JP5311364B2 - 抗炎症用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ヤマブドウ果汁、ヤマブドウ果汁の発酵産物、ヤマブドウのヘキサン不溶物またはヤマブドウの高極性有機溶媒抽出物を含有する抗炎症用組成物およびその製造方法に関する。また、本発明はヤマブドウのヘキサン不溶物またはヤマブドウの高極性有機溶媒抽出物を含有する抗変異原用組成物およびその製造法に関する。

健康上の問題で最も多い症状は、男性で腰痛（４１０万人）、次いで肩こり（２９０万人）、女性で肩こり（６１５万人）、次いで腰痛（５４０万人）、関節痛（３６４万人）（厚生省「平成１６年国民生活基礎調査」による）など、いずれも炎症症状である。また慢性の炎症は発がんの原因のひとつである。
一方、食用果実の抗炎症作用の研究は少なく、ヤマブドウについての抗炎症作用については知られていない。
ヤマブドウは、ブドウ科ブドウ属に属するものであり、一般にジュース・ソースなどの加工食品や染料などとして使用されてきた。
本発明者は、ヤマブドウのワインビネガーを開発し、それが発癌抑制作用を有することを開示した（特許文献１）。
特開２００６−３２５４４９

本発明の課題は、ヤマブドウ果汁、その由来物の新規用途を提供することである。
また、当該用途に対して特に有効な成分を豊富に含む抽出物を製造する方法を提供することである。

本発明者は、上記課題に鑑み、ヤマブドウ（特に蒜山ヤマブドウ）の果汁、その発酵産物、ヤマブドウ果実のヘキサン不溶物及びヤマブドウ果実の極性の高い有機溶媒抽出物の生理活性に注目して研究を重ねてきたところ、これらが抗炎症作用を有することを見出した。また、ヤマブドウ果実のヘキサン不溶物および極性の高い有機溶媒抽出物が優れた抗変異原性を有することを見出した。
本発明はかかる新知見に基づいて本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は下記の通りである。
（１）ヤマブドウ果汁、ヤマブドウ果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヤマブドウ果実のヘキサン不溶物を含有する、抗炎症用組成物。
（２）炎症が皮膚炎である（１）に記載の組成物。
（３）高極性有機溶媒抽出物が、酢酸エチル抽出物である（１）または（２）記載の組成物。
（４）高極性有機溶媒抽出物が、ヘキサン不溶物であって、且つ酢酸エチル抽出物である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）医薬品である（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）食品である（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（７）食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、（６）記載の組成物。
（８）保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、（７）記載の組成物。
（９）化粧品である（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（１０）ヤマブドウ果汁を酢酸エチルで抽出する工程を含む抗炎症用組成物の製造方法。
（１１）ヤマブドウ果汁からヘキサン抽出画分を除去する工程、および酢酸エチルで抽出する工程を含む抗炎症用組成物の製造方法。
（１２）ヤマブドウ果汁、ヤマブドウ果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヤマブドウ果実のヘキサン不溶物を含有し、抗炎症作用を有するものであることを特徴とし、抗炎症のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１３）ヤマブドウ果汁、ヤマブドウ果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヤマブドウ果実のヘキサン不溶物を含有し、抗炎症作用を有するものであることを特徴とし、抗炎症のために用いられる旨の表示を付した化粧品。
（１４）ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヘキサン不溶物を含有する、抗変異原用組成物。
（１５）高極性有機溶媒抽出物が、酢酸エチル抽出物である（１４）記載の組成物。
（１６）高極性有機溶媒抽出物が、ヘキサン不溶物であって、且つ酢酸エチル抽出物である（１４）または（１５）記載の組成物。
（１７）医薬品である（１４）〜（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１８）食品である（１４）〜（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１９）食品が保健機能食品又はダイエタリーサプリメントである、（１８）記載の組成物。
（２０）保健機能食品が特定保健用食品又は栄養機能食品である、（１９）記載の組成物。
（２１）化粧品である（１４）〜（１６）のいずれかに記載の組成物。
（２２）ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヘキサン不溶物を含有し、抗変異原性を有するものであることを特徴とし、抗変異原のために用いられる旨の表示を付した食品。
（２３）ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヘキサン不溶物を含有し、抗変異原性を有するものであることを特徴とし、抗変異原のために用いられる旨の表示を付した化粧品。
（２４）ヤマブドウ果汁を酢酸エチルで抽出する工程を含む抗変異原用組成物の製造方法。
（２５）ヤマブドウ果汁からヘキサン抽出画分を除去する工程、および酢酸エチルで抽出する工程を含む抗変異原用組成物の製造方法。

本発明の、ヤマブドウ由来成分を含む抗炎症用組成物および抗変異原用組成物は、それぞれ優れた作用を有する。さらに、本発明の組成物は、ヤマブドウ果実という天然物由来であるため副作用も殆どなく、安全に使用することができる。また、ヤマブドウ果実からの抽出物の製造方法も煩雑な工程を経る必要がなく、工業的にも有意である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の抗炎症組成物は、ヤマブドウ果汁、該果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヘキサン不溶物を有効成分とするが、これらの有効成分を２種以上含有していてもよい。

まず、本発明は抗炎症用組成物であり、ここに抗炎症とは、炎症の予防及び治療ないしは症状改善を意味する。
炎症とは、感染、物理的刺激、化学的刺激、アレルギー反応等の侵襲に対し、免疫系が応答する種々の反応の総称である。
一般に炎症は外来刺激などの外因性要因と生体側の異常、体質的要素などの内因性要因との相互作用によって発症する。また炎症を起こしている部位によって、例えば腰や肩の筋肉等または関節に炎症を起こしている場合には腰痛や肩こりまたは関節炎といった症状（疾患）となって顕れ、皮膚や粘膜に炎症を起こしている場合には皮膚炎や口内炎などの疾患として顕れる。

本発明の組成物は抗炎症作用を有するので、具体的には皮膚炎、腰痛、肩こり、掻痒などに用いられ、好ましくは皮膚炎などの予防、治療、症状の改善に用いられる。皮膚炎の発症原因は、外来刺激としては、種々の化学物質、香粧品、金属、洗剤、薬物をはじめ植物、微生物、昆虫などの生物学的因子、日光、温熱、寒冷、乾燥などの物理学的因子などが挙げられる。生体側の因子としては、発汗、皮脂の分泌異常、角化異常など局所的異常の他に、アトピー性素因、感染病巣、消化管障害、腎障害、内分泌障害などの全身的異常も関連する。皮膚炎は発生機序としては、アレルギー性接触皮膚炎などのアレルギーと一時刺激性接触皮膚炎などの非アレルギーに大別される。本発明の組成物はいずれにも適用できるが、非アレルギー性の皮膚炎に好ましく用いられる。
炎症の症状としては、通常、発赤、熱感、発痛、腫脹、機能障害（例：掻痒、疼痛）が挙げられる。
本発明の組成物はこれらの疾病・症状の予防、治療、症状の改善に用いることができる。

本発明において、ヤマブドウとしてはブドウ科（ブドウ科Vitaceae, ブドウ属Vitis, 種名 coignetiae）に属するものが用いられ、具体的には蒜山ヤマブドウ（学名：Vitis coignetiae）が好適なものとして挙げられる。

本発明において、ヤマブドウ果汁としては、好ましくはヤマブドウ果実の果肉および果皮から得られるものが使用される。該果汁は、通常圧搾などの手段によって得ることができるがこれに限らない。また冷凍したヤマブドウから得られる果汁を使用してもよい。

本発明において、ヤマブドウ果汁の発酵産物としては、ヤマブドウワイン、ヤマブドウワインビネガーが挙げられ、好ましくはヤマブドウワインビネガーが挙げられる。

本発明において、例えばヤマブドウワインは下記製造法にて説明するアルコール濃度のものが好ましく、ヤマブドウワインビネガーは、例えば下記の酢酸濃度のものが好ましい。
基本的には、本発明の発酵産物は常法に基づいて製造することができる。好ましくは、ヤマブドウの果実を通常１０℃〜８０℃、好ましくは２０℃〜６０℃程度、より好ましくは３０℃〜５０℃程度に加熱してから果汁を搾汁し、これに、例えばアルコール発酵酵母や酵素等を加えて醸造し、アルコール濃度が通常３〜３０％、好ましくは５〜２０％、より好ましくは約１０％とすることによって、ヤマブドウワインが得られる。ヤマブドウワインに、例えば酢酸発酵酵母を加え、酢酸濃度が通常３〜１０％、好ましくは６％程度になるまで発酵させ、必要に応じて濾過を行いヤマブドウワインビネガーが製造される。

本発明におけるヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物とは、極性の高い有機溶媒によるヤマブドウ果実の抽出画分をいう。高極性有機溶媒抽出物における有機溶媒としては、その極性が４〜１０、好ましくは４〜６、より好ましくは４〜５．５のものが挙げられる。具体的には酢酸エチル、メタノールなどが挙げられる。

特に、好適な高極性有機溶媒抽出物としては、ヘキサン不溶物であって、且つ酢酸エチル抽出物が挙げられる。すなわち、ヤマブドウ果実を後述のヘキサン処理に付してヘキサン抽出画分を除去した後の酢酸エチル抽出物等が挙げられるが、抽出する順序はこれに限られない。具体的には、当該抽出物は、ヤマブドウ果実をそのまま、あるいは圧搾したものをヘキサン処理して、ヘキサン層と水層に分離させ、水層を酢酸エチル処理して得られた酢酸エチル抽出画分が挙げられる。当該酢酸エチル抽出画分を乾燥、例えば減圧乾燥するなど自体公知の方法により、水分及び揮発性成分を除いて、粉末状にしたものも高極性有機溶媒抽出物として使用することができる。

本発明におけるヘキサン不溶物は、ヘキサン処理によるヘキサン不溶性画分をいう。ヘキサン処理においては、ヤマブドウ果汁１００重量部に対して、通常ヘキサン２００〜４００重量部、好ましくは３００〜４００重量部で抽出する。抽出する回数は特に限定されないが、当該量のヘキサンによって、３〜４回抽出することが好ましい。また抽出温度は４℃〜３０℃が挙げられ、４℃〜２０℃が好ましい。該ヘキサン処理により得られたヘキサン不溶性画分、すなわち水層からヘキサン不溶物が得られる。

また、上記ヘキサン処理におけるヘキサン不溶性画分を高極性有機溶媒、例えば酢酸エチルで処理する。酢酸エチルなどの高極性有機溶媒処理においては、水層１００重量部に対して酢酸エチル２００〜４００重量部、好ましくは３００〜４００重量部で抽出する。抽出する回数は特に限定されないが、当該量の酢酸エチルによって、３〜４回抽出することが好ましい。また抽出温度は、通常４℃〜３０℃であり、４℃〜２０℃が好ましい。

さらに本発明の抗変異原用組成物は、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒による抽出物またはヘキサン不溶物を有効成分として含有する。該抗変異原用組成物としては、ヤマブドウ果実をヘキサン処理してヘキサン層を除いたもの（すなわち、ヘキサン不溶性画分）で、且つ酢酸エチルで抽出した抽出物がより好ましい。

変異原性とは、細胞に突然変異を起こさせる性質をいい、かかる突然変異を起こさせる物質のことを変異原性物質（変異原）という。変異原性物質は細胞に入りＤＮＡと結合したり、ＤＮＡを切断したりしてＤＮＡの塩基配列を変化させたりするものであり、ガンの発生の原因ともなりうる。

ところで、現在の生活環境では変異原性物質は避けることは困難であり、常にガン発生原因の中で暮らしていかねばならない。しかし変異原性物質がヒトの体に入っても変異原性を抑制あるいは阻止できればガン発生の危険性も低いものとなる。
本発明の抗変異原用組成物は、変異原性物質に対して、その変異原性を抑制または阻止するものである。

本発明における抗炎症用組成物および抗変異原用組成物の投与対象としては、例えば、ヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、マウス、ラット等の哺乳動物などが挙げられる。

本発明における抗炎症用組成物、抗変異原用組成物は、ヤマブドウ果実由来の成分を、そのままで、もしくは乾燥させた粉末状で含有する。その投与方法は、例えば、経口投与、外用投与、経直腸投与（坐薬）、点眼等の非経口投与でも良く、経口投与、外用投与であることが好ましい。

本発明の組成物を経口投与する場合の有効成分であるヤマブドウ果汁由来成分の投与量は、抗炎症用、抗変異原用のいずれもほぼ同量でよく、投与する患者の性別、症状、年齢、投与方法によって異なるが、通常、成人（体重６０ｋｇ）１日あたりの投与量が全量で、乾燥重量として１ｇ〜２５０ｇであり、好ましくは１ｇ〜１００ｇである。上記１日あたりの量を一度にもしくは数回に分けて投与することができる。食前、食後、食間を問わない。また投与期間は特に限定されない。

なお該果汁の発酵産物の場合は通常、成人（体重６０ｋｇ）１日あたりの投与量が全量で、乾燥重量として１００ｍｇ〜１０００ｍｇである。
ヤマブドウ果実の有機溶媒抽出物（乾燥重量として）の場合、上記ヤマブドウ果汁の投与量の１／１００〜１／１０、好ましくは１／３０〜１／１５程度を投与することができる。
ヘキサン不溶物（乾燥重量として）の場合、上記ヤマブドウ果汁の投与量の１／２〜１／５程度を投与することができる。
さらに炎症の予防のために投与する場合は、乾燥重量として、上記ヤマブドウ果汁の量の１／２〜１／５程度を長期間投与することも可能である。

本発明の組成物の経口投与用の形態としては、顆粒剤、細粒剤、錠剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤など、また注射用の形態としては静脈直接注入用、点滴投与用などの自体既知のものを採用することができる。これらは、常法により製剤化することができ、製剤上の必要に応じて、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、でんぷん、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン等の担体や、溶剤、溶解補助剤、等張化剤等の通常の添加剤を適宜配合することができる。

本発明の各々の組成物を外用として投与する場合、投与する対象の症状、目的、年齢、投与方法等によって異なるが、投与量は成人１日当たり、有効成分であるヤマブドウ果汁（乾燥重量として）を通常１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度、好ましく１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度である。適用する回数は特に制限されないが、通常１日１〜５回、好ましくは３〜５回である。
なお該果汁の発酵産物（乾燥重量として）の場合は、通常上記ヤマブドウ果汁とほぼ同じである。
ヤマブドウ果実の有機溶媒抽出物（乾燥重量として）の場合、上記ヤマブドウ果汁の投与量の１／１００〜１／１０、好ましくは１／３０〜１／１５程度を投与することができる。
ヘキサン不溶物（乾燥重量として）の場合、上記ヤマブドウ果汁の投与量の１／２〜１／５程度を投与することができる。
さらに炎症の予防のために投与する場合は、乾燥重量として、上記ヤマブドウ果汁の量の１／２〜１／１０程度を長期間投与することも可能である。

上記外用は、必要に応じて公知の添加剤などを混合して常法により、クリーム剤、液剤、ローション剤、乳剤、チンキ剤、軟膏剤、水性ゲル剤、油性ゲル剤、エアゾール剤、パウダー剤、シャンプー、石鹸などの外用製剤等とすることができる。これらの剤型は、医薬あるいは化粧品または医薬部外品等とすることができる。

上記外用剤には、上記成分の他に水溶性成分、油性成分、粉末成分、界面活性剤、高分子成分、増粘剤、粘着性改良剤、被膜形成剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、賦形剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、潤沢剤、鎮痒剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、化粧品や医薬部外品等に必要な添加剤等を必要に応じて配合することができる。

本発明の組成物中のヤマブドウ果汁（乾燥重量として）の含有量は、通常１〜１００重量％であり、好ましくは１０〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜８０重量％、特に好ましくは２０〜５０重量％である。該果汁の発酵産物（乾燥重量として）の場合は、前記ヤマブドウ果汁と同じである。なおヤマブドウ果実の有機溶媒抽出物（乾燥重量として）の場合、通常１〜１００重量％であり、好ましくは１０〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜５０重量％である。また、ヘキサン不溶物（乾燥重量として）の場合、通常１〜１００重量％である。なお本発明の組成物においては、ヤマブドウ由来成分のみからなる組成物であってもかまわない。

本発明においては、ヤマブドウ果汁、該果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物またはヘキサン不溶物を含有し、炎症の予防・治療または改善作用を有するものであることを特徴とし、炎症の予防・治療または改善のために用いられる旨の表示を付した食品を提供する。
また、本発明においてはヤマブドウ果実のヘキサン不溶物または高極性有機溶媒抽出物を含有し、抗変異原性を有するものであることを特徴とし、抗変異原のために用いられる旨の表示を付した食品を提供する。

本発明における食品は、本発明のヤマブドウ果汁、該果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物、または該果汁のヘキサン不溶性画分を含む一般的な食品形態であれば如何なるものでも良い。例えば、それ自体、またはそれに適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー等に混ぜて飲食することができる。また、このような食品を保健機能食品として提供することも可能である。この保健機能食品には、炎症の予防および改善などの本発明の用途に用いるものであるという表示を付した飲食品、特に、特定保健用食品、栄養機能食品なども含まれる。

さらに、本発明における食品を濃厚流動食や、食品補助剤として利用することも可能である。食品補助剤として使用する場合、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。本発明における食品補助剤とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、サプリメントなどもこれに含まれる。

本発明におけるヤマブドウ果汁、該果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒抽出物、またはヘキサン不溶物を食品として摂取する場合、成人（体重６０ｋｇ）１日当たりのヤマブドウ果汁（乾燥重量として）の摂取量は、通常１ｇ〜２５０ｇ程度、好ましくは１ｇ〜１００ｇ程度である。該果汁の発酵産物（乾燥重量として）の場合は、通常１ｇ〜２５０ｇ程度、好ましくは１ｇ〜１００ｇ程度である。なおヤマブドウ果実の有機溶媒抽出物（乾燥重量として）の場合、上記ヤマブドウ果汁の摂取量の１／１０〜１／３０程度を摂取することができる。また、ヘキサン不溶画分抽出物（乾燥重量として）の場合、上記ヤマブドウ果汁の摂取量の１／１０〜１／３０程度を摂取することができる。
上記の量を１日１回から数回に分けて摂取することが好ましい。この場合、一日あたり摂取量、または1回あたりの摂取量を1単位包装とすることができる。

本発明における食品中のヤマブドウ果汁（乾燥重量として）の含有量は、通常１〜１００重量％であり、好ましくは１０〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜８０重量％である。該果汁の発酵産物（乾燥重量として）の場合は、前記ヤマブドウ果汁と同じである。なおヤマブドウ果実の有機溶媒抽出物（乾燥重量として）の場合、通常１〜１００重量％であり、好ましくは１０〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜５０重量％である。また、ヘキサン不溶物（乾燥重量として）の場合、通常１〜１００重量％である。なお本発明の食品においては、ヤマブドウ由来成分のみからなる食品であってもかまわない。

ヤマブドウ果汁、該果汁の発酵産物、ヤマブドウ果実の高極性有機溶媒、またはヘキサン不溶物を含有し、抗炎症作用を有するものであることを特徴とし、抗炎症のために用いられる旨の表示を付した化粧品を提供する。化粧品中の有効成分としてのヤマブドウの含量等は、上記外用剤でのべたものと同様である。
本発明における化粧品は、日焼けなどの炎症に対して用いることができる。
また、本発明においてはヤマブドウ果汁のヘキサン不溶物またはその高極性有機溶媒抽出物を含有し、抗変異原性を有するものであることを特徴とし、抗変異原性のために用いられる旨の表示を付した化粧品を提供する。

本発明においては、ヤマブドウ果汁を酢酸エチルで抽出する工程を含む抗炎症用組成物の製造方法を提供する。好ましくはさらにヘキサン抽出画分を除去する工程を含む。酢酸エチルで抽出することにより少量で有効性を発揮しうる成分をえることが出来るという効果が得られる。当該抽出・製造方法は組成物のところで説明した手法にて製造することができる。
より具体的には、ヤマブドウ果実をそのままで、または圧搾等により粉砕したものに、果実１００重量部あたりヘキサン１００〜５００重量部を加えて抽出し、ヘキサン層を除去し、水層をさらに酢酸エチルで抽出する工程を含む製造方法である。酢酸エチルの量は残渣１重量部に対して１〜１０重量部、好ましくは３〜５重量部を加えて抽出する。さらにこの操作を３〜５回繰り返すことが好ましい。さらに抽出温度は５〜３０℃、好ましくは５〜２０℃である。
なお酢酸エチルで抽出した後に、該抽出物をヘキサン抽出・ヘキサン層除去に供してもよい。

本発明において、ヤマブドウ果汁を含有する組成物は抗発癌用組成物としても利用できる。癌の種類は限定されないが、皮膚腫瘍等に好適である。

以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１
＜ヤマブドウ果汁の調製＞
ヤマブドウを樹から果実を収穫し、枝を取るために除梗破砕する。これを搾汁機（エアープレス）にて処理し、９５℃にてドラム缶に詰め、２〜３ヶ月間保存して、酒石酸結晶を析出させ、酒袋で絞ることによってヤマブドウ果汁を得る。

実施例２
＜発酵産物の調製＞
完熟した蒜山ヤマブドウの果実（果皮、果肉、種子）から搾汁した果汁６０Ｌを備前焼容器に仕込み、室温（約２０℃）でワイン酵母としてラルバン７１Ｂを７．２ｇ加えてアルコール発酵を行った。発酵液槽内部の温度は２５〜２８℃に調整した。アルコールが６％に達した段階で純粋培養した産幕酵母バストリアヌス１００ｃｍ^２を表面移植し、酵母菌膜の途中移植を行って、発酵を促進した。これらの操作によって、１週間のアルコール発酵とそれに続く２ヶ月の酢酸発酵で、総酸含量が約６％（酢酸含量は約５．１％）の発酵産物を得た。この発酵産物を凍結させ、減圧乾燥機で水分および酢酸などの揮発成分を取り除き、凍結乾燥物１１ｇを得た。

実施例３
＜ヤマブドウ抽出物の調製＞
ヤマブドウ抽出物は図１にしたがって得た。ヤマブドウ果実を搾汁機器にかけて絞り、圧搾搾汁１００ｍL（１００ｍＬを凍結乾燥させると乾燥重量１５．１ｇの固形物が残る）を分液ロートに入れ、ヘキサン３００ｍLを加えて振とう撹拌後、ヘキサン層と水層とに分離させた。これを２回繰り返し、ヘキサン層を除いた。残った水層に酢酸エチル３００ｍLを加えて振とう撹拌を３回繰り返し、酢酸エチル層と水層とに分離させ、酢酸エチル層を別容器に分けた。この酢酸エチル画分から、減圧乾燥機を用いて水分及び揮発成分を除き、粉末状の乾燥物０．８ｇを得た。

実験例１
＜外用によるヤマブドウ果汁の抗炎症効果の評価＞
マウス（ＩＣＲマウス、メス６週齢、又はＳＥＮＣＡＲマウス、オス６週齢）８匹の片耳の前面及び後面ともに、炎症性物質１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）（以下ＴＰＡと省略）のアセトン溶液（８５μＭ）を耳の片面に１０μＬ、もう片面に１０μＬを滴下塗布した。塗布の６時間後に耳重量を測定した。ここで耳重量とは、直径６mmのパンチで耳に穴を開け、その時取れる円形の部分の重量をいう（以下同様）。ＴＰＡを塗布したマウスの耳は、６時間後に炎症が起こり、耳が腫れた。その時の耳重量は１５．８±１ｍｇであった。コントロールとして、溶媒であるアセトンのみを塗布したところ、耳は腫れず、耳重量は６．５±０．３ｍｇであった。ＴＰＡを塗布することで耳重量は増加した。
実施例１で得られたヤマブドウ果汁の凍結乾燥粉末１．８ｇをアセトン水混液（６６％のアセトンと蒸留水の混合溶液；アセトン：蒸留水＝２：１（ｖ／ｖ））５ｍＬに溶解させた（０．３６ｇ／ｍＬ）。次にマウス（ＩＣＲマウス、メス６週齢、又はＳＥＮＣＡＲマウス、オス６週齢）６匹の片耳の前面及び後面ともに、上記を１０μＬを塗布し、その３０分後にＴＰＡ（８５μＭの溶液）を片耳の前面及び後面に１０μＬ塗布した。その結果、６時間後に、マウスの耳は腫れて耳重量（１２．９±１．９ｍｇ）となった。果汁を塗布しない場合と比べて、重量増加は有意に少なかった。
以上より、ヤマブドウ果汁の凍結乾燥粉末が、炎症反応を抑制すること、即ち抗炎症効果を有することが示された。

実験例２
＜外用によるヤマブドウ発酵産物の抗炎症効果の評価＞
実験例１において、ヤマブドウ果汁の凍結乾燥粉末を用いる代わりに実施例２で得たヤマブドウ発酵産物の凍結乾燥粉末を用いる他は、実験例１と同じ条件で抗炎症効果の評価を行った。その結果、ＴＰＡ塗布６時間後に、アセトンのみを塗布したマウスの耳は腫れて、耳重量は１５．８±１ｍｇであった、一方該発酵産物を塗布した場合の耳重量は１３．１±２．３ｍｇであり、アセトンのみを塗布した場合に比べての重量増加は有意に少なかった。
以上より、ヤマブドウ発酵産物の凍結乾燥粉末が、抗炎症効果を有することが示された。

実験例３
＜外用によるヤマブドウ抽出物の抗炎症効果の評価＞
実施例３で得られたヤマブドウ抽出物（以下酢酸エチル抽出物ともいう）０．８ｇをアセトン水混液５ｍＬまたは１０ｍＬに溶解した（（Ｈ）；０．１６ｇ／ｍＬ、（Ｌ）；０．０８ｇ／ｍＬ）。
調製したヤマブドウ抽出物のアセトン水混液をマウス６匹の片耳の前面及び後面にそれぞれ１０μＬ塗布した後、３０分後にＴＰＡを塗布した。塗布６時間後に耳重量を測定した。
さらにヘキサンで抽出したヘキサン層の成分を同様に減圧乾燥させて得られた粉末を０．０６ｇ／ｍＬになるようにアセトン水混液に溶解し（以下ヘキサン抽出物ともいう）、上記と同様の条件で実験した。
また比較としてＴＰＡの代わりにアセトンを塗布して実験を行った。表１に耳重量を示した。

結果は図２に示した。ＴＰＡを塗布したマウスの耳は腫れて耳重量は増加した。一方酢酸エチル抽出物を塗布した場合には用量依存的に耳重量の増加を有意に抑制した。ヘキサン抽出物は有意な効果を示さなかった。
以上より、ヤマブドウの酢酸エチル抽出物が、抗炎症効果を有することが示された。

実験例４
＜飲用によるヤマブドウ抽出物の抗炎症効果の評価＞
マウス（ＳＥＮＣＡＲマウス、オス６週齢）６匹に、水を飲み水として与え、１２時間飼育後、片耳の前面及び後面ともにＴＰＡを塗布したところ、６時間後に炎症が起こり、耳が腫れ、耳重量が１７．５ｍｇとなった。一方、マウス（同上）６匹に、実施例２で得られたヤマブドウ果汁の酢酸エチル画分の乾燥物を水に溶解し（０．１６ｇ／ｍＬ（Ｈ）または０．０８ｇ／ｍＬ（Ｌ））飲み水として与え、１２時間飼育後、同様に片耳の前面及び後面ともにＴＰＡを塗布したところ、６時間後に、炎症が起こり、耳が腫れ、耳重量は１０．０ｍｇ（Ｈ）または１２．８ｍｇ（Ｌ）となった。飲み水として、水のみを与えた場合と比べて、耳重量の増加は有意に少なかった。
以上より、ヤマブドウ抽出物が、飲用によっても抗炎症作用を示すことが明らかとなった。

実験例５
＜ヤマブドウの変異原性試験に対する評価＞
Trp-P-2 (3-Amino-1-methyl-5H-pyrido [4,3-b]indole）に対するヤマブドウの凍結乾燥物の抗変異原性をサルモネラ菌を用いるエイムス試験で調べた。
実験条件：
・Trp-P-2 0.1 ｎｍｏｌの５０μL水溶液
・ヤマブドウ凍結乾燥物(i)〜(iｖ)の蒸留水溶液と滅菌水の合計を１００μLとする溶液
・サルモネラ菌液 １００μL
・Ｓ9入り緩衝液 ５００μL
を混ぜて、３７℃で２０分振とうした。
なおヤマブドウ果実凍結乾燥物は、以下の群に分けた。
（ｉ）Ｙ−ｇｒａｐｅ ｊｕｉｃｅ群：実施例１で得られたヤマブドウ果汁（０．０５ｍＬ）の凍結乾燥物の蒸留水溶液（果汁０．０５ｍＬから得られた成分を蒸留水溶液１００μＬに溶かした試料。実際は果汁１００ｍＬから得られたサンプルの０．０５／１００である。）
（ｉｉ）Ｈｅｘａｎｅ Ｆｒａ．群：実施例１で得られたヤマブドウ果汁０．０３、０．１ｍＬのヘキサン抽出物の蒸留水溶液（果汁１００ｍＬをヘキサン抽出し、ヘキサン留去後の残分の０．０３／１００あるいは０．１／１００を滅菌水０．１ｍＬに溶かしたもの）
（ｉｉｉ）ＥｔＯＡｃ Ｆｒａ．群：実施例１で得られたヤマブドウ果汁０．０２、０．０５、０．１ｍＬをヘキサン抽出・酢酸エチル抽出物の蒸留水溶液（果汁１００ｍＬをヘキサン抽出したあとの果汁層を酢酸エチル抽出し、酢酸エチル留去後の残分の、０．０２／１００、０．０５／１００あるいは０．１／１００を滅菌水０．１ｍＬに溶かしたもの）
（ｉｖ）ｒｅｓｉｄｕｅ群（水層残存群）：実施例１で得られたヤマブドウ果汁０．０３、０．１ｍＬのヘキサン抽出・酢酸エチル抽出後抽出されなかった果汁層（凍結乾燥）の蒸留水溶液（果汁１００ｍＬをヘキサン抽出したあとの果汁層を酢酸エチル抽出し、酢酸エチルで抽出されなかった果汁層を凍結乾燥した時の固形物の、０．０２／１００、０．０５／１００あるいは０．１／１００を滅菌水０．１ｍＬに溶かしたもの）
これを寒天培地にまいて、３７℃で４８時間置いた後突然変異を起こしたサルモネラ菌数を数えた。

結果は図３に示した。ヤマブドウ果汁凍結乾燥物及び酢酸エチル抽出物には抗変異原性があることが判った。しかしながらヤマブドウ果汁をヘキサン処理したヘキサン層には抗変異原性は認められなかった。また、水層残存群の抗変異原性はEtOAc群より弱かった。

実験例６
＜外用によるヤマブドウ果汁の皮膚腫瘍に対する評価＞
センカー（Ｓｅｎｃａｒ）マウス（メス６週）の背部の毛を剃り、背部皮膚に発癌物質ＤＭＢＡ（ジメチルベンゾ（ａ）アンスラセン）（３９０ｎｍｏｌ／アセトン０．１ｍＬ）を１回塗布し、その１週間後より発癌促進物質ＴＰＡ（１．７ｎｍｏｌ／アセトン０．１ｍＬ）を週２回塗布した（ＴＰＡ群、ｎ＝８）（図４参照）。
次にＤＭＢＡを１回塗布し、その１週間後よりＴＰＡ塗布の３０分前に、実施例１で得られたヤマブドウ果汁（１Ｌ）の凍結乾燥物１８．２ｇをアセトン水混液５００ｍＬまたは１００ｍＬに溶かした溶液０．１５ｍＬを塗布した（上記の乾燥物を５００ｍＬに溶かしたものを２Ｘ投与群（ｎ＝８）；１００ｍＬに溶かしたものを１０Ｘ投与群（ｎ＝８）という）。なお実験中、餌及び水は自由に与えた。

結果は図５および図６に示した。２０週終了までに、ＴＰＡ群は全てに皮膚の良性腫瘍ができた。一方、ヤマブドウ果汁２Ｘ投与群は５匹、１０Ｘ投与群は４匹に腫瘍ができた。

図１は、ヤマブドウ果汁の抽出工程を示す。 図２は、外用によるヤマブドウ抽出物の抗炎症効果を示す。PCは陽性対照、NCは陰性対照を表わす。 図３は、ヤマブドウの抗変異原性を示す。 図４は、発癌動物試験の方法を示す。 図５は、外用によるヤマブドウ果汁の皮膚腫瘍に対する効果を示す。 図６は、外用によるヤマブドウ果汁の皮膚腫瘍に対する効果を示す。

Claims (4)

1. 有効成分として、ヤマブドウ果実のヘキサン不溶物であって且つ酢酸エチル抽出物を含有する抗炎症用組成物。
2. 炎症が皮膚炎である請求項１に記載の組成物。
3. 抗炎症用医薬品である請求項１または２に記載の組成物。
4. ヤマブドウ果汁からヘキサン抽出画分を除去する工程、および酢酸エチルで抽出する工程を含む抗炎症用組成物の製造方法。

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