KR20150119560A - 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 - Google Patents

노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관노화 예방 또는 치료 활성이 뛰어난 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품에 관한 것이다.

Description

노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품{Pharmaceutical composition comprising extract of pleurotus cornucopiae and health functional food}
본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관노화 예방 또는 치료 활성이 뛰어난 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품에 관한 것이다.
혈관내피세포는 내피세포 유래성 산화 질소(nitric oxide, NO)와 프로스타노이드(prostanoid)를 유리하고, 혈관 활성과 관련된 호르몬을 활성화 혹은 분해하여 혈관 평활근의 기능을 조절함으로써 혈관을 수축 및/또는 이완시킬 수 있다.
혈관내피세포의 텔로머라제(telomerase) 활성은 노화가 이루어짐에 따라 감소한다. 또한, 노화된 혈관내피세포에서는 NO의 생성, eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 발현 및 프로스타시클린(prostacyclin)의 생성이 감소하여 현격히 낮은 혈관의 수축력을 나타내며, PAI-1(type I plasminogen activator) 발현은 증가하여 혈전 생성이 촉진되고, Inter-Cellular Adhesion Molecule 1(ICAM-1), 인터루킨-1, 인터루킨-8과 같은 세포 부착 단백질 및 케모카인의 발현이 증가되어 염증 반응이 증가함에 따라 혈관이 좁아지게 된다. 실제로, 동맥경화 병변 조직의 혈관내피세포는 정상 조직의 세포에 비해 세포 노화 표지로 잘 알려진 SA-β-Gal(senescenceassociated beta-galactosidase) 활성이 증가되어 있다고 알려져 있다. 아울러, 동맥경화 병변 조직의 세포들은 정상 조직의 세포에 비해 텔로미어 단축 정도가 더 높다. 따라서 혈관내피세포의 노화를 억제, 지연시키면 그로 인한 심혈관 질환을 예방, 치료할 수 있을 것으로 여겨진다.
또한, 종래 기술 중 공개특허 10-2004-0050396(공개일자: 2004년06월16일)에는 천궁, 천궁의 분말, 천궁의 추출물로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 이용한 약품 조성물를 기재하고 있다.
나아가, 공개특허 10-2013-0046115(공개일자: 2013년05월07일)에는 시링가레시놀을 유효 성분으로 포함하는 혈관 노화 억제용 조성물를 기재하고 있으며, 상기 조성물은 혈관 세포의 SIRT 1 발현을 증가시키고 텔로머라제를 활성화함으로써 우수한 혈관 노화 억제 효과를 나타낸다고 기재하고 있다.
더불어, 지금까지 혈관 노화를 지연시키는 방법 중 잘 알려진 방법으로는 칼로리 제한을 들 수 있다. 하지만 이는 실제 적용이 쉽지 않고 일상 생활의 불편을 야기한다는 점에서 다른 대안이 요구된다.
상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 혈관노화를 억제하는 효과를 가지며, 이로 인해 혈관질환 예방 또는 치료용으로 사용하기 적합한 약학적 조성물 및/또는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하고자 한다.
본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 혈관질환은 당뇨병, 뇌혈관 장애, 심혈관 장애, 폐색성 동맥 경화증, 인지증, 죽상(粥狀) 동맥 경화증, 고혈압 및 비만으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질환을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관노화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있다.
더불어, 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관노화 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있다.
본 발명은 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 우수한 혈관노화 억제 효과를 가지며, 이로 인해 혈관질환 예방 또는 치료용으로 사용하기 적합한 약학적 조성물 및/또는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 실험예 1에서 노랑느타리버섯 추출물의 제대혈과내피세포에 대한 세포독성을 측정한 결과이다.
도 2는 실험예 2에서 노랑느타리버섯 추출물의 제대혈과내피세포에 대한 세포독성을 측정한 결과이다.
도 3은 실험예 2에서 혈관노화 억제활성을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는 실험예 2에서 광학현미경 관찰 결과를 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 2에서 혈관노화 억제활성을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 6은 실험예 2에서 광학현미경 관찰 결과를 백분율로 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 지금까지 혈관 노화를 지연시키는 방법 중 잘 알려진 방법으로는 칼로리 제한을 들 수 있다. 하지만 이는 실제 적용이 쉽지 않고 일상 생활의 불편을 야기한다는 점에서 다른 대안이 요구되는 실정이다.
이에 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함으로써, 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 우수한 혈관노화 억제 효과를 가지는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 노랑느타리버섯 추출물은 통상적으로 천연물 유래 추출물 제조시 사용되는 추출용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 추출된 것일 수 있다.
실험예 2 및 도면 3 내지 6에서 확인되는 바와 같이, 물을 추출용매로 사용한 비교예 1의 추출물은 혈관노화 억제 활성이 에탄올을 추출용매로 사용한 실시예 1보다 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다.
상기 혈관질환은 통상적으로 혈관의 노화 및/또는 탄력 저하에 의해 발병할 수 있는 질병이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 당뇨병, 뇌혈관 장애, 심혈관 장애, 폐색성 동맥 경화증, 인지증, 죽상(粥狀) 동맥 경화증, 고혈압 및 비만으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질환을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관노화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 노랑느타리버섯 추출물은 통상적으로 천연물 유래 추출물 제조시 사용되는 추출용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 추출된 것일 수 있다.
실험예 2 및 도면 3 내지 6에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물은 혈관내피세포에서 아드리아마이신에 의해 증가된 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 우수한 혈관노화 억제 효과를 확인할 수 있었다.
본 발명의 약학적 조성물은 담체를 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001 ~ 100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 혈관질환 예방 또는 치료하는 데 충분한 양 및/또는 혈관노화 억제에 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
나아가, 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 노랑느타리버섯 추출물은 통상적으로 천연물 유래 추출물 제조시 사용되는 추출용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 추출된 것일 수 있다.
실험예 1 및 도면 1 내지 2에서 확인되는 바와 같이, 70% 에탄올을 추출용매로 사용한 실시예 2의 노랑느타리버섯 추출물은 세포 독성을 보여 동물에게 투여하기 적합하지 않은 것을 확인할 수 있었다.
상기 혈관질환은 통상적으로 혈관의 노화 및/또는 탄력 저하에 의해 발병할 수 있는 질병이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 당뇨병, 뇌혈관 장애, 심혈관 장애, 폐색성 동맥 경화증, 인지증, 죽상(粥狀) 동맥 경화증, 고혈압 및 비만으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질환을 포함할 수 있다.
더불어, 본 발명은 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관노화 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 노랑느타리버섯 추출물은 통상적으로 천연물 유래 추출물 제조시 사용되는 추출용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 추출된 것일 수 있다.
상기 건강기능성 식품의 종류에는 통상적으로 제조 및/또는 판매되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 노랑느타리버섯 추출물을 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상술한 추가 성분 이외에 본 발명의 건강기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 건강기능성 식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1.
특별히 부위별로 구별함이 없이 자실체 전체를 가지고 건조된 노랑느타리버섯(구매처: 우리들) 500g을 약 1 ㎝ 크기로 분쇄한 후, 50% 농도의 에탄올 10ℓ를 가하고, 25 ℃에서 24시간씩 2회 반복 추출하고, 여과지로 여과하였으며, 이를 감압농축하여 50g의 노랑느타리버섯 추출물을 수득하였다.
실시예 2.
50% 농도의 에탄올 대신 70% 농도의 에탄올을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 노랑느타리버섯 추출물을 제조하였다.
비교예 1.
50% 농도의 에탄올 대신 증류수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 노랑느타리버섯 추출물을 제조하였다.
준비예 1. 세포 배양
직경 100 ㎜ 배양 접시에 10%의 송아지 태아 혈청(fetal bovine calf serum, 웰진, 대구, 대한민국)와 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, 웰진, 대구, 대한민국)으로 Lonza (Walkersvill, MD, USA)에서 구입한 인간 섬유아세포를 1 ×105개로 분주하였다. 이후 37 ℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 3일 동안 배양하여 배양접시의 80 ~ 90%로 세포가 배양되면 2.5 × 트립신-에틸렌디아민사아세트산(EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid) 용액 1 ㎖로 처리하여 세포를 분리하였다. 이후 분리한 세포의 일부는 송아지 태아 혈청과 DMEM을 포함하는 배양 접시에 계대배양하여 유지하였으며, 일부는 실험에 사용하였다.
이후 실험에 사용한 세포는 아드리아마이신 처리를 위하여, 세포 배양액을 제거하고 배양된 세포를 수득하여 1% penicillin-streptomycin 용액(웰진, 대구, 대한민국)이 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후 500 nM 아드리아마이신(일동제약, 서울, 대한민국)을 4시간 동안 처리하였다.
또한, 직경 100 ㎜ 배양 접시에 내피세포배양배지(Endotherial cell Growth Media)인 EGM-2(Lonza, Walkersvill, MD, USA)으로 Lonza에서 구입한 제대혈관세포를 배양한 것을 제외하고는 상기 인간 섬유아세포 배양과 동일한 방법으로 배양 및 수득하고, 아드리아마이신 처리하였다.
상기 세포의 계대배양을 수행하면서 세포의 분열횟수를 population doublings(PDs)을 측정하여 구하였다. PD는 PD = log2F/log2I (F, final cell number; I, initial cell number)식을 사용하여 구하였으며, 인간 섬유아세포는 PD < 35, 제대혈관내피세포는 PD < 30의 세포를 아드리아마이신 처리에 사용하였으며, 복제노화가 유도된 늙은 세포는 인간 섬유아세포는 PD > 75, 제대혈관내피세포는 PD > 50의 세포를 사용하였다.
실험예 1. 세포독성 측정
준비예 1에서 아드리아마이신 처리한 제대혈관내피세포 및 섬유아세포에 1 ㎖의 2.5×트립신-EDTA를 처리하여, 제대혈관내피세포 또는 섬유아세포를 배양접시에서 분리하였다. 이후 분리한 세포를 12 웰 배양용기 또는 24 웰 배양용기에 세포를 분주하였다.
이후 24 시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하여 각 웰에 EGM-2배양액, 또는 10% 소 태아혈청을 포함하는 DMEM 배양액을 100 ㎕ 첨가하였다. 이후 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO), n-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5 mM, 라파마이(Rapamycin) 500 mM, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 노랑느타리버섯 추출물을 100 ㎍/㎖ 첨가하였다.
이후 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도를 MTT 방법으로 확인하였다. 상기 MTT 방법은 구체적으로, 96 웰 배양용기의 각 웰에 0.1% MTT 용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)을 50 ㎕씩 넣고 3 시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시켰다. 이후 배양액과 MTT용액을 제거하고 디메틸 셀폭사이드(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 첨가하여 형성된 결정을 녹였다. 이후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하여 처리하였다. 측정 결과 중 제대혈과내피세포에 대한 세포독성 결과는 도 1에, 섬유아세포에 대한 세포독성 결과는 도 2에 나타냈다.
도 1 내지 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1의 노랑느타리버섯 추출물은 제대혈관내피세포 및 섬유아세포에 독성을 나타내지 않아, 약학적 조성물 및/또는 건강기능성 식품에 포함하기 적합한 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 실시예 2의 70% 에탄올 노랑느타리버섯 추출물은 제대혈관내피세포에 대한 추출물의 세포독성으로 인해 세포가 성장하지 못하여 0%인 것을 알 수 있었습니다.
실험예 2: 혈관노화억제 활성 측정
준비예 1에서 아드리아마이신 처리한 제대혈관내피세포 및 섬유아세포에 1 ㎖의 2.5×트립신-EDTA를 처리하여, 제대혈관내피세포 또는 섬유아세포를 배양접시에서 분리하였다. 이후 분리한 세포를 12 웰 배양용기 또는 24 웰 배양용기에 세포를 분주하였다.
구체적으로, 50 ㎖ 튜브에 10% 우태아혈청과 1% penicillin-streptomycin 용액 (웰진, 대구, 대한민국)가 포함된 DMEM 배양액에 준비예 1에서 수득한 섬유아세포을, EGM-2 배양액에는 준비예 1에서 수득한 제대혈관내피세포를 넣어 24 웰 배양용기의 각 웰에 세포와 배양액을 분주하였다. 최종적으로 12 웰 배양용기에는 각 웰당 섬유아세포는 5000개, 제대혈관내피세포는 7000개씩 분주하였고, 24 웰 배양용기에는 각 웰당 섬유아세포는 3000개, 제대혈관내피세포는 5000개씩 분주하였다.
이후 24 시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하여 각 웰에 EGM-2배양액을 100 ㎕ 첨가하였다. 이후 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO), n-아세틸시스테인(N-acetylcysteine; NAC) 5 mM, 라파마이(Rapamycin) 500 mM, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 노랑느타리버섯 추출물을 각각 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖ 첨가하였다.
이후 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포를 인산완충액으로 2번 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 1분간 고정한 후 고정액을 제거하였다. 이후 SA-b-gal 염색 용액(40 mM 시트르산/인산염(citric acid/phosphate)[pH 5.8], 5 mM 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide), 5 mM 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) 1 ㎎/㎖) 500 ㎕를 첨가하였다.
이후 SA-β-gal 염색 용액을 첨가한 배양용기를 은박지로 싸서 37 ℃에서 16 시간 동안 반응시키고, 인산완충용액(PBS)로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액(eosin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 1분간 염색하였다. 상기 염색 도중 결정이 생겼을 경우, DMSO로 결정을 녹여 제거하였다. 상기 염색 이후 인산완충용액으로 2회 세척한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하여 혈관세포 노화에 대한 효과를 조사하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50 ~ 100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율(%)로 표시하였다. 광학현미경 관찰 결과 중 제대혈관내피세포는 도면 3에, 섬유아세포는 도면 4에 나타냈으며, 측정한 백분율 결과 중 제대혈과내피세포는 도면 5에, 섬유아세포는 도면 6에 나타냈다.
도 3 및 도 5에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물을 처리한 세포는 DMSO만을 처리한 세포에 비해 파란색으로 염색된 세포 수가 현저히 적었으며, 특히, 실시예 1의 화합물 1을 100 ㎍/㎖로 처리한 세포는 농도의존적으로 유의적인 SA-β-Gal 활성이 감소 효과를 보였으며, 이는 종래 공지된 혈관노화 활성 물질인 NAC 및 rapamvcin과 유사한 혈관노화 억제 활성을 확인한 것이다.
반면, 비교예 1의 노랑느타리버섯 추출물은 SA-β-Gal 활성 감소 효과를 확인할 수 없었으며, 이로 인해, 노랑느타리버섯 수추출물은 혈관노화 억제 활성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 노랑느타리버섯 추출물은 혈관내피세포 노화를 억제하여 혈관질환을 예방 또는 개선할 수 있음을 알 수 있다.
도 4 및 도 6에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 화합물들은 아드리아마이신에 의해 유발된 SA-β-gal의 활성 저해 활성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예, 비교예 및 실험예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 노랑느타리버섯 추출물은 높은 혈관노화 억제 활성이 있어 추후 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 혈관노화 억제용 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 등의 여러 분야에서 활용가능성이 큰 물질임이 자명하다.
[ 제조예 ]
제조예 1 : 약학적 조성물의 제조
본 발명의 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제조예 1-1. 산제의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예 1-2. 정제의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예 1-3. 캡슐제의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 1-4. 환의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
제조예 1-5. 과립의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
제조예 2 : 건강 기능성 식품의 제조.
제조예 2-1. 건강 기능성 식품의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 3000 ㎎
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제조예 2-2. 건강 음료의 제조
실시예 1의 노랑느타리버섯 추출물 3 g
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (9)

  1. 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출한 것을 특징으로 하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혈관질환은 당뇨병, 뇌혈관 장애, 심혈관 장애, 폐색성 동맥 경화증, 인지증, 죽상(粥狀) 동맥 경화증, 고혈압 및 비만으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관노화 억제용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것을 특징으로 하는 혈관노화 억제용 약학적 조성물.
  6. 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
  7. 제6항에 있어서, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것을 특징으로 하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
  8. 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 혈관노화 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
  9. 제8항에 있어서, 상기 노랑느타리버섯 추출물은 45 ~ 55 % 농도의 에탄올로 이루어진 군 중 1종 이상으로 추출된 것을 특징으로 하는 혈관노화 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101695186B1 (ko) * 2016-02-05 2017-01-11 원광대학교산학협력단 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물
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KR20210056714A (ko) * 2019-11-11 2021-05-20 대한민국(농촌진흥청장) 노랑느타리버섯 추출물 및 닥나무 가지 추출물의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물

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