KR102116744B1 - 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화 촉진용 조성물 - Google Patents

삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 삼채 추출물은 근아세포의 세포 생존률을 증진시킬 뿐만 아니라, 근세포 분화 관련 단백질의 발현량을 조절하는 효과가 있으며, 근아세포가 근관세포로 분화하는 것을 유도 및 촉진할 수 있는 것이다.
따라서 본 발명의 삼채 추출물은 근 분화 촉진제, 근육질환에 대한 의약품 또는 근육증가 촉진 또는 노인성 근 손실의 예방 또는 개선용 건강기능성식품에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화 촉진용 조성물{Composition for promoting differentiation of muscle cells containing Allium hookeri extract as effective component}
본 발명은 삼채(Allium hookeri) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
우리 몸의 근육은 뼈에 붙어 뼈를 보호하고 체형을 바르게 유지시켜 주는 등의 여러 가지 기능을 한다. 또한, 근육은 칼슘 유입을 촉진시켜 골 밀도를 높여 주기도 한다. 그러나 신체는 노화하면서 구성성분의 변화로 체지방과 체단백질의 재분포가 일어나며, 약 50세가 되면 근 세포 내 단백질의 합성속도가 분해속도보다 느려져 근육이 급격하게 퇴화를 시작하게 되며, 근육 감소 질환에 노출될 수 있다.
근육 감소 질환의 하나인 근육 감소증은 평소 자기 체질량의 약 13~24%가 감소한 상태를 말하는 것으로, 근육 감소증이 있으면 행동량이 현격하게 줄어 정신건강을 해칠 뿐만 아니라 생활의 만족도도 떨어지며, 용이한 일상생활에서도 쉽게 부상을 입고 심각한 중상에 이르기도 한다. 근육 감소증의 원인 중 하나는 노화가 진행됨에 따라 일어나는 골격근의 양과 질의 점진적 감소 및 부적절한 식이 에너지 섭취에 따른 지방과 체지방 성분을 포함하는 체중 감소 등을 원인으로 꼽을 수 있다.
전구세포(precursor cell)의 분열과 결정 과정을 통해 형성된 근아세포(myoblast)는 근세포(myocyte)로 분화하고, 인접한 세포들과 융합하여 근관세포(myotube)로 분화한다. 분화된 근관세포는 myofibril(근원섬유)를 형성하는 과정을 통해 근육이 형성된다. 근아세포의 일부는 줄기 위성세포(satellite cell)로서 정지 상태로 있다가, 근육조직이 외상 또는 근육위축병(muscular dystrophy)과 같은 질병에 노출되면, 위성세포로 알려진 근육 줄기세포들은 손상된 부위의 근육을 치유하고 재생시킨다. 근육위축병과 같은 질환에 있어서, 이들 세포들은 근육의 안정성과 치유에 있어 특히 중요하다.
한편, 삼채는 인삼, 마늘, 부추, 파 등을 합친 것 같은 달콤하고 쌉싸름하며 매운맛이 나는 채소로 뿌리부추라고 불리며 각종 성인병에 효과가 있다고 알려져 있다. 부추속(Allium) 식물로서 히말라야 해발 1400m 이상 초고랭지에서 자생하며, 중국, 인도, 부탄, 스리랑카, 미얀마 등에 분포하고 있다. 삼채는 파, 마늘처럼 쉽게 애용되는 채소로서 혈액순환을 좋게 하고 염증질환과 암질환 등에 약리효능이 있어 현지에서는 오랫동안 민간처방으로 이용되어왔다. 지금까지 알려진 삼채의 생리 활성은 DPPH 라디칼 소거능과 nitric oxide 생성 억제효과에 의한 항산화 및 항염증 등이 알려져 있다.
이와 같은 삼채 추출물 관련 기술로는 한국공개특허 제2015-0113709호에 삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0113687호에 삼채 추출물을 함유하는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화 촉진용 조성물은 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화 촉진용 조성물을 제공하고, 유효성분인 삼채 추출물은 항산화 활성이 우수하며, 근아세포의 생존율을 현저하게 증가시킬 뿐만 아니라, 근아세포가 근관세포로 분화하는 것을 촉진하며, 근 분화 관련 단백질의 발현량을 조절하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근아세포(myoblast)의 분화 촉진제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 근아세포 분화 촉진제를 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 근아세포 분화 촉진제를 유효성분으로 함유하는 근육증가 촉진 또는 노인성 근 손실의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 분화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 삼채 추출물이 항산화 활성이 우수하며, 근아세포의 생존율을 현저하게 증가시킬 뿐만 아니라, 근 분화 관련 단백질의 발현량을 조절하고, 근아세포가 근관세포로 분화하는 것을 촉진하는 효과가 있는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 삼채 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 삼채 추출물을 농도별로 처리하여 확인한 세포생존율 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 삼채 추출물을 C2C12 세포에 처리한 후, 면역 블롯 분석으로 근분화 촉진과 관련된 Myh3 단백질의 발현량 변화를 확인한 결과이다. Control(-)은 삼채 추출물을 처리하지 않은 대조군이다.
도 4는 본 발명에 따른 삼채 추출물을 근아세포에 처리한 후, 면역 블롯 분석으로 근분화 촉진과 관련된 Myh3 단백질 및 Pax7 단백질의 발현량 변화를 확인한 결과이다. Control(-)은 삼채 추출물을 처리하지 않은 대조군이다.
도 5는 본 발명에 따른 삼채 추출물을 근아세포에 처리하고 5일 동안 분화시킨 후, 성숙된 근관세포(myotube)의 형성을 확인한 결과이다.
본 발명은 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 근아세포(myoblast)의 분화 촉진제에 관한 것이다.
상기 삼채 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 건조 삼채 뿌리에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 원심분리하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 원심분리한 추출물을 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 삼채 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이고, 더욱더 바람직하게는 2~5배 첨가하는 것이다. 추출온도는 60~100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 15~120분인 것이 바람직하며, 20~40분이 더욱 바람직하고, 30분이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 단계(3)에서, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 근아세포 분화 촉진제를 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적으로 허용되는 어떠한 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 근육 내 투여, 점안 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 패치 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있고, 구체적으로 근육 내 투여의 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 근아세포 분화 촉진제를 유효성분으로 함유하는 근육증가 촉진 또는 노인성 근 손실의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물에 관한 것이다.
상기 건강기능성식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 삼채 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 삼채 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02~0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 삼채 추출물의 제조
본 발명에서 사용한 삼채(Allium hookeri) 추출물은 삼채 뿌리 100g에 대하여, 80℃의 증류수 300㎖에 30분 동안 침지한 후, 7000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 5배 농축 후, 동결건조하여 건조한 분말 형태의 삼채 추출물을 제조하였다. 이후, 본 발명의 실시예에서는 건조분말의 삼채 추출물을 물에 녹여 사용하였다.
실시예 2. 항산화 효능 평가
ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 어세이를 이용하여 삼채 추출물의 항산화 효능을 측정하였다.
2.4mM의 과황화칼륨(Potassium persulfate)과 7mM의 ABTS를 1:1 부피비로 혼합하고 24 시간 동안 실온에서 차광된 상태로 반응시켜 ABTS 자유 라디칼을 생성하였다. 그 후 ABTS 자유 라디칼을 증류수로 희석하여 650nm에서 흡광도가 0.7 부근이 되도록 ABTS 반응 용액을 제조하였다. 96웰 플레이트의 각 웰에 80㎕의 ABTS 반응 용액과 20㎕의 시료 혹은 증류수를 혼합하고, 4분 동안 차광된 상태로 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더로 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
항산화 활성은 하기 식(1)을 이용하여 계산하였다.
식(1)
ABTS 라디칼 소거능(%)={1-[(시료의 흡광도-시료 자체의 흡광도)/대조군의 흡광도]}×100
그 결과, 양성대조군인 레스베라트롤(resveratrol)의 농도 증가에 따른 항산화 효능을 확인함으로써, ABTS 어세이 시스템이 잘 구축된 것으로 판단하였고, 본 발명의 삼채 추출물이 농도 의존적으로 ABTS 라디칼을 소거하여 우수한 항산화 활성이 있다는 것을 확인하였다(도 1).
[세포 배양]
(1) C2C12 세포 배양
본 발명에서 사용된 C2C12 세포는 고려대학교 생명공학부에서 분양받아 사용하였다. C2C12 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Welgene, Korea)에 10% FBS(fetal bovine serum, Welgene, Korea)와 1% 항생제(100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, Welgene, Korea)를 첨가하여 배양하고, DMEM에 1% 말 혈청, 1% 항생제(100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)를 첨가한 분화 배지에서 분화를 유도하였다. 세포는 표준 세포 배양법인 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
(2) 근아세포 ( myoblast ) 배양
본 발명에서 사용된 myoblast는 생후 3일 된 C57BL/6의 뒷다리 골격근에서 분리하여 배양하였다. 상기 세포주는 Ham's F-10 영양 혼합(F-10) 배지에 10% 송아지 혈청(calf serum), 1% 항생제(100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신) 및 2.5㎍/㎖ 섬유모세포생장인자(fibroblast growth factor)를 첨가한 성장 배지에서 배양하였으며, DMEM에 1% 말 혈청 및 1% 항생제(100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)를 첨가한 분화 배지에서 분화를 유도하였다. 세포는 표준 세포 배양법인 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
실시예 3. 세포 생존율 확인
삼채 추출물이 C2C12 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl-2H-tetrazolium, inner salt) assay를 수행하였다.
96웰 플레이트에 C2C12 세포를 웰 당 5×103개의 세포를 분주한 후, 24시간 동안 배양하고, 각각의 웰에 대하여, 농도별 시료가 처리된 배지로 교환하고 다시 24시간 동안 배양하였다.
그 후 MTS 시약(Promega, USA)을 첨가하고 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices EMax Plus, USA)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 삼채 추출물을 처리하지 않은 대조군 대비 삼채 추출물을 처리한 군의 세포의 생존율을 백분율로 표시하여 상대적인 세포 생존율(%)을 분석하였다.
식(2)
세포 생존율(%)=[(삼채 추출물 첨가군의 흡광도-삼채 추출물 자체의 흡광도)/삼채 추출물을 처리하지 않은 대조군의 흡광도] × 100
삼채 추출물을 농도별로 24시간 동안 근아세포에 처리한 후 MTS 어세이를 수행한 결과, 삼채 추출물을 500㎍/㎖의 농도까지 처리하여도 세포 독성이 거의 나타나지 않는다는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 4. 면역블롯 분석( Immunoblot analysis)
삼채 추출물을 처리한 분화 배지에서 최대 7일 동안 분화시킨 C2C12 세포 및 근아세포(myoblast)를, 각각 일자별로 취하여 PBS로 세척한 후, 분해 완충용액(lysis buffer)[10mM Tris-HCl (pH 7.5), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 10% 글리세롤(glycerol), 1% Triton X-100]를 이용해 분해물(lysate)을 추출하였다. 로딩버퍼(Laemmi sample buffer)에 같은 양의 단백질 분해물(protein lysate)를 혼합하고, SDS-PAGE를 통해 단백질 분해물을 크기별로 분리하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시키고, 5%의 non-fat dry milk를 PBS-T에 녹인 블로킹 완충용액에 1시간 동안 처리하여 비특이적인 항체의 결합을 억제시켰다. 블로킹 완충용액에 희석한 1차 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리한 후, 단백질과 결합하지 않은 항체는 PBS-T로 세척하였다. Super Signal system을 이용하여 Horseradish peroxidase가 융합된 2차 항체에 결합하여 얻어진 신호를 확인하였으며, 1차 항체는 anti-Pax7(1:500), anti-Myh3(1:500) 및 anti-GAPDH(1:2000)를 이용하였다.
그 결과 도 3에 개시한 바와 같이, 125㎍/㎖의 삼채 열수추출물을 처리한 C2C12 세포를 5일 및 7일 동안 분화시킨 경우, 삼채 추출물을 처리하지 않은 경우에 대비하여 근분화 단백질 Myh3의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 4에 개시한 바와 같이 250㎍/㎖의 삼채 추출물을 처리하고 1일 동안 분화시킨 경우, 삼채 추출물의 처리 여부에 따른 분화 정도의 차이가 확인되지 않았으나, 3일 동안 분화시킨 근아세포(myoblast)의 경우, 삼채 추출물을 처리한 군에서의 Myh3 발현량이 증가하였고, Pax7의 발현량이 삼채 추출물을 처리하지 않은 것에 대비하여 감소하였다.
이와 같이, Pax7의 단백질의 발현이 감소하고, Myh3 단백질의 발현이 증가한 결과를 토대로, 삼채 추출물이 근아세포의 분화를 촉진하는 것으로 판단하였다.
실시예 5. 삼채 추출물의 처리에 따른 근아세포의 증식과 분화 확인
면역 형광 현미경 분석을 위해 6×104개의 근아세포를 챔버 슬라이드에 분주하고, 250㎍/㎖의 삼채 추출물을 처리한 분화 배지 250㎕를 상기 분주된 근아세포에 처리하고 분화시켰는데, 상기 배지는 이틀 간격으로 신선한 배지로 교환하면서 5일 동안 분화시켰다.
이후, 4% 파라포름알데히드를 이용하여 10분 동안 고정시키고 0.5% Triton X-100가 포함된 PBS를 15분 동안 처리하였다. 이후 비특이적인 항체 결합을 억제하기 위해 블로킹 완충용액(5% goat serum, 0.1% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)을 상온에서 1시간 동안 처리한 후 블로킹 완충용액에 1:250 희석한 anti-Myh3를 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. Mouse IgG에 대한 2차 항체로는 Alexa Fluor 488이 융합된 염소 항체를 1:500으로 희석해 사용하였고, 세포핵은 1:1000으로 희석한 DAPI로 염색하였다. LSM 510 Live Configuration Vario Two VRGB 공초점 레이저-스캐닝 현미경을 통해 면역 형광을 분석하고 이미지화하였다.
그 결과, 5일 동안 분화 배지로 분화를 유도한 근아세포에서의 Myh3 단백질 발현 양상이 250㎍/㎖의 삼채 추출물을 처리한 경우, 삼채 추출물을 처리하지 않은 대조군(control)에 대비하여 세포융합 현상이 일어나 근아세포(myoblast)에서 근관세포(myotube)로 분화가 더 많이 유도된 것을 확인할 수 있었다(도 5).

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 및 근육감소증(sarcopenia) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 노인성 근 손실의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20150113709A (ko) * 2014-03-31 2015-10-08 연세대학교 산학협력단 삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물
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KR20160148886A (ko) * 2015-06-17 2016-12-27 연세대학교 산학협력단 삼채 추출물을 함유하는 운동수행능력 향상용 조성물

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