KR102349702B1 - 산사 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산사(Crataegus pinnatifida) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 산사 추출물은 우수한 안정성과 더불어 티로시나아제의 발현 및 활성을 저해하는 기작을 통하여 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부에 자극 없이 멜라닌 색소 억제를 통한 우수한 미백 효과를 나타낼 수 있어 기능성 화장료 조성물, 건강기능 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산사 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 미백용 조성물 {SKIN WHITENING COMPOSITION COMPRISING CRATAEGUS PINNATIFIDA EXTRACT OR FRACTIONS THEREOF}

본 발명은 산사(Crataegus pinnatifida) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 산사 열매 추출물을 유효성분으로 포함하여 멜라닌의 생성을 억제할 수 있는 피부 미백용 화장료 조성물, 약제학적 조성물에 관한 것이다.

환경오염으로 피부의 자외선 노출이 증가하고 있어 피부노화에 의한 피부색의 침착이 심해지고 있다. 또한 미용적인 이유에서 피부착색에 대한 관심이 높아지고 있어, 이에 보다 안정적이고 효과적인 미백소재를 발견하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 산화되어 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)이 되고 이것이 다시 5,6-디하이드록시인돌(5,6-dihydroxy indole, indole 5,6-quinone)로 자동 산화되고 최종적으로 중합에 의해 멜라닌 폴리머(melanin polymer)를 생성하는 것으로 되어 있다. 관련 연구들을 살펴보면 멜라닌 합성 저해를 위한 티로시나아제 활성억제 소재 연구(알부틴, 코직산, 감초추출물, 닥나무 추출물 등), 피부각질층의 제거 효능을 가진 소재에 대한 연구(AHA, BHA, 아미노산, 살리실산 등), 자외선 차단소재 연구(이산화티탄, 감마오리자놀, 옥시벤존 등), 멜라닌 생합성 장소인 멜라닌형성세포(melanocyte)의 기능을 저하시키기 위한 멜라닌형성세포에 독성을 나타내는 소재 연구(비타민 C 등), 활성산소제거 소재에 대한 연구(비타민 E, 비타민 C) 등으로 이루어지고 있다. 그러나 이들 대부분의 것은 효과가 불충분하거나 제형상 불완전한 면이 있고, 피부에 대한 안정성 측면에서 그 사용이 제한되어 있으며, 원료에 대한 수입 의존도가 높은 문제점으로 최근에는 보다 안전하고 효과적인 멜라닌 생성 억제물질을 개발하려는 많은 연구들이 요구되고 있다. 따라서 미백 대체 원료로 여러 천연물 추출물을 이용한 기능성 미백 소재에 대한 연구 또한 활발히 진행되어 상백피나 천화분 추출물, 율피, 녹두 등이 미백원료로써 사용되고 있으며, 이에 대한 우수한 대체 미백제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 산사는 생김새가 둥글고 붉으며, 흰색의 반점이 있다. 바깥면은 황갈색이나 회색을 띤 적갈색이며 많은 가는 주름이 있다. 한쪽에는 지름 5㎜의 오목하게 들어간 곳이 있고 그 주변에 가끔 꽃받침이 남아 있으며, 다른 한쪽에는 과병 또는 자국이 남아 있다. 옆으로 자른면에는 5실로 된 씨방이 있으며 각 방에는 1개의 씨가 들어있다. 씨는 공을 몇 개로 등분한 모양으로 길이 6 ~ 8 mm이며 바깥면은 엷은 갈색이고 딱딱하며 질은 단단하다. 다른 이름으로 산사(酸査), 산리홍(山里紅), 홍과(紅果), 북산사(北山査), 적과자(赤瓜子), 산조홍(山棗紅), 홍과자(紅果子), 양구자(羊仇子), 당구자(棠子), 모사(茅), 산리과(山里果), 서사(鼠査), 서사(鼠), 양구(羊), 적실(赤爪實), 후사, 구자(子), 계매(梅)라고도 한다. 산사의 꽃은 5월에 흰색으로 피고, 열매는 이과(梨果)로서 둥글며 흰 반점이 있다. 한방에서는 건위, 소화, 수렴, 진통 등의 효과가 있는 것으로 알려져 왔으며, 유럽에서는 유럽 산사나무의 열매를 크라테거스(crataegus)라고도 칭하며, 강심제로 사용되기도 한다. 약리 성분으로는 카페산(caffeic acid), 구연산(citric acid), 코로솔릭 산(corosolic acid), 크라테골릭 산(crataegolic acid), 유스케픽 산(euscaphic acid), 하이페린(hyperin), 하이페로사이드(hyperoside), 프로카테추익 산(procatechuic acid), 피로갈롤(pyrogallol), 올레아놀 산(oleanolic acid), 우르솔릭 산(ursolic acid), 비텍신(vitexin) 등이 보고되었으며, 생리 활성으로는 항산화(한국등록특허 제10-0570120호) 효과, 항균(김정현 등, 2010) 효과, 순환계 질환(Ryu, H. Y. et al., 2007) 개선 효과 등이 있는 것으로 보고되어 있다.

산사와 관련된 선행문헌으로서, 한국공개특허 제10-2005-0079256호에는 어성초, 복분자의 혼합 추출물 및 산사자가 추가로 포함된 혼합물에 대한 알레르기 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대해 개시되어 있으며, 선행논문 [Li, C. et al., 2011]에는 산사자의 물 분획물이 항염 효과가 있음을 개시하였으나, 산사 추출물을 유기용매로 재분획한 분획물이 피부 미백제 또는 색소침착 개선제로서 사용될 수 있는 점에 대해서는 아직까지 개시된바 없다.

본 발명의 주된 목적은 멜라닌의 생성 억제 및 세포외 분비 저해 활성을 갖는 산사 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 미백 효과를 가장 유효하게 나타낼 수 있는 산사 특이적 추출 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 산사(Crataegus pinnatifida) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 티로시나아제 발현을 저해하거나 멜라닌 생성을 억제할 수 있으며, 해당 조성물은 당 분야에서 알려진 통상의 방법에 따라 제형화 되어 화장료 조성물, 식품 조성물, 약학 조성물 또는 의약외품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 산사(Crataegus pinnatifida) 열매 추출물은 감압고온추출, 열탕추출, 환류추출, 열수추출, 상온추출, 초음파 추출 및 증기추출 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 분획물은 산사 추출물을 감압농축한 후 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)로 분획하여 제조될 수 있으며, 상기 분획 시 상기 에틸 아세테이트의 농도는 12.5μg/mL 내지 100μg/mL, 12.5μg/mL 내지 50μg/mL, 12.5μg/mL 내지 25μg/mL, 25μg/mL 내지 100μg/mL, 50μg/mL 내지 100μg/mL, 150μg/mL 내지 200μg/mL, 200μg/mL 내지 250μg/mL일 수 있다.

본 발명은 또한, 산사(Crataegus pinnatifida) 열매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 분획물은 산사 추출물을 감압농축한 후 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)로 분획하여 제조될 수 있으며, 상기 분획 시 상기 에틸 아세테이트의 농도는 12.5μg/mL 내지 100μg/mL, 12.5μg/mL 내지 50μg/mL, 12.5μg/mL 내지 25μg/mL, 25μg/mL 내지 100μg/mL, 50μg/mL 내지 100μg/mL, 150μg/mL 내지 200μg/mL, 200μg/mL 내지 250μg/mL일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물에 따라 치료될 수 있는 피부 과색소성 질환에는, 주근깨, 유전성대측성색소이상증, 망상지단 색소침착증, 편평 모반, 색소성 모반, 기미, 노인성색소반, 백반, 바덴부르그 증후군, 후염증성 백색 비강진, 물방울 멜라닌 저하증, 기미 및 어루러기가 포함될 수 있다.

본 발명은 또한, 피부 미백용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, a) 산사 열매를 열수 추출하는 단계, b) 상기 단계 a)에 따라 제조된 추출물을 감압 농축하는 단계, c) 상기 단계 b)의 생성물을 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)를 이용하여 분획한 후, 감압농축하는 단계 및 d) 상기 단계 c)의 생성물을 동결건조하는 단계를 포함하는, 산사(Crataegus pinnatifida) 열매의 분획물을 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 분획 시 상기 에틸 아세테이트의 농도는 농도는 12.5μg/mL 내지 100μg/mL, 12.5μg/mL 내지 50μg/mL, 12.5μg/mL 내지 25μg/mL, 25μg/mL 내지 100μg/mL, 50μg/mL 내지 100μg/mL, 150μg/mL 내지 200μg/mL, 200μg/mL 내지 250μg/mL일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 산사 추출물을 포함함으로써 멜라닌 합성을 억제하기위한 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 약제학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면 멜라닌 합성 억제 및 피부 미백에 가장 효과적인 산사 추출물 및 이의 분획물을 제조할 수 있다.

도 1의 A는 B16F1 세포에 농도별 산사 추출물을 처리한 후 세포 생존률을, 도 1의 B는 농도별 산사 추출물과 α-MSH (0.2 μM)를 동시에 처리한 후 세포 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 2는 B16F1 마우스 흑색종 세포에 농도별 산사 추출물과 α-MSH (0.2 μM)를 동시에 처리하고, 세포 내 멜라닌을 분광광도계를 이용하여 그 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물을 처리한 후 세포 펠렛(pellet)과 세포배양 배지의 색 변화를 나타낸 이미지이다.
도 4는 B16F1 마우스 흑색종 세포에 농도별 산사 추출물과 α-MSH (0.2 μM)를 동시에 처리하고, 세포 외 멜라닌을 분광광도계를 이용하여 그 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5의 A는 농도별 산사 추출물을 α-MSH와 B16F1 세포에 처리한 후 tyrosinase 활성을 측정한 그래프이며, 도 5의 B는 농도별 산사 추출물을 α-MSH (0.2 μΜ)과 처리한 후 B16F1 세포에 단백질(anti-MITF antibody)의 발현을 확인한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 α-MSH로 유도된 B16F1 마우스 흑색종 세포에서 산사 추출물의 멜라닌 합성 관련 산물의 mRNA 발현 억제 효능을 나타낸다. 도 6의 A는 산사 추출물 처리시 타이로시나제(tyrosinase)의 mRNA 발현 정도를, 도 6의 B는 MITF의 mRNA 발현 정도를 나타내는 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 산사 열매 추출물을 이용한 분획물의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 산사 열매의 물 추출물 또는 α-MSH (0.2 μM) 분획으로 처리된 B16F1 흑색 종 세포의 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± SD (n = 3)로 표시되었으며 대조군 대비 유의한 차이는 ^###p <0.001로, α-MSH 처리 군 대비 유의한 차이는 ^*p <0.05, ^***p <0.001로 나타냈다. 도 8에서 HF는 헥산 분획, CF는 클로로포름 분획, EF는 에틸 아세테이트 분획, BF는 부탄올 분획, WF는 물 분획, CE는 산사 열매 추출물을 의미한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 산사 열매의 물 추출물 또는α-MSH (0.2 μM) 에틸 아세테이트 분획으로 처리된 B16F1 흑색 종 세포에서의 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± SD (n = 3)로 표시되며, 대조군 대비 유의한 차이는 ^### p <0.001, α-MSH 처리 군 대비 유의한 차이는 ^**p <0.01, ^***p <0.001로 표시된다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 산사 열매 추출물과 그 분획물이 B16F1 세포의 타이로시나제(tyrosinase) 성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다. 타이로시나제(tyrosinase) 활성은 α-MSH (0.2μM)의 부재 또는 존재 하에 B16F1 세포에서 결정되었다. 데이터는 평균 ± SD (n = 3)로 표시되며, 대조군 대비 유의한 차이는 ^### p <0.001, α-MSH 처리 군 대비 유의한 차이는 ^***p <0.001로 표시된다. 도 10에서 HF는 헥산 분획, CF는 클로로포름 분획, EF는 에틸 아세테이트 분획, BF는 부탄올 분획, WF는 물 분획, CE는 산사 열매 추출물을 의미한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 B16F1 세포에서 산사 열매 에틸 아세테이트 분획이 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다. 타이로시나제(tyrosinase) 성은 α-MSH (0.2μM)의 부재 또는 존재하에 B16F1 세포에서 결정되었다. 도 11에서 B16F1 세포는 다양한 농도의 에틸 아세테이트 분획 (12.5, 25 또는 50μg / mL) 및 산사 열매 추출물에 72 시간 동안 노출되었습니다. 도 11에서 데이터는 평균 ± SD (n = 3)로 표시되며, 대조군 대비 유의한 차이는 ^### p <0.001, α-MSH 처리 군 대비 유의한 차이는 ^***p <0.001로 표시된다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 B16F1 세포에서 산사 열매 에틸 아세테이트 분획이 타이로시나제(tyrosinase) 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 이미지이다. 도 12에서 타이로시나제(tyrosinase)의 세포 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 조사되었으며, 여기서의 데이터는 평균 ± SD (n = 3)로 표시되며, 대조군 대비 유의한 차이는 ^###p <0.001로, α-MSH 처리 군 대비 유의한 차이는 ^*p <0.05, ^***p <0.001로 표시된다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기 기재한 바와 같이, 기존의 멜라닌 생성 억제제는 미백 효과가 미미하거나 피부에 대한 안전성이 부족하다는 한계점이 존재하여 우수한 효과를 제공할 수 있는 대체제가 요구되는 실정이었다.

본 발명의 ‘산사’는 장미과 사과나무속에 속하는 소교목인 산사나무 열매를 산사 또는 산사자라고 하며, 아시아와 북아메리카가 원산지이고 흔히 심는 사과나무보다는 딱딱하고 훨씬 작으며 가시가 있다. 맛은 시큼하지만 색깔이 선명하고 적당한 단맛도 가지고 있어 젤리, 통조림, 술, 차로 만들어 먹었으며 한방에서는 생약을 위장약 등으로 이용하였다.

본 발명자들은 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물은 타이로시나제(tyrosinase) 활성을 억제하고 멜라닌 생성 세포에 독성을 띄지 않는 조건에서 이의 멜라닌 생성을 유의적으로 억제하여 미백 효과를 제공할 수 있음(실시예 1 내지 4)을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 산사(Crataegus pinnatifida) 추출물은, 멜라닌 생성 세포에서 멜라닌의 생성을 억제하거나 세포외 분비를 저해함으로써 피부미백 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 산사 추출물은 쥐의 흑색종 세포에서 멜라닌 합성 및 세포외 분비를 억제하는 것을 확인하였다 (도 2 내지 4 참조).

따라서, 본 발명은 산사 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미백용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 ‘미백’이란, 멜라닌의 생성을 저해하여 피부 색소 침착을 억제 내지 방지하거나 개선하는 모든 작용을 의미할 수 있다.

본 발명의 산사 열매 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 제조된 것일 수 있다. 상기 용매는 물 또는 C1 내지 C4의 저급알코올인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올 또는 프로판올인 것이 바람직하며 가장 바람직하게는 물을 용매로 할 수 있다.

상기 산사 열매 추출물은 조성물에 10 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으나, 바람직하게는 300 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

상기 산사 열매 추출물은 감압고온추출, 열탕추출, 환류추출, 열수추출, 상온추출, 초음파 추출 및 증기추출 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 제조한 것일 수 있으며, 바람직하게는 환류 추출 방법으로 제조한 것이 바람직하다. 상기 추출공정 후, 여과, 원심분리 또는 농축과정 등 추출물의 순도를 높이기 위한 정제 과정을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 농축은 침전농축, 증발농축, 감압농축, 한외여과법, 역삼투법 및 원심분리법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 감압농축 방법으로 농축하는 것이 바람직하다.

상기 산사 추출물의 분획물은 상기 산사 추출물을 헥산, 클로로폼, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 용매로 하여 분획한 후 제조된 것일 수 있으며, 분획 시 용매는 에틸 아세테이트인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 상기 조성물은 당 분야에서 널리 사용되는 통상의 방법에 따라 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 산사 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물 (화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 산사 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 산사 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 산사 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001중량% 미만에서는 목적하는 미백 효과를 기대할 수 없고, 10 중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물와 미백 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜 성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립 화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물와 미백 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물이 건강음료 조성물로 이용되는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리 톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수 화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.

산사 열매 추출물 또는 이의 분획물은 미백용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 미백 효과를 달성하기에 유효한 양으로, 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%일 수 있으며, 0.01 내지 50 중량% 인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 산사 열매 추출물 또는 이의 분획물과 함께 미백 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보 호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 산사 추출물 또는 이의 분획물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물은 그대로 첨가되거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 샤워폼, 세제비누, 핸드워시 또는 연고제일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면 산사 추출물을 포함하는 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 피부 과색소성 질환은 흑색종, 색소침착증, 예컨대, 주근깨, 유전성대측성색소이상증, 망상지단 색소침착증, 모반, 예컨대, 편평 모반, 색소성 모반 등과 같은 선천적 색소침착증, 및 기미, 노인성색소반 등과 같은 후천성 색소침착증, 및 유전적 피부 질환, 예컨대, 백반, 바덴부르그 증후군, 후천적 피부 질환, 예컨대, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 기미, 약물치료에 기인한 피부 질환, 예컨대, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘, 및 감염을 통해 전이된 피부 질환, 예컨대, 어루러기 등을 포함할 수 있다.

상기 “예방”은 동물의 병리학적 현상의 발생 빈도 또는 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 피부 침착에 의해 발생하는 질환이 상기 조성물을 사용하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.

상기 “치료”는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적으로 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인 산 일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 약제학적 조성물은 통상적으로 사용되는 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 카우레노산 유도체 화합물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 화합물이 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

한편, 상기 산사 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 상기 산사 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.　

상기 산사 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다. 상기 “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

산사 추출물 및 분획물의 제조

<1-1> 산사 추출물 제조

본 연구에 사용된 산사추출물(001-112)은 한국생명공학연구원의 한국식물추출물은행(Daejeon, Korea)에서 얻은 것이다. 상기 산사는 2002년 경기도 용인시에서 채집되었다. 그늘에 말려서 분말화된 식물(60g)에 Methyl alcohol 99.9%(HPLC grade) 1L를 첨가하여 초음파분산기(ultrasonic extractor, SDN-900H, SD-ULTRASONIC CO., LTD)를 이용해 실온에서 30 cycle(40KHz, 1500W, 15 min. ultrasonication-120 min. standing per cycle) 동안 추출하였다. 여과 및 감압건조 후에, 산사추출물(20.40g)을 얻었다. 분양받은 산사추출물(001-112)은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 고동도(200 mg/ml)로 녹인 후, 멸균된 3차 증류수에 녹여(100, 250, 500 μg/ml) 실험에 이용되었다.

<1-2> 산사 추출물의 분획물 제조

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 산사 추출물을 100 ㎖의 증류수로 현탁시키고 동량의 헥산(100 ㎖)을 넣어 흔든 다음 평형화시켜 헥산 가용부를 모아 농축하는 과정을 총 3회 반복하여 헥산 분획물을 확보하였다. 순차적으로 동일한 방법을 수행하여 클로로폼 분획물을 확보, 및 최종으로 물 분획물을 확보하였다.

[실시예 2]

<2-1> 세포 배양

세포는 mouse melanoma cell line인 B16F1을 이용하였으며, 본 세포는 Korean cell line bank(한국 세포주 은행)으로부터 구입하였다. 10 % fetal bovin serum (FBS)과 1 % penicillin streptomycin을 함유하는 DMEM 배지를 이용하여, 5 % CO₂를 함유하는 37 ℃ 인큐베이터에서 유지시켰다. 유지를 위해, 세포는 2일마다 한 번씩 계대배양하였다.

<2-2> 세포 독성 확인

mouse melanoma 세포주인 B16F1에 대한 산사 추출물의 세포생존률을 확인하기위해, MTT assay를 진행하였다. B16F1 세포를 2.5×10⁴ 밀도로 24 well 세포배양 plate에 깔아주었다. 이들 세포에 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM)을 처리하고, 48시간 동안 37 ℃에서 α-MSH (0.2 μΜ)의 존재 또는 부재 하에 자극시켰다. 48시간 후에, MTT시약 (80 μg/ml)을 20 μL씩 각 well에 넣어주고 암조건, 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. MTT 시약이 함유된 배지를 제거하고, DMSO 400 μL를 넣어 세포내 포르마잔 (formazan)을 용해시켰다. 흡광도 측정을 위해 96 well plate로 200 μL씩 옮긴 후, 552 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존률은 대조군의 %로 나타내었다 (도 1 참조).

도 1을 참조하면, B16F1 흑색종 세포에서 산사 추출물이 세포독성을 보이는지 여부를 확인할 수 있다. 도 1의 A는 B16F1 세포에 농도별 산사 추출물을 처리한 후 세포 생존률을, 도 1의 B는 농도별 산사 추출물과 α-MSH (0.2 μM)를 동시에 처리한 후 세포 생존률을 나타낸 그래프이다.

구체적으로 살펴보면, 도 1의 A에서는 B16F1 세포에 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM)을 48시간 동안 처리하였다. 도 1의 B에서는 B16F1 세포에 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM) 그리고 α-MSH (0.2 μM)를 동시에 처리하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않은 배지를 이용한 후, 48시간 후 MTT 시약 (80 μg/ml, 암조건)을 처리한 후, 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 나타내었다.

도 1의 A 및 B를 참조하면, 산사 추출물을 농도별로 처리하였을 때와 α-MSH를 동시에 처리하였을 때 대조군에 비해 별다른 독성을 보이지 않는 것을 확인할 수 있다.

[실시예 3]

<3-1> Melanin contents 측정 (세포 내 멜라닌 함량 측정)

세포 내 멜라닌의 함량을 측정하기위해, B16F1 세포를 5×10⁴ 밀도로 60 mm 세포배양 dish에 깔아주었다. 이들 세포에 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM)을 처리하고, 72시간 동안 37℃에서 α-MSH (0.2 μΜ)로 자극시켰다. 72시간 후에 세포의 펠렛을 모아, 10% DMSO가 함유된 1M NaOH로 80℃에서 1시간 동안 반응시켜 녹였다. 멜라닌의 함량은 405 nm에서 흡광도를 측정하여 나타내었다.

<3-2> Melanin contents 측정 (세포 외 멜라닌 함량 측정)

세포 외 멜라닌 함량을 측정하기 위해, 세포배양 배지를 이용하였다. 72시간 동안 37 ℃에서 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM)을 처리하고, α-MSH (0.2 μΜ)로 B16F1 세포를 자극시킨 후에 세포배양 배지를 150 μL씩 96 well plate로 옮긴 후에 405 nm에서 흡광도를 측정하여 나타내었다.

도 2 및 도 4에서 멜라닌의 함량은 대조군의 %로 나타내었다. 도 2는 B16F1 마우스 흑색종 세포에 농도별 산사 추출물과 α-MSH (0.2 μ

)를 동시에 처리하고, 세포 내 멜라닌을 분광광도계를 이용하여 그 함량을 나타낸 그래프이며, 도 4는 동일한 방식으로 세포 외 멜라닌을 분광 광도계를 이용하여 함량을 나타낸 그래프이다. 도 3은, 세포 펠렛(pellet)과 세포배양 배지에 실시예 3에 따라 산사 추출물을 처리한 후 색의 변화를 나타낸 이미지이다. 구체적으로, 도 2 및 4에서는 B16F1 마우스 흑색종 세포에 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM) 그리고 α-MSH (0.2 μM)를 동시에 처리하고, 72시간 후에 세포외/세포내 멜라닌을 분광광도계를 이용하여 그 함량을 나타내었다. 405nm에서 흡광도를 측정하여 대조군의 %로 멜라닌의 함량을 나타내었다. 도 3에서는 세포 펠렛(pellet)과 세포배양 배지 색이 산사 추출물을 처리한 후 변화하는 것을 변화 강도와 함께 나타낸다.

실시예 3에 따른 멜라닌 함량 측정 결과는 도 2 내지 4와 같다. 도 2 내지 4를 참조하면, 멜라닌 생합성과정의 최종산물인 멜라닌의 생성을 산사 추출물이 억제하는지를 α-MSH로 유도된 B16F1 마우스 흑색종 세포에 산사 추출물과 표준물질(kojic acid)를 비교하여 확인할 수 있다. α-MSH 단독 처리군에서 멜라닌의 생성이 유도되었으며 이는 농도별 산사 추출물을 처리하였을 때 세포 외/세포 내 멜라닌의 함량이 농도의존적으로 대조군과 유사한정도까지 감소된 것을 확인할 수 있다. 멜라닌의 감소는 산사 추출물을 처리한 후, 세포의 펠렛과 세포배양 배지의 색으로 확인할 수 있다. 따라서, 산사 추출물은 멜라닌 생합성 과정의 최종 생산물인 멜라닌의 생성을 감소시키는데 효능이 있음을 나타낸다.

[실시예 4]

Western blot analysis (단백질 발현 분석)

B16F1 세포를 5×10⁴ 밀도로 60 mm 세포배양 dish에 깔아주었고, 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM)을 α-MSH (0.2 μΜ)와 함께 72시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 72시간 후에, phosphate buffered saline (PBS)으로 남아있는 배지와 기타 잔여물을 2번 헹궈주었다. 세포의 펠렛을 모으고, protein inhibitor가 함유된 lysis buffer (RIPA buffer)로 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 DC Protein assay를 통해 정량하였으며, 정량한 단백질은 10 % SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 및 nitrocellulose (NC) membranes으로 옮겼다. membrane은 Tris-buffered saline-Tween 20 solutions (TBS-T)으로 녹인 5% 탈지 우유 (non-fat dry milk)로 blocking하였으며, 1차 항체로 4 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후에 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T로 헹궈준 후, horseradish peroxidase 2차 항체(anti-mouse 및 anti-rabbit IgG)로 상온에서 2시간 반응시켰다. 단백질 밴드는 western HRP substrate 및 ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Life Science, USA)을 통해 시각화되었다.

실시예 4에 따른 단백질 발현분석은 도 5에 나타나있다. 도 5의 A는 농도별 산사 추출물을 α-MSH와 B16F1 세포에 처리한 후 tyrosinase 활성을 측정한 그래프이며, 도 5의 B는 농도별 산사 추출물을 α-MSH (0.2 μΜ)과 처리한 후 B16F1 세포에 단백질(anti-MITF antibody)의 발현을 확인한 이미지이다. 구체적으로 도 5의 A에서는 농도별 산사 추출물(100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질 kojic acid (1 mM) 그리고 α-MSH (0.2 μΜ)의 존재 또는 부재하에, 72시간 동안 처리한 후 tyrosinase 활성을 측정하였으며, 도 5의 B에서는 농도별 산사 추출물(100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질 kojic acid (1 mM) 그리고 α-MSH (0.2 μΜ)의 존재 또는 부재하에 3시간 동안 처리한 후 단백질 발현을 확인하였다(anti-MITF antibody).

MITF는 microphthalmia-associated transcription factor로, 멜라닌 세포에서 멜라닌합성에 필수적인 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 전사인자이다. 또한, 멜라닌세포의 분화, 색소침착, 증식 및 생존의 조절에 관여한다. MITF와 관련된 신호전달 경로는 멜라닌의 생성을 조절하는데, Melanocortin 1 receptor(MC1R)에 자외선으로부터 생성된 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)이 결합하게 되면, 일련의 신호전달 과정을 통해 멜라닌 합성에 필수적인 유전자 tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, tyrosinase-related protein 2의 발현을 증가시켜 멜라닌의 합성을 유도한다. 이중 Tyrosinase는 멜라닌의 생성을 조절하는 주된 효소로써, ① L-tyrosine을 Dopaquinone으로 산화 ② L-tyrosine을 L-Dopa로 산화 ③ 5,6-dihydroxyindole(DHI)을 indole-2-carboxtlic acid-5,6-quinone(IQ)로의 산화 작용에 관여한다.

도 5를 참조하면, α-MSH에 의해 tyrosinase의 활성이 유도되었으며 이는 농도별 산사 추출물을 처리함으로써 농도의존적으로 그 활성이 감소되는 것을 확인할 수 있다. 또한, MITF의 단백질 발현 역시 α-MSH에 의해 유도되었으며, 이는 산사 추출물을 처리함으로써 그 발현이 감소된 것을 확인할 수 있다. 따라서, 산사 추출물은 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 tyrosinase의 효소활성을 억제하고 MITF의 단백질 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 감소시키는데 효능이 있음을 나타낸다.

[실시예 5]

Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction analysis (mRNA 발현 분석)

B16F1 세포를 3Х10⁵ 밀도로 60 mm 세포배양 dish에 깔아주었다. 24시간 후에, 농도별 산사 추출물 (100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질인 kojic acid (1 mM)을 전처리하고 1시간 뒤에 α-MSH (0.2 μM)를 처리하였다. 36시간동안 37 ℃에서 반응시킨 후, 배양 배지를 제거한 dish에 Trizol reagent(ambion)를 1 mL 넣고 5분동안 반응시킨 후 1.5 mL tube에 회수하였다. Cholroform (sigma aldrich, USA) 200 μL를 넣고, 연한분홍빛이 될 때까지 용액을 vortexing 해주었다. 용액이 섞인 후 5분동안 반응시켜주고, centrifuge(12000rpm, 10분, 4℃)하여 용액을 분리시켜주었다. 분리된 층 중에서 상등액(수층, aqueouse phase) 500 μL를 조심스럽게 회수한 후, 1.5 mL tube로 옮겨주었다. Iso-prophyl alcohol (sigma aldrich, USA)을 500 μL를 넣고 inverting하여 섞어준 후, 5분동안 반응시켜주었다. centrifuge(12000rpm, 10분, 4℃)하여 RNA를 침전시켰으며, 남아있는 유기용매를 제거하기위해 75% Ethanol DEPC-treated water 1 mL을 넣고 centrifuge(12000rpm, 5분, 4℃) 2번을 시행하였다. Pellet이 마를 때까지 기다린 후 DEPC-treated water를 넣어 pellet을 녹여주었다.

추출한 RNA를 정량하기위해 QuickDrop Micro-Volume Spectrophotometer(molecular devices, US)를 이용하여 농도를 측정하였다. 농도가 측정된 RNA는 2500 ng/μl가 되게 정량을 한 후, Random primer와 Oligo dT primer(Promega, USA)를 넣어 1차적으로 primer를 붙여주고 GoScriptTM 5X reaction buffer, MgCl2, dNTP, GoScriptTM Reversr transcriptase(Promega, USA)를 추가적으로 넣어 최종적으로 두 가닥의 cDNA를 합성하였다. 합성이 끝난 cDNA에 80 μl의 DEPC를 넣어 500 ng/μl가 되도록 희석하였다.

PCR을 진행하기 위해 5X Green Gotaq reaction buffer, Forward primer, Reverse primer, dNTP, MgCl2, Gotaq DNA polymerase, template(cDNA)를 PCR tube에 넣고 Thermal cycler(BIO-RAD, USA)로 ①tyrosinase(Tm:55 ℃, 107bp, forward primer:5'-CTC TGG GCT TAG CAG TAG GC-3', reverse primer: 5'-GCA AGC TGT GGT AGT CGT CT-3') ②MITF(Tm:55 ℃, 273bp, forward primer:5'-CAG CC ATAA ACG TCA GTG TG-3', reverse primer: 5'-GAG TGA GCA TAG CCA TAG GG-3') ③GAPDH(조건에 맞게 PCR을 진행하였다. 끝난 PCR은 1.5% agarose gel(Biosesang, seungnam, KOREA)을 통해 발현을 확인하였다.

도 6은, 실시예 5에 따라 α-MSH로 유도된 B16F1 마우스 흑색종 세포에서 산사 추출물의 멜라닌 합성 관련 산물의 mRNA 발현 억제 효능을 나타낸다. 도 6의 A는 산사 추출물 처리시 tyrosinase의 mRNA 발현 정도를, 도 6의 B는 MITF의 mRNA 발현 정도를 나타낸다. 도 6의 A에서는 농도별 산사 추출물(100, 250, 500 μg/ml)과 표준물질 kojic acid (1 mM)를 전처리 후 1시간 뒤에 α-MSH (0.2 μΜ)를 처리하였다. 36시간동안 반응시킨 후 RT-PCR을 진행하였다. 도 6을 참조하면, α-MSH tyrosinase와 MITF의 mRNA가 발현이 되었고 이는 산사 추출물의 농도 의존적으로 그 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있다. 이는 산사 추출물은 멜라닌 합성에 관여하는 산물들의 mRNA 수준을 억제하여 최종적으로 멜라닌의 합성을 억제하는 효능이 있음을 나타낸다.

본 발명의 상기 실시 예를 종합해보면, 산사 추출물은 α-MSH로 유도된 마우스 흑색종 세포인 B16F1에서 멜라닌의 생합성에 중요한 역할을 하는 Tyrosinase 및 MITF의 mRNA 수준의 억제를 나타내었다. 이 수준의 억제는 Tyrosinase 효소 활성과 단백질 발현 및 MITF의 단백질의 발현을 억제하였으며, 이를 통해 최종산물인 멜라닌의 감소가 이루어졌음을 확인할 수 있다. 이는 표준물질인 kojic acid 보다 tyrosinase activity, mRNA 수준의 발현 억제를 높게 나타내었다. 따라서, 산사 추출물은 미백을 위한 화장품의 원료 또는 멜라닌 생성의 억제를 위한 피부 미백용 조성물, 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 이용될 수 있음을 나타낸다.

이하, 산사 열매 추출 방법에 따른 미백활성을 확인한다.

[실험예 1]

통계처리

모든 실험값은 평균±표준편차로 표시하였으며, 통계분석은 GraghPad 5.0을이용하여 분산분석 (ANOVA)로 처리하였으며 유의성 한계는 <0.05 수준에서 던칸의 다중범위검정 (Duncan's multiple range test)에 의한 사후분석을 수행하였다.

실험예 1-1. 산사 열매의 열수 추출물의 제조

산사 열매를 이용하여 열수 추출물을 제조하였으며, 100g 중량 대비 10배수의 증류수를 넣어 95℃ 에서 2시간 동안 추출 후 필터하여 찌꺼기를 걸러내고 감압농축 후 동결건조하여 열수 추출물로 사용하였고, 같은 방법으로 추출한 열수 추출물을 감압농축하여 200㎖로 제조하여 유기용매 분획물에 사용하였다.

실험예 1-2. 산사 열매 열수 추출물의 유기용매 분획물의 제조

산사 열매 열수 추출물 200㎖ 대비 유기용매를 200㎖씩 3번씩 첨가하여 분획물을 얻었다. 유기용매는 n헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올을 차례대로 분획에 사용하였다. 각 용매 단계마다 실온에 정치하여 유기용매층과 물층이 분리되면, 유기용매층만을 회수하여 감압농축하여 동결건조 후 유기용매 분획물 시료로 사용하였다 (도 7 참조).

그 결과, 산사 열매 100g을 물추출하여 물추출물 5.8g을 수득하였으며, 산사 열매 100g을 물추출하여 얻은 물추출물을 감압농축하여 열수 추출물 200mL로 제조 후 이를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 분획하여 감압농축 후 동결건조하여, 헥산 분획물 0.041g, 클로로포름 0.652g, 에틸아세테이트 분획물 0.464g, 부탄올 분획물 3.724g, 물 분획물 2.014g을 수득하였다.

실험예 1-3. 산사열매 열수 추출물 및 분획물이 멜라닌 합성 억제에 미치는 영향

멜라노사이트 (B16F1)를 60mm dish에 5Х10⁴ 세포로 접종하였다. 접종 다음날 시료와 양성대조군 (kojic acid, 1mM)을 처리하고, Control을 제외한 나머지군에 멜라닌 생성을 유도하는 α-MSH (α-melanin stimulating hormone, 0.2 μM)를 처리하였다. 72시간 후 세포를 회수하여 DMSO가 포함된 1N NaOH를 넣어 80℃에서 20분동안 용해한 후 흡광도 405nm에서 세포 내 멜라닌을 측정하였다. α-MSH를 처리하지 않은 control을 100% 기준으로 각 군의 멜라닌 생성량을 비교하였다.

도 8 및 도 9에서는 상기 방법에 따라 산사열매 열수 추출물 및 유기용매 분획물의 미백 효과를 확인하기 위하여 멜라노마 세포를 이용하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 산사열매 열수 추출물과 열수 추출물의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물분획물에 대하여 멜라닌 함량을 측정한 결과, 50μg/mL의 처리 농도에서 에틸아세테이트 분획물>산사열매 물추출물> 헥산 분획물> 부탄올 분획물> 물 분획물> 클로로포름 분획물 순으로 멜라닌 합성 저해율이 우수하였다(도 8 참조). 클로로포름 분획물을 제외한 유기용매 분획물은 멜라닌 합성이 억제되었지만 클로로포름 분획물은 α-MSH를 처리한군 보다도 멜라닌 함량이 더 증가하였다. 이후, 분획물 중 멜라닌 합성 억제가 가장 우수하였던 에틸아세테이트 분획물을 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12.5 μg/mL의 농도로 처리하고, 비교 그룹으로 산사 열수 추출물을 50 μg/mL 및 100 μg/mL로 처리하고 양성대조군인 kojic acid를 1mM로 처리한 후 멜라닌 함량을 비교하였다. 멜라닌 생성을 유도하는 α-MSH 단독으로 처리하였을 때 멜라닌의 함량은 control 대비 175%로 증가하였고, 산사열매의 물추출물을 50 μg/mL와 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 때는 161%, 150%로 멜라닌 함량이 억제되었다 (도 9 참조). 특히, 에틸아세테이트 분획물을 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL의 농도로 처리하였을 때의 멜라닌 함량은 각각 156%, 147%, 117%로 억제되었다. 산사열매의 물추출물과 에틸아세테이트 분획물을 같은 농도인 50 μg/mL로 처리하였을 때 에틸아세테이트 분획물이 물추출물보다 20% 정도 멜라닌 합성을 억제하였고, 양성대조군인 kojic acid와 비교하였을 때도 멜라닌 생성 억제 효능이 더 우수하였다.

실험예 1-4. 산사열매 열수 추출물 및 분획물의 티로시나제 활성 측정

멜라노사이트 (B16F1)를 60mm dish에 5Х10⁴ 밀도로 접종한 후 시료와 양성대조군인 kojic acid를 처리하고, Control을 제외한 나머지군에 멜라닌 생성을 유도하는 α-MSH를 처리하였다. 72시간 후 세포를 회수하여 lysis 버퍼를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질을 정량하여 군별 동량의 단백질을 96웰 플레이트에 넣은 후 L-dopa (2mM)를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. α-MSH를 처리하지 않은 control을 티로시나제 활성 100% 기준으로 하여 각 군의 티로시나제의 활성을 측정하였다.

산사열매 열수 추출물 및 분획물에 대한 티로시나제 활성을 측정을 한 결과, 독성이 없는 농도인 50 μg/mL의 처리 농도에서 무처리 군인 control을 100%로 하여 a-MSH만 처리하였을 때, 티로시나제 활성은 386%로 증가하였으며, 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물에서 각각 353%, 330%, 242%, 288%, 350%의 티로시나제 활성을 나타내었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물은 산사열매 물추출물이나 양성대조군인 kojic acid 처리군 보다 티로시나제 억제능이 우수하였다 (도 10 참조). 따라서 이후 에틸아세테이트 분획물을 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12.5 μg/mL의 농도로 처리하고, 비교군으로 산사열매 열수 추출물을 50 μg/mL 및 100 μg/mL로 처리하고 양성대조군으로 kojic acid 1mM을 사용하여 티로시나제 활성을 측정하였다. 그 결과, α-MSH를 처리한 군은 control에 비해 티로시나제 활성이 474% 증가하였으며, 에틸아세테이트 분획물을 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 티로시나제 활성은 각각 397%, 373%, 344%로 α-MSH 처리군 대비 83.6%, 78.6%, 72.5%로 감소되었다 (도 11 참조). 또한, 산사열매 물추출물을 50 μg/mL과 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 때는 각각 429%, 391%로 α-MSH 처리군 대비 90.3%, 82.4%로 감소하였다. 이는 산사열매 물추출물과 에틸아세테이트 분획물을 50 μg/mL의 같은 농도로 처리하였을 때 에틸아세테이트 분획물이 물추출물보다 약 17.8% 정도 티로시나제 활성 억제율이 우수하였으며 물추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 때보다도 10% 정도 우수하였으며 양성대조군으로 사용한 kojic acid 보다도 티로시나제 활성 저해 효과가 우수하였다.

실험예 1-5. 웨스턴 블롯팅 방법을 이용한 티로시나제 단백질 발현 분석

B16F1 세포를 5Х10⁴ 밀도로 60mm dish에 접종한 후 다음날 시료, kojic acid 및 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH를 각각 처리하여 3일 동안 배양하였다. 배양을 마친 세포를 인산완충식염수로 세척 후, 세포를 모아 lysis 버퍼를 넣고 15분 동안 얼음에 꽂아 세포를 용해시키고, 13,000Хg에 15분 동안 원심분리를 하여 얻은 상층액을 단백질로 사용하였다. 브래드포드법(Bradford assay)으로 단백질 함량을 정량 한 후, 동량의 단백질을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 다음 PVDF(Polyvinylidene difluoride)막에 단백질을 트랜스퍼 시켰다. 5% 비지방 탈지유가 함유된 TBS-T(tris buffered saline-tween20)로 1시간동안 블로킹하였다. 그 후 TBS-T로 3회 세척하고, 항-티로시나제(1:1,000)를 첨가하여 4℃에서 하루동안 반응시킨 후 충분히 세척하고, 호스래디쉬퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase)가 부착된 2차 항체(1:1,000)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. TBS-T로 10분씩 3회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 방법으로 발색시켰다.

Claims (12)

1. 피부 미백용 조성물에 있어서,
   산사(Crataegus pinnatifida) 열매의 분획물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 분획물은 산사 열매 추출물을 감압농축한 후 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)로 분획하여 제조되며,
   상기 분획 시 상기 에틸 아세테이트의 농도는 12.5 μg/mL 내지 100 μg/mL이고,
   상기 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물 및 의약외품 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 피부 미백용 조성물.
2. 제1 항에 있어서,
   상기 조성물은 티로시나아제의 발현을 저해하거나 멜라닌의 생성을 억제하는, 피부 미백용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 산사(Crataegus pinnatifida) 열매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 분획물은 산사 추출물을 감압농축한 후 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)로 분획하여 제조되며,
   상기 분획 시 상기 에틸 아세테이트의 농도는 12.5 μg/mL 내지 100 μg/mL인, 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제7 항에 있어서,
    상기 피부 과색소성 질환은, 주근깨, 유전성대측성색소이상증, 망상지단 색소침착증, 편평 모반, 색소성 모반, 기미, 노인성색소반, 백반, 바덴부르그 증후군, 후염증성 백색 비강진, 물방울 멜라닌 저하증, 기미 및 어루러기로 이루어진 군에서 선택된 질환 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
11. 피부 미백용 조성물의 제조 방법에 있어서,
    a) 산사 열매를 열수 추출하는 단계;
    b) 상기 단계 a)에 따라 제조된 추출물을 감압 농축하는 단계;
    c) 상기 단계 b)의 생성물을 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)를 이용하여 분획한 후, 감압농축하는 단계; 및
    d) 상기 단계 c)의 생성물을 동결건조하는 단계를 포함하며,
    상기 단계 c)의 분획 시 상기 에틸 아세테이트의 농도는 12.5 μg/mL 내지 100 μg/mL이고,
    상기 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물 및 의약외품 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 산사(Crataegus pinnatifida) 열매의 분획물을 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조 방법.
12. 삭제

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