선, 심장질환 예방 등의 이들이 갖고 있는 고유한 능을 그대로 유지하거나 강화할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 흑마늘 생리활성 저분자량 농축분획액 및 식품학적으로 허용되는 식품 보조 첨가제를 함유하는 건강보조식품을 제공하며 상기 흑마늘 생리활성 농축분획액을 유효성분으로 함유하는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 것으로 본 발명의 건강식품 조성물은 흑마늘 생리활성 농축분획액을 유효성분으로 전체 건강보조식품 조성물에 중 0.0001 내지 15중량%로 함유되는 것으로 식품 제형으로는 포도당, 구연산, 액상 올리고당, 옥수수 시럽(corn syrup), 대두 레시틴, 버터, 식물성 경화류, 탈지우유, 설탕, 마가린, 식염, 전분, 밀가루, 물엿, 맥아당, 중조 및 당 에스테르 등의 통상적으로 사용되는 성분들을 이용하여 드링크제, 캬라멜, 쵸콜릿, 다이어트바 제형 또는 과자류인 건강식품으로 제형화 될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 흑마늘 생리활성 저분자량 농축분획액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 흑마늘 생리활성 농축분획액을 유효성분으로 전체 화장료 조성물 중 0.0001 내지 10중량%로 함유되는 것으로 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 마사지크림, 팩, 클렌징, 보디오일의 기초화장료 파운데이션, 마스카라, 아이라이너, 메이크업 베이스의 색조화장료 및 샴푸, 린스, 헤어콘디셔너 또는 헤어젤의 두발용 화장료로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 흑마늘 생리활성 저분자량 농축분획액은 한외여과를 이용하여 생리활성 효과를 가진 특정 분자량 크기별로 분획되어진 숙성 흑마늘 농축분획액을 얻게 됨으로써, 남아있는 마늘 고유의 냄새도 거의 없어지게 되며, 의약품제조용수를 흑마늘액 제조용수로 사용함으로써 물로부터 유래될 수 있는 금속미량원소나 엔도톡신 등의 품질저하 성분을 최소화시킴으로써 다른 흑마늘 제품과 차별화가 가능하다.

본 발명의 흑마늘 생리활성 농축액의 특정 분자량 크기 별로 분획함으로써 흑마늘이 갖고 있는 수용성 생리활성 유용인자들을 보다 효율적으로 농축하게 되고, 이들이 갖고 있는 항산화력, 암예방, 콜레스테롤 저하, 동맥경화개선, 심장질환 예 방 등의 고유한 효능을 그대로 유지하거나 강화할 수 있게 되므로 저분자량의 흑마늘액을 이용한 제품화에 유용하게 이용될 것이다.

본 발명은 숙성흑마늘이 갖고 있는 고유의 성분을 나노크기의 여과막을 이용하여 저분자량 크기별로 분획하여, 각각의 분획되어진 성분들로 조성화된 분획 흑마늘 농축액을 제조하게 됨으로써 보다 적은 양으로 유효한 효과를 나타낼 수 있으며, 특정 분자량 크기로 분획된 분획물들의 적절한 조화에 따라서 다양하게 응용 활용할 수 있고 특히, 저분자량화 하게 됨으로써 인체의 흡수를 보다 용이하게 할 수 있어서 이를 이용한 응용 분야의 확대가 기대된다.

또한, 본 발명은 제조된 분획 흑마늘 농축분획액의 품질을 균일하게 제조될 수 있어, 다시 건조시켜서 새로운 형태의 제품으로 제조하거나 식품 외의 다른 용도로 널리 활용가능하며 최종 농축제품이 제균여과막을 이용하여 제균함으로써 기존 제품에 비하여 장기간 보존 및 안정성을 증대하는 효과도 기대할 수 있어, 고부가가치의 차별적인 제품화가 가능할 것이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

[제조예 1] 흑마늘을 이용한 생리활성 수용액 제조

숙성하여 반건조된 흑마늘을 100 내지 150g/L(10 내지 15%)을 측량하여 음용수 품질에 적합한 용수에 넣어 교반기에 10분이상 분쇄하여 고농도로 액상화하였다. 고농도로 액상화된 흑마늘 농축액을 2500rpm에서 20분 원심분리하여 상층액만을 수득하여 흑마늘 농축상층액을 3 내지 5㎛ 크기의 전처리 여과지(pre-filter)와 무균작업대(클린벤치) 안에서 0.22㎛ 크기의 제균 여과지를 사용하여 연속적으로 비수용성 물질 제거와 함께 제균여과한 수용액을 제조하였다.

[제조예 2] 흑마늘을 이용한 생리활성 1분획액 제조

숙성하여 반건조된 흑마늘을 100 내지 150g/L(10 내지 15%)을 측량하여 음용수 품질에 적합한 용수에 넣어 교반기에 10분이상 분쇄하여 고농도로 액상화하였다. 고농도로 액상화된 흑마늘 농축액을 2500rpm에서 20분 원심분리하여 상층액만 을 수득하여 흑마늘 농축상층액을 3 내지 5㎛ 크기의 전처리 여과지(pre-filter)와 무균작업대(클린벤치) 안에서 0.22㎛ 크기의 제균 여과지를 사용하여 연속적으로 비수용성 물질 제거와 함께 제균 여과를 하였다. 이렇게 무균화된 고농도의 숙성 흑마늘 고농축상층무균용액을 1만 달톤(10k Dalton) 크기의 나노여과막을 이용하여 1만 달톤이 초과된 상층과 1만 달톤 미만의 여과액으로 분획하여, 1만 달톤 초과된 농축분획액을 제1분획 (10kS)으로하였다. 상기 분획된 1분획 생리활성 농축분획액을 0.22㎛ 여과지를 통하여 제균 여과하여 제조하였다.

[제조예 3] 흑마늘을 이용한 생리활성 2분획액 제조

상기 제조예 1에서 제조 여과된 1만 달톤 이하의 일차 분획된 농축분획액을 다시 3천 달톤(3k Dalton) 크기의 나노여과막을 이용하여 3천 달톤 이상의 상층액 (10kF3kS )과 3천 달톤 미만의 여과액으로 분획하여, 3천 달톤 내지 1만 달톤의 농축분획액을 제2분획(10kF3kS)으로 하였다. 상기 분획 제조된 2분획 농축분획액을 0.22㎛ 여과지를 통하여 제균 여과하여 제조하였다.

[제조예 4] 흑마늘을 이용한 생리활성 3분획액 제조

상기 제조예 2에서 제조 여과된 3천 달톤 미만의 여과액으로 분획하여, 3천 달톤 미만의 농축분획액을 제3분획 (3kF)으로 하였다. 상기 분획된 3분획 농축분획액을 0.22㎛ 여과지를 통하여 제균 여과하여 제조하였다.

[실험예]

(1) 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포 부유배양 방법

1. 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포 배양을 위해 5% 이산화탄소, 37℃, 95% 습도로 유지되는 이산화탄소 배양기와 현탁배양용 플라스크(Erlenmeyer flask)를 준비하고, 배양할 현탁배양기(orbital shaker)에 배양하였다.

2. 항온기(Water bath) 온도를 37℃로 맞춘다. 이때 수조 안의 증류수는 신선한 것을 사용하였다.

3. 냉장고로부터 화학적 조성이 밝혀진 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포 배양용 배지(Chemically defined media, CDM)인 HyQCDM4CHO (ThermoFisher사, 미국)를 꺼내서 37℃ 항온기에서 30분 동안 가온하여 사용하였다.

4. 세포수[생존세포수, 세포생존도 (%)] 측정은 트립판 블루염색법(trypan blue dye exclusion 방법)을 이용하여 측정하였다.

5. 계대 배양을 위해 필요한 세포배양액의 부피를 아래와 같이 계산하였다.

필요한 배양액(mL)=[접종농도(cells/mL) x 배양부피 (mL)]/배양시료의 생존세포수 (cells/mL)

6. 수조에서 가온한 배지 및 첨가물류를 70% 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 뿌려서 무균작업대 안으로 옮기고, 배지에 필요한 첨가물류(예, 글루타민, 글루코즈 등)를 적정 농도로 첨가하여 계대 배양에 필요한 새 배지를 미리 새로운 플라스크에 넣어둔 후 사용하였다.

7. 계대 배양을 하려는 플라스크를 무균작업대로 가져와, 필요한 세포배양액을 취해서 원심분리(1500rpm, 5분)한 후 상층을 버리고, 침전된 세포를 잘 현탁하여 새 배지가 담긴 플라스크에 접종하였다.

8. 접종한 플라스크 표면에 세포이름, 계대번호, 날짜, 작업자 이름 등을 기 록하고, 이산화탄소 현탁배양기의 속도를 110rpm에 맞추고 배양하였다.

(2) CHO세포수 및 생존도 측정방법

1. 이산화탄소 배양기로부터 배양 중인 플라스크를 꺼내어 무균작업대로 옮긴 후, 일회용 파이펫으로 균일한 배양액을 채취하고, 채취한 시료는 트립판 블루 염색법(trypan blue dye exclusion 방법)을 이용하여 현미경하에서 헤모싸이토미터를 이용하여 세포수[생존세포수, 사멸세포수, 총세포수, 세포생존도(%)]를 측정하였다.

세포생존도(%) = [생존세포수/총세포수] x 100

[비교예 1] 흑마늘을 이용한 수용액의 세포증식력 평가

제조예 1에서 제조된 수용액을 농도를 각각 0.25g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 2.0g/L의 농도로 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 부유배양에 첨가한 후 세포증식과 세포 생존도에 미치는 효과를 조사하였다. 대조구로는 흑마늘액을 사용하지 않은 HyQCDM4CHO 배지를 사용하였다. 세포는 현탁배양용 플라스크에 30ml 배지를 넣고, 110rpm에서 현탁하면서 7일간 배양하였다. 도 2의 A1에서와 같이 0.25g/L 및 0.5g/L에서 가장 높은 세포성장을 보였고, 이때의 세포농도는 약 5.08 내지 5.38 x 10⁶ cell/ml 이었으며, 대조구에 비하여 약 20% 정도 높았다. 1.0g/L 및 2.0g/L 로 농도를 높이면 점차 세포성장이 떨어지며, 2g/L에서는 오히려 대조구에 비해서 낮은 세포성장을 보였다. 세포 생존도에 있어서는 모두 대조구에 비해 높았으며, 첨 가된 흑마늘 수용액의 농도가 높을수록 세포생존도가 높았다.

[실험예 1] 흑마늘을 이용한 생리활성 1분획액의 세포증식력 평가

제조예 2에서 제조된 1분획액의 농도를 각각 0.25g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 2.0g/L의 농도로 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 부유배양에 첨가한 후 세포증식과 세포생존도에 미치는 효과를 조사하였다. 대조구로는 흑마늘액을 사용하지 않은 HyQCDM4CHO 배지를 사용하였다. 세포는 현탁배양용 플라스크에 30ml 배지를 넣고, 110rpm에서 현탁하면서 7일간 배양하였다. 도 3의 B1에서와 같이 0.25g/L에서 가장 높은 세포성장을 보였고, 이때의 세포농도는 약 6.04 x 10⁶ cell/ml 이었으며, 대조구에 비하여 약 25% 정도 높았다. 제 1분획액의 농도를 0.5g/L, 1.0g/L 및 2.0g/L로 농도를 높이면 점차 세포성장이 떨어졌으나, 모두 대조구에 비해서 높은 세포성장을 보였다. 세포 생존도에 있어서는 모두 대조구에 비해 높았으며, 첨가된 흑마늘 제 1 분획액의 농도가 낮을수록 세포생존도가 높았다.

[실험예 2] 흑마늘을 이용한 생리활성 2분획액의 세포증식력 평가

제조예 3에서 제조된 2분획액의 농도를 각각 0.25g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 2.0g/L 의 농도로 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 부유배양에 첨가한 후 세포증식과 세포 생존도에 미치는 효과를 조사하였다. 대조구로는 흑마늘액을 사용하지 않은 HyQCDM4CHO 배지를 사용하였다. 세포는 현탁배양용 플라스크에 30ml 배지를 넣고, 110rpm에서 현탁하면서 7일간 배양하였다. 도 4의 C1에서와 같이 1.0g/L에서 가장 높은 세포성장을 보였고, 이때의 세포농도는 약 6.37 x 10⁶ cell/ml 이었으며, 대조구에 비하여 약 30% 정도 높았다. 제 2분획액의 농도를 0.25g/L 와 0.5g/L의 농도에서도 비슷한 세포성장을 보였다. 세포 생존도에 있어서는 모두 대조구에 비해 높았으며, 첨가된 흑마늘 제 2 분획액의 농도가 낮을수록 세포생존도가 높았다.

[실험예 3] 흑마늘을 이용한 생리활성 3분획액의 세포증식력 평가

제조예 4에서 제조된 3분획액의 농도를 각각 0.25g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 2.0g/L의 농도로 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의부유배 양에 첨가한 후 세포증식과 세포생존도에 미치는 효과를 조사하였다. 대조구로는 흑마늘액을 사용하지 않은 HyQCDM4CHO 배지를 사용하였다. 세포는 현탁배양용 플라스크에 30ml 배지를 넣고, 110rpm에서 현탁하면서 7일간 배양하였다. 도 5의 D1에서와 같이 0.25g/L에서 가장 높은 세포성장을 보였고, 이때의 세포농도는 약 6.77 x 10⁶ cell/ml 이었으며, 대조구에 비하여 약 30% 정도 높았다. 제 3분획액의 농도를 0.25g/L 와 0.5g/L의 농도에서도 비슷한 세포성장을 보였다. 세포생존도에 있어서는 모두 대조구에 비해 높았으며, 첨가된 흑마늘 제 3분획액의 농도가 낮을수록 세포생존도가 높았다.

[실험예 4] 단계적 나노여과된 숙성 흑마늘분획의 세포증식 효과

제조예 1의 방법으로 제조된 흑마늘 수용액과 단계적 즉, 제조예 2, 제조예 3 및 제조예 4에서 제조된 나노여과된 생리활성 농축분획액의 각각 0.25g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 2.0g/L 의 농도로 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 부유배양에 첨가한 후 세포증식과 세포 생존도에 미치는 효과를 조사하였다. 도 6에서 확인 할수 있듯이, 3천 달톤 미만의 흑마늘 분획인 제 3분획액 0.25g/L 농도에서 가장 높 은 세포성장을 보였고, 모든 분획에서 흑마늘 수용액보다 높은 세포 성장을 보인 것은 나노여과된 농축 분획이 흑마늘 수용액보다 더 효과적임을 의미하는 것이며, 첨가하지 않은 대조구에 비하여 모두 세포증식 효과를 나타내었다. 이것은 모든 분획이 세포배양의 영양 보충물로서 가능함을 나타내는 것이다.

도 1은 숙성 흑마늘로부터 단계적 나노여과를 이용한 저분자량의 생리활성 물질 분획 공정을 도식화한 것이다.

도 2는 숙성 흑마늘의 수용화시킨 농축액의 세포증식력을 평가한 그래프이다.

도 3은 숙성 흑마늘의 1만 달톤 초과로 분획된 생리활성 농축분획액의 세포증식력 평가 그래프이다.

도 4는 숙성 흑마늘의 3천 달톤 내지 1만 달톤으로 분획된 생리활성 농축분획액의 세포증식력 평가 그래프이다.

도 5는 숙성 흑마늘의 3천 달톤 미만으로 분획된 생리활성 농축분획액의 세포증식력 평가 그래프이다.

도 6은 숙성 흑마늘의 나노여과된 농축분획액의 세포증식 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims (10)

1. a) 마늘피가 제거된 반 건조 저온 숙성의 점질성 흑마늘을 수용화하여 흑마늘 농축액을 제조하는 단계;

   b) 상기 제조된 흑마늘 농축액을 원심분리하여 흑마늘 농축상층액을 수득하는 단계;

   c) 상기 수득된 흑마늘 농축상층액을 제균여과하여 흑마늘 고농축 상층무균용액을 제조하는 단계;

   d) 상기 제조된 흑마늘 고농축 상층무균용액을 1만 달톤(10K Dalton)의 한외여과를 통해 1만 달톤 미만 및 1만 달톤 이하의 숙성 흑마늘 여과분획액을 수득하여 제균여과하는 단계; 및

   e) 상기 제균여과된 1만 달톤 이하의 흑마늘을 3천 달톤의 나노여과를 통해 3천 달톤 내지 1만 달톤 및 3천 달톤 미만의 여과분획액을 수득하여 제균여과하는 단계; 를 포함하는 저분자량의 흑마늘 생리활성 농축분획액 제조방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 c) 단계의 흑마늘 고농축 상층무균용액은 b) 단계의 흑마늘 농축상층액을 3 내지 5 ㎛ 크기의 전처리 여과지 및 0.22 ㎛ 크기의 제균 여과지를 사용하여 연속적으로 비수용성 물질을 제거하여 수득되는 것을 특징으로 하는 저분자량의 흑마늘 생리활성 농축분획액 제조방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 d) 단계 및 e) 단계의 제균여과는 0.22 ㎛ 크기의 제균 여과지를 사용하는 것을 특징으로 하는 저분자량의 흑마늘 생리활성 농축분획액 제조방법.
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