KR102094949B1 - 흑무 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 미백용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 미백용 조성물은 세포 독성이 없으면서, 멜라닌 생성과 티로시나아제 생성을 억제할 수 있으므로, 피부 미백을 위한 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 피부 외용제 조성물, 피부 색소침착 질환을 예방 또는 완화할 수 있는 건강기능식품 또는 피부 색소 침착질환의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

흑무 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 미백용 조성물{Whitening composition containing extract, fractions or compound derived from Raphanus sativus L. var niger}
본 발명은 흑무 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 미백용 조성물에 관한 것이다.
멜라닌은 피부색을 결정하는 중요한 내적 인자이다. 멜라닌은 피부에 존재하는 색소 성분으로 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성된다. 멜라닌은 멜라노사이트의 멜라노좀이라는 소포체에서 티로시나아제(tyrosinase), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2 등에 의한 티로신(tyrosine)의 산화반응과 효소반응을 통해 생합성 된다.
티로시아나제(tyrosinase)는 티로신을 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)를 거쳐 DOPA-quinone으로 산화시킨다. TRP-1은 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)를 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 전환시키며, TRP-2는 DOPA chrome tautomerase로 작용하여 DOPA chrome을 DHICA로 전환시킨다. 또한 멜라닌 세포의 성장과 분화에 중요한 전사 조절 인자인 MITF (microphthalmia-associated transcription factor)는 멜라닌 생성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TPR-2 등의 발현을 촉진한다. 이에 따라 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 작용 기작 억제를 통해 피부 미백 효과를 기대해 볼 수 있다.
한편, 대표적인 미백 소재 화합물로는 누룩 곰팡이로부터 분리된 kojic acid, arbutin, hydroquinone, oxyresveratol, p-hydrobenzyl alcohol 등이 알려져 있으며, 천연물로서는 닥나무 추출물(한국공개특허 제2012-0003238호), 감초추출물(한국공개특허 제2010-0059321호), 발아콩추출물(한국공개특허 제2014-0017197호), 녹차추출물(한국공개특허 제2012-0061733호) 등이 알려져 있다.
특허공개번호 제10-2012-0061733호
본 발명의 목적은 멜라닌 생성 억제 및 세포내 tyrosinase 활성 억제 효과를 갖는 흑무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 피부 미백을 위한 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 피부 외용제 조성물, 피부 색소침착 질환을 예방 또는 완화할 수 있는 건강기능식품 또는 피부 색소 침착질환의 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018038144272-pat00001
흑무(Raphanus sativus L. var. niger)는 무의 유색 무 품종 중 하나로 유럽에서는 약용으로 많이 사용되어 온 작물이다. 백무와 달리 겉피가 검정색인 것이 특징이다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 흑무를 건조 및 파쇄하여 분말화한 것을 추출에 적용할 수 있고, 흑무의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 이들 모두를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 뿌리를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 식물로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 식물의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 흑무(Raphanus sativus L. var. niger)를 추출하는 데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 흑무 뿌리를 건조 및 파쇄한 후 70%(w/v) 에탄올로 추출하는데, 1 내지 100배(w/v)의 에탄올로 1회 내지 10회 반복 추출하여 흑무 에탄올 추출물을 얻었으며, 이를 n-헥산(n-hexane, Hex), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), n-부탄올(n-butanol, BuOH), 물(water, H2O) 순서로 순차적으로 분획하여 총 4개의 용매 분획층인 노르말 헥산, 에틸아세테이트, 노르말 부탄올, 잔여 물층의 분획물을 제조하였다.
또한, 상기 에틸아세테이트 분획물에서 6가지 종류의 화합물을 분리하였으며, compound 1은 3-(E)-(메틸티오)메틸렌-2-피롤리딘티온[3-(E)-(methylthio)methylene-2-pyrrolidinethione], compound 2는 아스코르비젠(ascorbigen), compound 3은 β-시토스테롤(β-sitosterol), compound 4는 팔미틱산(palmitic acid), compound 5는 α-리놀레닉산(α-linolenic acid), compound 6은 1-리놀레오닐 글리세롤(1-linoleonyl glycerol)로 동정되었다.
따라서, 상기 흑무 추출물 또는 이의 분획물은 3-(E)-(methylthio)methylene-2-pyrrolidinethione, ascorbigen, β-sitosterol, palmitic acid, α-linolenic acid 및 1-linoleonyl glycerol 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 상기 흑무 뿌리의 에탄올 추출물과 상기 추출물의 n-헥산(n-hexane, Hex), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), n-부탄올(n-butanol, BuOH), 물(water, H2O) 분획물을 제조하고 이를 Murine B16F10 melanoma cell에 처리하였을 때, 활성의 차이는 있었지만 n-헥산(Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물이 다른 추출물이나 분획물에 비해 멜라닌 색소 생성 억제 효과가 우수하여 미백 활성이 우수한 것을 확인하였다.
또한, 상기 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 분리된 6가지 화합물 중에서, compound 1에 해당하는 3-(E)-(methylthio)methylene-2-pyrrolidinethione이 멜리닌 색소 생성을 억제하여 미백활성을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 미백용 화장료 조성물은 흑무 뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
또한 본 발명에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또한 본 발명에서 사용되는 용어, "미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미하는 것으로서, 구체적으로는 피부 미백을 의미할 수 있다. "피부 미백"은 멜라닌의 생성이 저해됨에 따른 결과로서 이해되는데, 구체적으로는 멜라닌의 생성이 저해됨에 따라 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상, 예컨대 기미, 주근깨 개선, 피부 노화 등의 개선으로서 이해될 수 있다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 유효성분인 흑무 뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에, 피부 미백 효과를 상승 또는 보강시킬 수 있도록 피부 미백 효과가 있다고 알려진 화합물이나 천연 추출물을 포함할 수 있다. 여기서 미백 효과가 있다고 공지된 화합물이나 천연 추출물로서는 멀캅토숙신산, 멀캅토덱스트란, 테프레논, 디하이드록시-이소퀴놀린, 인도메타신, 3-하이드록시마뉼, 비타민 K, 티아졸리돈, 키누레닌, 레몬 추출물, 오이 추출물, 오디 추출물, 로즈마리 추출물, 아세로라 추출물, 체리 추출물, 은행 추출물, 제라늄(geranium) 추출물 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 미백용 화장료 조성물에 있어서, 그 유효성분은 피부 미백 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.99 중량 % 범위 내에서 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 미백 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 구체적으로, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 구체적으로, 비누 조성물일 수 있으며, 이 경우, 비누 기재에 그 유효성분을 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다. 상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속 이온봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체의 함량을 기준으로 하였을 때 1 중량 % 내지 99 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 미백용 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 5 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.
그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료의 제조되는 전술한 바의 형태에 따라 또한 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018038144272-pat00002
본 발명에서, 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 미백에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 미백용 식품 조성물은 피부에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하는데 도움을 주는 기능을 가질 수 있으며, 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착하는 것을 방지하여 피부 색소 침착 질환의 발생을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1로 표시되는 화합물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 화학식 1로 표시되는 화합물의 식품학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있으며, 상기 식품학적으로 허용되는 염은 식품학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염일 수 있다. 상기 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
또 다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 미백용 식품 조성물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 완화용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 용어 건강기능식품, 미백, 식품 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일실시예에서는 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이 세포에 독성을 일으키지 않는 범위 내에서 멜라닌 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 티로시나아제의 발현 및 활성을 저해시킬 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 건강기능식품은 피부에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하는데 도움을 주는 기능을 가질 수 있으며, 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착하는 것을 방지하여 피부 색소 침착 질환의 발생을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 피부 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 또는 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018038144272-pat00003
본 발명에서 용어 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 색소 침착 질환에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 피부 색소 침착 질환을 예방 또는 치료한다는 것은 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합을 포함하는 조성물을 과다 색소 침착된 피부에 적용함으로써, 피부에 멜라닌 색소가 침착되는 것을 예방하는 것에 그치지 않고 더 나아가 피부에 이미 침착된 멜라닌을 제거하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다
본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구적, 비경구적으로 투여될 수 있지만, 통상적으로 외용제 제형으로 피부에 국소적으로 직접 투여될 수 있다.
또 본 발명의 약학적 조성물은 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS) 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 1일 투여량은 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어지는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018038144272-pat00004
본 발명에서, 흑무 (Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 미백은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충진제로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018038144272-pat00005
본 발명에서, 흑무 (Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 미백은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "외용제"는 외용으로 제공되는 제제이고, 외용산제, 외용정제, 외용액제, 연고제, 경고제, 좌제 등이 있으며, 본 발명의 피부 외용제는 특히 피부 외용에 작용하는 제제는 제한 없이 포함한다.
본 발명에 따른 피부 외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패치, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 외용제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
각 제형에 의한 피부 외용제 조성물은 본 발명의 추출물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.
본 발명의 피부 외용제 조성물은 총 조성물의 중량 대비 유효성분을 0.0001 내지 30%(w/v)로 포함할 수 있다. 만약, 0.0001 %(w/v) 미만으로 포함되면, 피부의 미백 효과를 실질적으로 기대할 수 없다. 반면, 30 %(w/v)을 초과하며 포함할 경우에는 용제로의 용해성 등 조성물의 전체적인 가공성이 떨어져 제형 등 각종 용도로의 사용이 제한될 수 있다.
본 발명의 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 조성물은 세포 독성이 없으면서, 멜라닌 생성과 티로시나아제 생성을 억제할 수 있으므로, 피부 미백을 위한 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 피부 외용제 조성물, 피부 색소침착 질환을 예방 또는 완화할 수 있는 건강기능식품 또는 피부 색소 침착질환의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 흑무 뿌리 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물에 의한 멜라닌 생성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 흑무 뿌리 추출물의 헥산(Hex) 또는 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 멜라닌 생성 (melanogenesis) 저해 활성 및 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 총 6개의 화합물에 의한 멜라닌 생성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 compound 1의 농도에 따른 멜라닌 생성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 compound 1의 농도에 따른 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 compound 1의 농도에 따른 (A) TRP-1 , (B) TPR-2 및 (C) 티로시나아제(tyrosinase) 단백질 발현 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 실험 재료 준비
<실시예 1-1> 시약 및 기기
시료의 추출, 용매 분획 및 단일물질 분리에 사용된 용매들은 OCI (Seoul, Korea) 및 대정화금(Siheungsi, Gyeonggi-do, Korea)의 제품을 사용하였다. Vacuum liquid chromatography (VLC)에는 silica gel (2-25 μm, Sigma Co., St. Louis, MO, USA), normal-phased column chromatography (CC)에는 silica gel (40-63 μm, Merck Co., Darmstadt, Germany), gel filtration chromatography (GFC)에는 SephadexTM LH-20 (GE Healthcare Life Sciences, PA, USA)이 사용되었다.
분리 과정에 사용된 thin layer chromatography (TLC)는 precoated silica gel aluminium sheet (Silica gel 60 F254, 2.0 mm, Merck Co., Darmstadt, Germany)를 사용하였다. TLC 상에서 분리된 물질들을 확인하기 위하여 UV lamp (254 nm)를 사용하거나, 발색 시약에 침적시킨 후 heat gun을 이용하여 건조시켰다. 발색 시약으로는 1% anisaldehyde-H2SO4 용액 및 KMnO4 수용액(3% KMnO4, 20% K2CO3, 0.25% NaOH)을 필요에 따라 사용하였다.
분리된 화합물의 생리활성 연구를 위한 흡광도 측정에는 SunriseTM (Tecan Co., Mannedorf, Swiss)를 이용하였다. 구조분석에 이용된 NMR (nuclear magnetic resonance spectrometer)은 JNM-ECX 400 (FT-NMR system, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)과 AVANCE III (FT-NMR system, Bruker Co., Billerica, MA, USA)를 이용하였으며, NMR 측정 용매는 CIL (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA, USA)과 Merck사의 NMR 전용 용매로 methanol-d 4, choloroform-d, pyridine-d 5, dimethyl sulfoxide-d 6를 사용하였다.
<실시예 1-2> 실험 시료
본 발명에 사용된 시료인 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 뿌리는 2016년 12월에 제주 서귀포시 성산읍 성산일출봉농협으로부터 제공받아 사용하였다. 흑무 뿌리는 물로 세척한 후 동결 건조기에서 96시간 동안 건조시켰으며, 건조물은 분쇄한 후 추출 과정에 사용하였다.
<실시예 2> 흑무 뿌리 추출물 및 이의 용매 분획물 제조
건조된 흑무 뿌리 500 g을 70% 에탄올 5 L에 넣고 실온에서 24시간 교반 침출하였다. 침출시킨 시료를 감압 흡입 여과기를 이용하여 여액만 취하였으며, 이와 같은 방법으로 분리한 잔사에 대하여 동일한 조건으로 1회 더 반복 실시하였다. 이렇게 여과하여 얻어진 여액은 40℃ 이하의 수욕상에서 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator)로 농축하여 흑무 에탄올 추출물 152.0 g을 얻어 준비하였다.
상기 제조한 흑무 에탄올 추출물을 물 1 L에 현탁시키고 분별 깔때기를 이용해 극성순서에 따라 순차적으로 분획하여 n-헥산(n-hexane, Hex), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), n-부탄올(n-butanol, BuOH), 물(water, H2O) 순서로 총 4개의 용매 분획 층을 얻었다. 상기 생성된 분획물들은 각각 감압 건조하여 분말 형태의 흑무 에탄올 추출물의 분획물로 준비하였다.
<실시예 3> 흑무 추출물의 용매 분획물로부터 생리활성 화합물 분리 및 구조 동정
상기 실시예 2에서 수득한 흑무 용매 분획물로부터 유효성분을 분리하고 구조를 동정하기 위해, 하기의 실시예 4의 결과들을 토대로 생리활성 기능이 있는 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물을 선택하고 이로부터 단일 화합물(compound)을 분리하고 구조를 동정하였다.
<실시예 3-1> 흑무 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 활성성분 분리
상기 실시예 2에서 수득한 흑무 뿌리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 1.0 g을 극성에 따라 세분화하기 위하여 순상 실리카 겔(normal phased silica gel)로 충진한 글라스 컬럼(glass column)을 이용하여 VLC(vacuum liquid chromatography)를 수행하였다.
n-헥산(Hex)/에틸아세테이트(EtOAc) (0-100%), 에틸아세테이트(EtOAc)/메탄올(MeOH)(10-100%)의 용매 조건들로 극성 비율을 10%씩 높이는 방법으로 각 100 mL씩 용출시켜 총 21개의 분획(fraction, Fr.)을 얻었다. VLC 분획들 중 Fr.V4와 Fr.V5 (30-40% EtOAc in Hex)를 합한 75.5 mg을 클로로포름(CHCl3):메탄올(MeOH)=25:1의 용매 조건으로 순상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(normal phased silica gel column chromatography)를 수행하여 compound 3 (14.3 mg), compound 4(19.0 mg), compound 5 (17.7 mg)을 얻었으며, Fr.V8 (70% EtOAc in Hex) 55.7 mg을 물(H2O):메탄올(MeOH)=4:6의 조건으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatography)를 수행하여 compound 1 (14.7 mg)을 분리하였다. 또한, Fr.V7 (60% EtOAc in Hex) 43.4 mg과 Fr.V10 (90% EtOAc in Hex) 10.0 mg은 각각 단일화합물인 compound 6과 compound 2로 확인되었다.
<실시예 3-2> 흑무 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 활성성분의 구조 동정
상기 실시예 3-1과 같이 흑무 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 총 6개의 활성 화합물을 분리하여 1H-핵자기공명 스펙트럼(1H-NMR spectrum) 및 13C-핵자기공명 스펙트럼(13C-NMR spectrum)을 측정하여 구조를 동정한 결과, 하기의 표 1에서 나타낸 바와 같이 compound 1은 3-(E)-(methylthio)methylene-2-pyrrolidinethione으로, compound 2는 아스코르비젠(ascorbigen)으로, compound 3은 β-시토스테롤(β-sitosterol)로, compound 4는 팔미틱산(palmitic acid)으로, compound 5는 α-리놀레닉산(α-linolenic acid)으로, compound 6은 1-리놀레오닐 글리세롤(1-linoleonyl glycerol)로 동정되었다.
Figure 112018038144272-pat00006
<실시예 4> 흑무 추출물 및 이의 용매 분획물의 멜라닌생성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포독성 평가
상기 실시예 2에서 수득한 흑무 뿌리 에탄올 추출물(Extract), 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(Hex), 에틸아세테이트(EtOAc), n-부탄올(BuOH), 물(H2O) 분획물의 미백 효과를 확인하기 위하여 B10F10 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 생성 억제 효과와 세포내 tyrosinase 저해 활성 및 western blot을 실시하였다. 또한 상기 미백 효과를 확인하기 위해 처리한 시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT(Dimethylthiazolyl diphenyl tetrazolium salt) assay를 수행하였다.
<실시예 4-1> 세포배양
Murine B16F10 melanoma cell은 ATCC(American Type Cell Culture, USA)로부터 분양 받아 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100 U/mL 페니실린(penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, GIBCO, NY, USA)를 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator) 조건에서 배양하였으며, 3일 간격으로 계대 배양하였다.
<실시예 4-2> 흑무 추출물 및 이의 용매 분획물의 멜라닌생성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포독성 평가
상기 실시예 4-1에서 배양한 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 6×104 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에서 24시간 배양하였다. 전 배양시킨 세포의 배지를 100 nM α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)가 포함된 배지로 교환 후, 실시예 2의 흑무 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물 시료를 각각 100 μg/mL의 농도로 처리하고 72시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)으로 세척한 후, trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 1 N NaOH 300 μL를 첨가하여 70℃에서 30분간 반응시켜 세포내의 멜라닌을 녹여 내여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성을 비교하기 위한 양성대조군으로는 melasolv (20 μM)를 사용하였다.
한편, 상기와 동일한 방법으로 세포를 배양 후 시료를 처리한 well plate에 500 μg/mL 농도의 MTT 시약을 첨가하여 3시간 동안 반응 시킨 후 상등액을 완전히 제거하고, 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570 nm에서 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 세포독성을 평가하였다. 세포 생존율은 다음의 식에 의해 계산되었다.
세포 생존율(Cell viability, %) = (Asample/Acontrol)×100
Acontrol : 용매를 처리(시료 무첨가)한 후 형성된 포르마잔의 흡광도
Asample : 시료를 처리한 후 형성된 포르마잔의 흡광도
흑무 뿌리 70% 에탄올 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(Hex), 에틸아세테이트(EtOAc), n-부탄올(BuOH), 물(H2O) 분획물의 멜라닌 생성량 및 세포 생존률을 확인한 결과, n-헥산(Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 각각 77.2% 및 75.9%로 멜라닌 색소 함량이 감소하였으나, 약간의 세포 독성이 나타났다(표 2, 도 1).
시료 처리농도 멜라닌 형성 저해율(%) 세포 생존률(%)
control
(α-MSH 처리)		 - 0 100.0
Extract 100 μg/mL 12.5 94.2
Hex 100 μg/mL 77.2 88.4
EtOAc 100 μg/mL 75.9 75.0
BuOH 100 μg/mL 10.8 103.7
H2O 100 μg/mL 12.5 105.0
Melasolv 20 μM 49.5 94.8
<실시예 4-3> 흑무 추출물의 n -헥산(Hex) 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 멜라닌생성(melanogenesis) 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 4-2에서 흑무 추출물의 4가지 용매 분획물 중, 세포독성을 보였으나 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 감소한 n-헥산(Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 시료를 추가적으로 농도를 낮추어 각각 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 40 μg/mL의 농도별로 멜라닌생성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포독성을 측정하였다. 이때, 멜라닌생성 저해 활성 및 세포독성 측정 방법은 상기 실시예 4-2와 같은 방법으로 수행하였다.
흑무 추출물의 n-헥산(Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 40 μg/mL 이하의 농도에서 치명적인 세포독성 없이 농도 의존적으로 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 감소함을 확인하였다(표 3, 도 2).
시료 처리농도 멜라닌 형성 저해율(%) 세포 생존률(%)
control
(α-MSH 처리)		 - 0 100.0
Hex 10 μg/mL 16.4 104.3
20 μg/mL 36.0 98.2
40 μg/mL 62.3 88.4
EtOAc 10 μg/mL 5.3 106.1
20 μg/mL 14.3 100.6
40 μg/mL 43.7 82.1
<실시예 5> 흑무 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물의 멜라닌생성(melanogenesis) 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 3에서 분리 동정한 6개의 화합물에 대한 멜라닌생성(melanogenesis) 저해 활성 측정 및 세포독성을 확인하기 위하여 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 멜라닌 색소 함량(melanin contents) 및 세포 생존율을 확인하였다.
흑무 뿌리 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물을 각각 100 μM의 농도로 B16F10 세포에 처리하고 멜라닌생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, compound 1에서 세포독성 없이 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 49.3% 감소함을 확인하였다 (표 4, 도 3).
시료 처리농도 (μM) 멜라닌 형성 저해율(%) 세포 생존률(%)
control
(α-MSH 처리)		 - 0 100.0
compound 1 100 49.3 102.1
compound 2 100 -5.9 102.7
compound 3 100 -20.7 52.2
compound 4 100 19.3 100.8
compound 5 100 18.7 98.3
compound 6 100 27.7 83.9
Melasolv 20 45.1 91.0
또한, 흑무 뿌리 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물 중 세포독성 없이 멜라닌 색소 함량이 감소한 compound 1을 25 μM, 50 μM, 100 μM의 농도별로 B16F10 세포에 처리하고 농도에 따른 멜라닌생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, 100 μM 이하의 농도에서 세포독성 없이 농도 의존적으로 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 감소함을 확인하였다(표 5, 도 4).
시료 처리농도 (μM) 멜라닌 형성 저해율(%) 세포 생존률(%)
control
(α-MSH 처리)		 - 0 100.0
compound 1 25 22.5 100.3
50 32.9 104.2
100 52.5 105.8
<실시예 6> 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 compound 1의 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 저해 활성 평가
상기 실시예 5에서 흑무 뿌리 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물 중 세포독성 없이 멜라닌 색소 함량이 감소한 compound 1에 대하여 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 저해 활성을 측정하였다.
상기 실시예 4-1에서 배양한 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 6×104 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에서 24시간 배양하였다. 전 배양시킨 세포의 배지를 100 nM α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)가 포함된 배지로 교환 후, compound 1을 각각 25 μM, 50 μM, 100 μM의 농도별로 처리하고 72시간 배양하였다.
이후 배지를 제거하고 cold PBS로 세척한 후, lysis buffer (1×RIPA, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsufonyl fluoride)를 이용해 4℃에서 오버나잇(overnight)해 lysis 시킨 후, 원심분리(15,000 rpm, 20 min, 4℃)하여 단백질 상등액만 분리하여 효소액으로 사용하였다.
96 well plate에 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹인 8 mM L-DOPA 160 μL와 상기의 단백질 상층액 20 μL를 혼합하여 37℃에서 1-2시간 반응시킨 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)을 standard로 Bradford 시약을 사용해 정량하여 보정하였다.
실험결과, 흑무 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 compound 1이 농도 의존적으로 세포내 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(표 6, 도 5).
시료 처리농도 (μM) 세포내 티로시나아제 저해율(%)
control
(α-MSH 처리)		 - 0
compound 1 25 17.4
50 24.6
100 42.6
<실시예 7> 흑무 뿌리 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 compound 1의 TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 단백질 발현 억제 활성 평가
상기 실시예 5와 6에서 미백 활성을 나타내었던 compound 1에 대하여 멜라닌 생성과 관련된 단백질인 TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 발현 양을 Western blot을 이용하여 측정하였다.
상기 실시예 4-1에서 배양한 B16F10 melanoma 세포를 60 mm culture dish에 9×104 cells/dish로 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에서 24시간 배양하였다. 전 배양시킨 세포의 배지를 100 nM α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)가 포함된 배지로 교환 후, compound 1을 각각 25 μM, 50 μM, 100 μM의 농도별로 처리하고 72시간 배양하였다.
이후 배지를 제거하고 cold PBS로 세척한 후, lysis buffer (1×RIPA, 10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsufonyl fluoride)를 이용해 4℃에서 오버나잇(overnight)해 lysis 시킨 후, 원심분리(15,000 rpm, 20 min, 4℃)하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)을 standard로 Bradford 시약을 사용하여 정량하였다.
상기의 정량한 단백질 30 μg을 8-12%의 SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하고 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane에 transfer 시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% skim milk가 포함된 TBS-T (0.1% Tween 20, Tris-buffered saline)에 넣고 상온에서 2시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 TRP-1, TRP-2, tyrosinase antibody (1:1000, SantaCruz) 및 β-actin antibody (1:20000, Sigma)를 이용하여 4℃에서 overnight 반응시켰다. 이후 TBS-T 용액으로 5회 세척 후, peroxidase-conjugated 된 2차 항체 (1:2000 또는 1:20000, Santacruz)와 상온에서 1시간 반응시킨 뒤 TBS-T 용액으로 5회 세척하였다. 단백질은 WESTAR NOVA 2.0 (CYANAGEN, Italy) 용액을 이용해 ECL 기질과 반응 시킨 후, Chemidoc (Fusion solo, VILBER LOURMAT, Germany)을 이용하여 각각의 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 compound 1은 TRP-2와 tyrosinase 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 하지만 TRP-1 단백질은 농도에 따른 큰 변화가 관찰되지 않았다.

Claims (11)

  1. 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물의 헥산 또는 에틸아세테이트의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019102285271-pat00007
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인, 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 흑무 추출물은 흑무의 에탄올 추출물인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 흑무 추출물 또는 이의 분획물은 3-(E)-(methylthio)methylene-2-pyrrolidinethione, ascorbigen, β-sitosterol, palmitic acid, α-linolenic acid 및 1-linoleonyl glycerol 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것인, 조성물.
  7. 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물의 헥산 또는 에틸아세테이트의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019102285271-pat00008
  8. 제7항의 조성물을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 완화용 건강기능식품.
  9. 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물의 헥산 또는 에틸아세테이트의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019102285271-pat00009
  10. 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물의 헥산 또는 에틸아세테이트의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 의약외품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019102285271-pat00010
  11. 흑무(Raphanus sativus L. var. niger) 추출물의 헥산 또는 에틸아세테이트의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019102285271-pat00011

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