KR20120031695A - 감 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감(Diospyros kaki Thunb.) 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 감 추출물 또는 감 시체 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), NO 저해활성 및 iNOS의 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.

Description

감 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the extract of Diospyros kaki Thunb as an active ingredient for preventing and treating inflammatory disease}
본 발명은 감(Diospyros kaki Thunb) 또는 감 시체(枾滯) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.
[문헌 1] Achiwa, Y., H. Hibasami, H. Katsuzaki, K. Imai, and T. Komiya. 1997. Inhibitory effects of persimmon (Diospyros kaki) extract and related polyphenol compounds on growth of human lymphoid leukemia cells. Biosci. Biotech. Biochem. 61. 1099-1109.
[문헌 2] Ann, Y. G., J. Y. Pyun, S. K. Kim, and C. S. Shim. 1999. Studies on persimmon wine. Korean J. Food Nutr. 12. 455-461.
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[문헌 6] Chun, Y. K., H. S. Choi, and B. S. Cha. 1997. Effect of enzymatic hydrolysis on the physicochemical properties of persimmon juice. Korean J. Food Sci. Technol. 29. 198-203.
[문헌 7] Gorinstein, S., E. Bartnikowsaka, G. Kulasek, M. Zemser, and S. Trakhtenberg. 1998. Dietary persimmon improves lipid metabolism in rats fed diets containing cholesterol. J. Nutr. 128, 2023-2027.
[문헌 8] Gracie, J. A., R. J. Forsey, W. L. Chan, A. Gilmour, B. P. Leung, M. R. Greer, K. Kennedy, R. Carter, X. Q. Wei, D. Xu, M. Field, A. Foulis, F. Y. Liew, and I. B. Mclnnes. 1999. A proinflammatory role for IL-18 in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 13, 85-94.
[문헌 9] Guha, M. and N. Mackman. 2001. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13, 85-94.
[문헌 10] Harada, M., R. Sakagami, T. Watanabe, T. Onitsuka, H. Katoh, and A. Nagai. 2005. Antibacterial and deodorizing effect of persimmon tannin. Japanese J. Conserv. Dent. 48. 314-319.
[문헌 11] Heo, J. C., J. H. Chae, S. H. Lee, Y. R. Lee, K. D. Moon, S. K. Chung, and S. H. Lee. 2008. Comparison of radical scavenging and immunonodulatory activities exhibited by and aqueous extract of Diospyros kaki thunb. fruit (Persimmon). Korean Soc. Food Preservation. 15. 749-753.
[문헌 12] Higuchi, M., N. Hisgahi, H. Taki, and T. Osawa. 1990. Cytolytic machanism of activated macrophages. Tumor necrosis factor and L-arginine-dependent mechanism act synergistically as the major cytolytic mechanism of activated macrophages. J Immunol. 144, 1425-1431.
[문헌 13] Himbo, G. T. Nadamoto, F. Fujisawa, and T. Fushiki. 2003. Regulation of the peripheral body temperature by foods: a temperature decrease induced by the Japanese persimmon(kaki, Diospyros kaki). Biosci. Biotech. Biochem. 67. 23-28.
[문헌 14] Hyun, Y. H., B. S. Koo, J. E. Song, and D. S. Kim. 2004. Food materials. Hyungseul Publish, Daegu, 152-153.
[문헌 15] Jeong, Y. J., G. D. Lee, and K. S. Kim. 1998. Optimization for the fermentation condition of persimmon vinegar using response sulface methodology. Korean J. Food Sci. Technol. 30. 1203-1208.
[문헌 16] Kim, J. G., H. S. Choi, W. J. Kim, and H. I. Oh. 1999. Physical and sensory characteristics of persimmon jam prepared with enzyme treated persimmon juice. Korean J. Soc. Food Sci. 15. 50-54.
[문헌 17] Kim, S. G., Y. C. Lee, K. G. Suh, and H. S. Choi. 2001. Acetaldehyde dehydrogenase activator from persimmon and its processed foods. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 30. 954-958.
[문헌 18] Lee, Y. C., Y. S. Sa, C. S. Jeong, K. G. Suh, and H. S. Choi. 2001. Anticoagulating activity of persimmon and its processes foods.
[문헌 19] Marithasan, S. and D. M. Monack. 2007. Inflammasome adaptors and sensor: intracelluar regulators of infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 7, 31-40.
[문헌 20] Marklund, S. and G. Marklund. 1974. Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay
[문헌 21] Shinmoto, H., T. Kimura, K. Yamagishi, and M. Suzuki. 2002. Antimutagenicity of fruit extract on Trp-P2 induced mutagenicity of Salmonella typhimurium TA98. J. Japanese Soc. Food Sci. Technol. 49, 203-206.
[문헌 22] Sung, J. J., Y. K. Roh, S. H. Park, H. S. Byun, Y. J. Ham, and J. U. Choi. 1999. Changes in quality of soft persimmon during freezing and defrosting. Korean J. Postharvest Sci. Technol. 6. 398-401.
[문헌 23] Yang, H. S., and Y. C. Lee. 2000. changes in Physico-chemical properties of soft persimmon and puree during frozen storage. Korean J. Food Sci. Technol. 32. 335-340.
염증반응은 감염 또는 조직손상 후에 손상을 이환부위에 제한시킴으로서 다양한 세포와 사이토카인들이 관여하여 초기 방어를 제공하는 일련의 과정이다(Marithasan, S. et al. 2007. Inflammasome adaptors and sensor: intracelluar regulators of infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 7, 31-40.). 대식세포(macrophage)는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 nitric oxide(NO)와 사이토카인을 생산하여 감염초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다(Higuchi, M., N. Hisgahi, H. Taki, and T. Osawa. 1990. Cytolytic machanism of activated macrophages. Tumor necrosis factor and L-arginine-dependent mechanism act synergistically as the major cytolytic mechanism of activated macrophages. J Immunol. 144, 1425-1431.). 이 과정에서 대식세포와 같은 염증세포들이 활성화되면서 nitric oxide(NO)와 postaglandin(PG), interlukin-1beta(IL-1β), tumer necrosis factor-alpha(TNF-α)등 다량의 염증 매개 인자를 분비하게 된다(Guha, M. et al. 2001. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13, 85-94.). 이러한 염증 반응이 지속적으로 또는 과민하게 일어나면 과민성 알러지 질환이나 만성 염증 질환, 순환기 장애, 암 등과 같은 다양한 질환의 원인을 제공하게 된다(Gracie, J. A., et al. 1999. A proinflammatory role for IL-18 in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 13, 85-94.).
감(Persimmon)은 학명이 Diospyros kaki Thunb.으로 전세계에 걸쳐 널리 분포되어 있는 감나무속 식물로 약 1,000여종이 있는데, 대부분 열대나 아열대 지방에 분포되어 있다. 온대에 분포되어 있는 것은 식용으로 많이 이용되어 한국, 중국, 일본을 원산지로 하고 있다(Cha, H. S. 1999. Studies on the Utilization of astringent persimmon. Report of Korea Food Research Institute, pp 1-76.). 감은 폴리페놀성 물질과 비타민 A와 C성분이 풍부하고 숙취해소와 기침치료 등에 효과가 있으며 특히, 건시는 해소, 토혈, 객혈, 이질등에 좋다고 민간과 한방에서 알려져 있다(Hyun, Y. H., et al. 2004. Food materials. Hyungseul Publish, Daegu, 152-153.). 또한 감 과실은 항산화, 알콜대사촉진, 항미생물, 항돌연변이, 지질대사 개선, 림프백혈병세포 성장억제, 체온저하 등의 효과(Lee, Y. C., et al. 2001. Anticoagulating activity of persimmon and its processes foods. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 30. 949-953.; Kim, S. G., et al. 2001. Acetaldehyde dehydrogenase activator from persimmon and its processed foods. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 30. 954-958.; Harada, M., et al. 2005. Antibacterial and deodorizing effect of persimmon tannin. Japanese J. Conserv. Dent. 48. 314-319.; Shinmoto, H., et al. 2002. Antimutagenicity of fruit extract on Trp-P2 induced mutagenicity of Salmonella typhimurium TA98. J. Japanese Soc. Food Sci. Technol. 49, 203-206.; Gorinstein, S., et al. 1998. Dietary persimmon improves lipid metabolism in rats fed diets containing cholesterol. J. Nutr. 128, 2023-2027.; chiwa, Y., et al. 1997. Inhibitory effects of persimmon (Diospyros kaki) extract and related polyphenol compounds on growth of human lymphoid leukemia cells. Biosci. Biotech. Biochem. 61. 1099-1109.; Himbo, G. T. et al. 2003. Regulation of the peripheral body temperature by foods: a temperature decrease induced by the Japanese persimmon(kaki, Diospyros kaki). Biosci. Biotech. Biochem. 67. 23-28.)를 가지는 것으로 과학적으로 구명되어 건강식품으로 와인, 퓨레, 동결연시, 식초, 주스, 잼, 조청 등으로 개발되어 있다(Ann, Y. G., et al. 1999. Studies on persimmon wine. Korean J. Food Nutr. 12. 455-461.; Sung, J. J., et al. 1999. Changes in quality of soft persimmon during freezing and defrosting. Korean J. Postharvest Sci. Technol. 6. 398-401.; Yang, H. S., et al. 2000. changes in Physico-chemical properties of soft persimmon and puree during frozen storage. Korean J. Food Sci. Technol. 32. 335-340.; Jeong, Y. J., et al. 1998. Optimization for the fermentation condition of persimmon vinegar using response sulface methodology. Korean J. Food Sci. Technol. 30. 1203-1208.; Chun, Y. K., et al. 1997. Effect of enzymatic hydrolysis on the physicochemical properties of persimmon juice. Korean J. Food Sci. Technol. 29. 198-203.; Kim, J. G., et al. 1999. Physical and sensory characteristics of persimmon jam prepared with enzyme treated persimmon juice. Korean J. Soc. Food Sci. 15. 50-54.; Bae, S. M., et al. 2001. Preparation and characterization of jochung with sweet persimmons. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 44. 88-91.).
경상북도 청도군에서 주로 재배되고 있는 청도반시는 총 재배면적 1,729ha이고 총생산량은 24,874톤으로 전국에서 유일하게 감에 씨가 없으며 육질이 연한 것이 특징이다(Heo, J. C., et al. 2008. Comparison of radical scavenging and immunonodulatory activities exhibited by and aqueous extract of Diospyros kaki thunb. fruit (Persimmon). Korean Soc. Food Preservation. 15. 749-753.). 이러한 특성을 지닌 청도반시에 관한 몇몇 보고가 있었지만 그 수가 많지 않았고 작용기전에 관한 연구는 더욱 미흡한 실정이었으며, 특히 항염증 활성에 관한 연구는 거의 보고되지 않고 있다. 이에 본 발명자들은 청도반시의 꽃밭침부분인 시체(枾滯)와 감의 과육부분의 항염증 활성 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 감은 홍시, 연시, 경북 청도반시, 단감의 과육, 과피, 시체 등을 포함하고, 바람직하게는 경북 청도반시의 과육, 과피, 시체 등을 포함함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 바람직하게는 물 또는 50% 내지 90% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
상기 감 추출물 또는 감 시체 추출물의 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 사용이 가능하다.
본원에서 정의되는 염증성 질환은 염증성 피부염, 건선증, 상처, 아토피성 질환, 바람직하게는 건선증, 상처, 아토피성 질환, 염증성 피부염 보다 바람직하게는 건선증 또는 염증성 피부염을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 감 추출물 또는 감 시체 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.
본 발명의 시체를 제거한 감 또는 감 시체를 세척 후, 음건하여 추출 1시간 내지 30시간, 바람직하게는 5시간 내지 25시간 전에 건조된 감 또는 감 시체 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁내지 C₄의 저급알코올의 극성 용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 50% 내지 90% 에탄올로, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 약 20℃ 내지 50℃에서 1일 내지 30일간, 바람직하게는 5일 내지 15일간, 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 추출하여 얻어진 여액을 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
감 추출물 또는 감 시체 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 감 추출물 또는 감 시체 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.
본 발명의 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 감 추출물 또는 감 시체 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), NO 저해활성 및 iNOS의 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.
도 1은 감 추출물 또는 감 시체 추출물의 전자공여능 측정을 나타낸 도이고,
도 2는 감 추출물 또는 감 시체 추출물의 SOD 유사활성을 측정한 도이고,
도 3은 감 추출물 또는 감 시체 추출물의 human keratinocyte cell(HaCaT)의 세포 독성을 나타낸 도이며,
도 4는 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 농도별로 처리하여 human keratinocyte cell(HaCaT)의 NO 생성억제 정도를 측정한 도이고,
도 5는 감 human keratinocyte cell(HaCaT)에서 감 추출물 또는 감 시체 추출물의 iNOS 단백질 발현 비율을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 시료 재료
본 실험에 사용한 감(Persimmon)은 학명이 Diospyros kaki Thunb.로 경북 청도군에서 재배된 청도반시를 구입하여 실험재료로 사용하였다.
실시예 1. 시료 추출
시료의 추출은 시체를 제거한 감 1kg과 시체 200g을 시료 중량의 10배 양인 70% 에탄올을 가하여 상온에서 1주일간 3회 추출한 다음 여과지(Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압 농축하여 감 에탄올 추출물(이하 “D-EtOH”라 함) 472.7g과 시체 에탄올 추출물(이하 “DP-EtOH”라 함) 29.8g을 얻었다.
참고예 2. 시약 및 기기
항산화능과 항염증 측정 실험에 사용된 시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), xanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium (NBT), hyaluronidase, hyaluronic acid, p-dimethylaminobenzaldehyde, soybean lipoxygenase, linolenic acid, sodium nitrite 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 세포 배양액인 Dulbeco's Modifide Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 항염증 효과에 측정에 사용된 시약인 porcine pancreas elastase (PPE), N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였으며, 세포 독성 측정 시약은 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co. (Grand Island, U.S.A.) 및 Haemacytometer (Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, 3-[4,5-dimethyl -thiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. 항염증실험에 사용된 시약 중 Sodium Dodesyl Sulfate(SDS), Acrylamide, Bis는 Bio-rad사(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, NP-40, protease inhibitor, pipa buffer, Griess reagent 등은 sigma chemical Co.(St, Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 1차 항체인 iNOS BD Bioscience(SanJose, CA, USA) COX-2 (cayman), β-Actin Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase(HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하여 사용하였다.
실험예 1. 전자공여능 측정
전자공여능(EDA: electron donating ability)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature. 26, 1199-1120.).
각 시료용액 2ml에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 1ml 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 하기 수학식 1과 같이 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Figure pat00001
상기 실험 결과, 감 또는 시체 에탄올 추출물을 이용한 전자공여능 측정은 도 1과 같이 나타내었다(도 1 참조). 감 추출물의 경우 1000ppm에서 48%의 전자공여능을 나타낸 반면 감 시체의 경우 500ppm에서 91%의 전자공여능을 나타내어 대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)와 같은 농도에서 비교시 유사한 전자공여능을 나타내었다.
실험예 2. Superoxide dismutase ( SOD ) 유사활성 측정
SOD 유사활성은 Marklund의 방법에 준하여 측정하였다(Marithasan, S. at al. 2007. Inflammasome adaptors and sensor: intracelluar regulators of infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 7, 31-40.).
각 시료용액 0.2ml에 tris-HCl 완충용액(50mM tris+10mM EDTA, pH 8.5) 2.6ml와 7.2mM 피로갈롤(pyrogallol) 0.2ml를 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1M HCl 0.1ml를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 피로갈롤(pyrogallol)의 양을 420nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 하기 수학식 2와 같이 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Figure pat00002
상기 실험 결과, 감 또는 시체 추출물의 SOD 유사활성을 측정한 결과 도 2와 같이 나타내었다(도 2 참조). 감 또는 시체 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 유의적으로 SOD 유사활성을 나타내었다. 1000ppm 에서 감 또는 시체의 추출물 각각의 활성이 11%와 23% 정도를 나타내었다.
실험예 3. MTT assay 에 의한 세포 생존율 측정
감 또는 시체 추출물에 대한 독성 측정은 MTT 측정으로 분석하였다. 이 방법은 MTT가 포르마잔(formazan)으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, 하기 실험에 사용되는 각질형성세포(HaCaT)는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. HaCaT세포 5 x 104cells/ml를 96well plate에 분주하고 감 또는 시체 추출물을 농도별 (5, 10, 50, 75, 100ppm)로 24시간 동안 처리하였따. Well당 20ul의 MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율울 백분율로 표시하였다.
상기 실험 결과, 감 또는 시체에 의한 human keratinocyte 세포의 독성을 확인한 결과 도 3과 같이 나타내었다(도 3 참조). 감 또는 시체의 추출물이 100ppm에서 각각 93%, 94% 이상의 세포생존율을 나타내어 각질형성 세포 독성에 영향을 적게 주는 것으로 나타났다. 세포독성 결과로부터 시료용액의 농도를 100ppm이하의 농도로 결정하여 NO, iNOS를 측정하였다. 이는 돌나물 추출물을 100ug/ml 이상 처리 시 human keratinocyte 세포 (HaCaT)의 세포생존율이 90% 이하로 나타나 감 또는 시체의 세포생존율이 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 4. Nitric Oxide 생성량 측정
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포를 DMEM배지를 이용하여 5 x 104cells/ml로 조절한 후 12well plate에 접종하고, 5% CO2 incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 1ug/ml의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 5, 10, 25, 50ppm의 감 또는 시체 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 Griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.
상기 실험 결과, human keratinocyte 세포 (HaCaT)의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 감 또는 시체를 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과 도 4와 같이 나타내었다(도 4 참조). LPS를 첨가하지 않은 군에서는 54%의 NO를 생성하였고, LPS와 감 또는 시체를 첨가한 군에서는 감 시체 추출물이 NO의 생성량을 가장 많이 억제하였다. 즉, 감 또는 시체 추출물은 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제함을 나타내었으며, 50ppm의 농도에서 감의 경우 50ppm에서 27%의 NO의 생성을 억제하였으며, 감 시체의 경우 48% 이상의 높은 NO의 생성을 억제하였다.
실험예 5. Immunoblotting
배양이 끝난 세포를 수집하여 PBS(phosphate bufferd saline)로 세척한 후 100ul의 lysis buffer을 첨가하여 30분간 lysis 시킨 후 13,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bobine serum albumin)를 표준화하여 Brad-ford assay를 사용하여 정량화 하였다. 30ug의 lysate를 10% SDS-PAGE로 분리하여 이를 PVDF(polyvinylidenedifluoride) membrane에 55V로 90분간 transfer하였다. 그리고 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 준다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit(Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 LAS 4000 chemiluinescence detection system(Fuji, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 후 분석하였다.
상기 실험 결과, 감 또는 시체의 추출물이 iNOS를 저해하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 human keratinocyte 세포 (HaCaT)을 이용하여 iNOS protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였으며, 도 5와 같이 LPS를 처리하지 않은 Normal 군에서는 iNOS protein 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 iNOS protein 발현이 130kDa에서 상당 수준으로 나타났으며, 감 또는 시체 추출물을 첨가한 군에서는 농도 의존적으로 유의성 있게 iNOS 발현이 감소함을 나타내었다. 특히 시체의 경우 50ppm에서 77%이상의 iNOS 발현을 감소시켰다(도 5 참조).
하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
D-EtOH 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
D-EtOH 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
DP-EtOH 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
D-EtOH 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
DP-EtOH 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
DP-EtOH 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
D-EtOH 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

  1. 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 감은 홍시, 연시, 경북 청도반시 또는 단감의 과육, 과피 또는 시체임을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 피부염, 건선증, 상처 또는 아토피성 질환인 약학조성물.
  5. 감 추출물 또는 감 시체 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  6. 제 5항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.
KR1020100093235A 2010-09-27 2010-09-27 감 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 KR20120031695A (ko)

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