KR20190070844A - 마늘 추출 분획물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

마늘 추출 분획물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환 치료 및 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마늘 추출물로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것이다.
그러므로, 본원 발명자들은 근육관련 질환의 예방 및 치료의 목적에 활용할 수 있는 활성이 강화된 천연물 신약 또는 건강기능식품 소재로서의 개발 가능성을 높이고자 기본원 발명의 6 가지 제조방법을 사용하여 얻은 마늘 추출물 (실험예 1)을 대상으로 (1) 근원세포 분화 효능 평가를 위해, 분화된 C2C12 세포에서 MHC 발현 정도를 웨스턴 블롯팅 분석한 결과, 본원 발명자가 이미 특허 출원한 아조엔 함량이 강화된 추출법 (한국 특허등록 제 10-1242580호)과 가장 유사하게 추출한 EW 추출 분획물을 가장 강력한 MHC 발현 분획 추출물로 확인하였으며 (실험예 2), (2) 본 발명의 EW 추출 분획물에 의해 MHC, myoD의 발현 증가와 더불어 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로의 분화가 농도의존적으로 유도되었음을 확인하였다 (실험예 3). 또한 본 발명의 아조엔에 의해 (3) MHC의 발현과 실린더 형 다핵성 근관세포 형성이 증가됨을 확인하였고 (실험예 4), (4) 근원세포 분화 시 증가하는 myoD 와 미오게닌 발현 증가와 p38 MAPK 신호전달계가 활성화됨을 확인하였으며 (실험예 5), (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육 소실 시험관 내 (in vitro) 실험 모델에서 본 발명의 아조엔에 의한 근육 분화 인자인 MHC와 myoD의 발현이 회복됨을 증명하여 아조엔에 의한 근육 재생 능력을 확인하였으며 (실험예 6) (6) CT-26 대장암 세포주를 BALB/c 마우스에 피하주사하여 암 악액질(cachexia)을 유도한 동물실험 모델 (in vivo)에서도 본 발명의 EW 추출 분획물이 암에 의한 근 소실을 억제함을 확인하였다 (실험예 7).
상기 실험 결과는 본 발명의 마늘 추출물, 이로부터 분리된 화합물이 근육 질환 치료제 또는 보조제로 사용 가능함을 확인함으로써, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

마늘 추출 분획물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환 치료 및 예방용 조성물 {A composition comprising the compounds isolated from an extract of Allium sativum L. for treating and preventing muscle-related disorder}
본 발명은 마늘 추출 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
[문헌 1] J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197
[문헌 2] Pharmacol .Res . 2015, 99, 86
[문헌 3] The Korea Journal of Sports Science. 2011, 30, 1551
[문헌 4] Mech . Ageing Dev . 2010, 13, 202
[문헌 5] Cell Mol . Life Sci .2013, 70, 4117
[문헌 6] Brain Dev . 2013, 35, 349
[문헌 7] J. Biol . Chem . 2002, 277, 49831
[문헌 8] Food Chemistry 2016, 211, 41
[문헌 9] J. Med . Food, 2012, 15, 992
[문헌 10] Bioorg . Med . Chem . Lett . 2017, 15, 27
[문헌 11] Chem . Biol . Interact. 2016, 248, 60
[문헌 12] Mol . Biol . Cell. 2010, 21, 2399
[문헌 13] Trends Cell. Biol. 2006, 16, 36
[문헌 14] Int . J. Mol . Med. 2015, 36, 1073
[문헌 15] Sci Rep. 2016, 11, 24214
[문헌 16] J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2014, 5, 321
본 발명은 마늘 추출 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
근육재생(Muscle regeneration)은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)과 같은 골격근 퇴행 질환을 극복하는 목적으로 주목되어 왔다. (1. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015, 6, 197)
근육의 진행성 약화 및 기능 소실은 삶의 질을 위협하고 암환자의 생존율을 저하시킨다. 암환자 중 30% 이상이 근육 소실에 의한 체중 감소로 인하여 사망한다. 이러한 근육 기능 소실은 미오-단백질(myo-proteins) 변성 및 근섬유의 단면적(muscle fiber cross-sectional area), 근 강도(muscle strength), 근섬유 숫자(nuclear number of myofibers) 및 인슐린 반응성(insulin responsiveness) 감소 등을 공통적으로 동반한다.
암 이외에도 근육 손실은 노화의 진행과 다양한 만성 질환에 의해서도 야기될 수 있다. 노화가 진행됨에 따라, 새롭게 생성되는 골격근의 일부가 섬유 조직으로 대체되면서 인체의 골격 근육량 및 강도가 감소하는 근육감소증이 나타난다. 또한, 고혈압, 내당능 장애 (impaired glucose tolerance) 및 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성 경화증 및 심혈관 질환 등 연령이 증가할수록 발병률이 증가하는 만성 질환에서도 근육 손실이 나타난다. (2. Pharmacol Res. 2015, 99, 86).
근육 퇴행증치료 전략은 염증성 분자 및 미오스타틴(myostatin)의 억제 또는 시클릭 AMP, PGC (proliferator-activated receptor gamma coactivator)-1α 및 인슐린 신호 전달계의 활성화 등이 있다. 다수의 잠재적 약물들이 개발되었음에도 불구하고, 미국 식약청에서 승인된 근위축증 치료제로는 메게스테롤 아세테이트(megestrol acetate)가 유일하다. 근육퇴행증 치료 및 예방을 위한 약물들은 근육 단백질 이화작용(protein catabolism)을 저해하거나 또는 위성세포(satellite cell) 기능을 증진시키는 활성을 나타낸다. (2. Pharmacol. Res. 2015, 99, 86).
근육에서는 동화작용과 이화작용이 균형을 이루며 근육 생성을 조절하는데, 이 때 근육 세포 내에서는 이와 관련하여 여러 생체 신호전달 과정이 조절된다. 근육 단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 활성화될 경우, 근육 단백질의 합성이 증가되어 근육 크기 증가(hypertrophy, 근비대)나 근섬유 수 증가 (hyperplasia)를 유도하여 과도한 근육 생성을 초래한다 (3. The Korea Journal of Sports Science. 2011, 30, 1551).
근육 생성 유도 인자들은 근세포 내에서 PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)/Akt 경로를 활성화 시키고 그에 따라 하위 단계의 단백질을 인산화함으로써 근육 단백질 합성을 유도한다. 이 중 PI3K/Akt 신호전달에 의한 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 활성은 세포 내에서 다양한 성장 신호를 통합하는 중심 성장신호전달 기전으로 인정되고 있다. mTOR가 활성화되면 두 개의 하위 타겟인 4EBP1(4E-binding protein)과 p70S6K (phosphorylated 70-kDa ribosomal S6 kinase)이 활성화됨으로써, 근육 단백질 합성이 유도되어 근육량이 증가한다 (3. The Korea Journal of Sports Science. 2011, 30, 1551; 4. Mech Ageing Dev. 2010, 13, 202).
mTOR 외에도 근원세포의 분화와 근육 형성은 다양한 인자들에 의해 조절된다 (5. Cell Mol Life Sci . 2013, 70, 4117). 그 중, myoD는 근육 분화와 관련된 특이적 유전자의 발현을 개시하여, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 근원세포(myoblast)로 분화하는 것을 유도한다. MyoD에 의해 조절되는 미오게닌과 MHC(myosin heavy chain)는 근원세포의 융합(fusion)을 유도하여, 근관세포 (myotube)와 근섬유가 형성되도록 한다. 이 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다 (5. Cell Mol Life Sci 2013, 70, 4117; 6. Brain Dev. 2013, 35, 349)
정상 조건 하에서 원시 줄기세포로서의 휴지상태의 위성세포는 연속적으로 증식 및 분화를 진행한다. 손상된 근육은 근원세포로 지칭되는 근원성 위성세포 증식을 활성화하는 다양한 성장인자를 분비한다. 활성화된 근원세포는 Myo D, Myf(myogenic factor)-5, 미오게닌 및 Mrf-4 과 같은 근원성 인자 (myogenic factor)를 유도한다. MyoD 및 Myf-5는 근원세포 계열에 특이적으로 발현되는 전사 인자로써, 근원세포 분화 개시에 중요한 역할을 수행한다. (7. J. Biol . Chem. 2002, 277, 49831). 특히, Myo D는 E 단백질, Mef-2 계열 단백질 및 전사 보조인자 등의 비근육성 특이 인자들과의 결합을 통하여 MHC 및 미오게닌과 같은 근원성 단백질 발현을 유도한다.
마늘(Allium sativum L.)은 여러해살이 외떡잎식물, 백합목 백합과 부추속에 속하는 매우 중요한 식용 작물 중 하나로서 대한민국에서는 1 인당 가장 많이 소비되는 작물 중 하나이며, 삼척, 의성, 남해, 창녕, 고흥, 단양의 마늘과 사천 등에서 대량 재배된다. 주로 땅 속의 비늘 줄기(마늘쪽)를 요리에 사용하며, 잎과 줄기를 먹을 수 있다. 마늘 특유의 자극적 냄새는 알린, 아조엔, 알리신 등의 황화합물 성분에 의하는데, 이러한 마늘 특유의 화합물들은 항암, 항당뇨, 항염증, 항균, 항산화 효과를 가지며 면역 활성과 혈관질환 예방에 유용한 것으로 널리 알려져 있다 (8. Food Chemistry 2016, 211, 41).
본원 발명자들은 아조엔 함량이 강화된 마늘 추출법을 제조하는 제조방법을 발명하여 특허를 둥록하였다 (한국 특허등록 제 10-1242580호).
그러나, 상기 문헌의 어디에도 마늘 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 치료 효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.
그러므로, 본원 발명자들은 근육관련 질환의 예방 및 치료의 목적에 활용할 수 있는 활성이 강화된 천연물 신약 또는 건강기능식품 소재로서의 개발 가능성을 높이고자 기본원 발명의 6 가지 다른 제조방법을 사용하여 얻은 마늘 추출물 (실험예 1)을 대상으로 (1) 근원세포 분화 효능 평가를 위해, 분화된 C2C12 세포에서 MHC 발현 정도를 웨스턴 블롯팅 분석한 결과, 본원 발명자가 이미 특허 출원한 아조엔 함량이 강화된 추출법 (한국 특허등록 제 10-1242580호)과 가장 유사하게 추출한 EW추출 분획물을 가장 강력한 MHC 발현 분획 추출물로 확인하였으며 (실험예 2), (2) 본 발명의 EW추출 분획물에 의해 MHC, myoD의 발현 증가와 더불어 실린더 형 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로의 분화가 농도의존적으로 유도되었음을 확인하였다 (실험예 3).
또한 본 발명의 아조엔에 의해 (3) MHC의 발현과 실린더 형 다핵성 근관세포 형성이 증가됨을 확인하였고 (실험예 4), (4) 근원세포 분화 시 증가하는 myoD 와 미오게닌 발현 증가와 p38 MAPK 신호전달계가 활성화됨을 확인하였으며 (실험예 5), (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육 소실 시험관 내 (in vitro) 실험 모델에서 본 발명의 아조엔에 의한 근육 분화 인자인 MHC와 myoD의 발현이 회복됨을 증명하여 아조엔에 의한 근육 재생 능력을 확인하였다 (실험예 6). 더 나아가 본 발명의 EW추출 분획물에 의해 (6) CT-26 대장암 세포주를 BALB/c 마우스에 피하 주사하여 암 악액질(cachexia)을 유도한 동물실험 모델(in vivo)에서, 근 소실이 억제되었음을 확인하였다 (실험예 7).
이러한 결과를 종합하여 본 발명의 마늘 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 근육관련 질환에 탁월한 치료효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 과제는 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 마늘은 (Allium sativum L)의 비늘 줄기 (마늘쪽), 줄기 또는 열매, 바람직하게는 비늘 줄기(마늘쪽)를 포함함을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 마늘 추출 분획물은 (1) EW 추출 분획물, (2) WE 추출 분획물, (3) WH 추출 분획물, (4) WB 추출 분획물, (5) WW 추출 분획물 또는 (6) ME 추출 분획물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 EW 추출 분획물은 마늘의 껍질을 제거한 뒤 으깨는 제 1단계; 으깬 마늘을 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 바람직하게는 28 내지 33℃ 수욕상에서 1 분 내지 60분, 바람직하게는 3 분 내지 30분, 바람직하게는 5 분 내지 20분마다 저어주며 20분 내지 6시간, 바람직하게는 30분 내지 2시간, 바람직하게는 45 분 내지 80분 동안 가온 처리하는 제 2단계; 가온처리된 상기 2단계의 마늘에 마늘 중량의 1 내지 10배(w/w), 바람직하게는 1 내지 5배(w/w), 보다 바람직하게는 1 내지 3배(w/w) 중량의 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 메틸렌클로리드로부터 선택된 비극성 용매, 바람직하게는, 에틸아세테이트 용매를 가한 후 10 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50 내지 70℃에서 20분 내지 6시간, 바람직하게는 30분 내지 2시간, 바람직하게는 45 분 내지 80분 동안 추출하여 비극성용매 가용분획을 얻는 제 3단계; 3단계의 비극성용매 가용분획에 물을 가하여 반복적으로 분획하여 물층을 제거하고 에틸아세테이트 층을 농축 및 건조하는 제 4단계 공정을 통하여, Z-아조엔 5 내지 30%(w/w) 및 E-아조엔 1 내지 10%(w/w), 바람직하게는, Z-아조엔 8 내지 15%(w/w) 및 E-아조엔 1 내지 5%(w/w), 보다 바람직하게는, Z-아조엔 10 내지 13%(w/w) 및 E-아조엔 1 내지 4%(w/w)를 주성분으로 함유하는 본 발명의 “EW 추출 분획물”을 수득가능하다.
본원에서 정의되는 WE 추출 분획물, WH 추출 분획물, 및 WB 추출 분획물은 마늘(Allium sativum, 경북 의성군)의 껍질을 제거한 뒤 으깨는 제 1단계; 으깬 마늘을 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 바람직하게는 28 내지 33℃ 수욕상에서 1 분 내지 60분, 바람직하게는 3 분 내지 30분, 바람직하게는 5 분 내지 20분마다 저어주며 20분 내지 6시간, 바람직하게는 30분 내지 2시간, 바람직하게는 45 분 내지 80분 동안 가온 처리하는 제 2단계; 가온처리된 상기 2단계의 마늘에 마늘 중량의 1 내지 10배(w/w), 바람직하게는 1 내지 5배(w/w), 보다 바람직하게는 1 내지 3배(w/w) 중량의 물을 가한 후 10 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50 내지 70℃에서 20분 내지 6시간, 바람직하게는 30분 내지 2시간, 바람직하게는 45 분 내지 80분 동안 추출하여 물 추출 분획물을 얻는 제 3단계; 3단계의 물 추출 분획물에 동일 부피의 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 헥산로부터 선택된 비극성 용매 또는 부탄올 용매를 가하여 각각 분획하고, 각 분획물을 여과 농축 및 건조하는 제 4단계 공정을 통하여 본 발명의 WE 추출 분획물, WH 추출 분획물, 및 WB 추출 분획물을 각각 수득가능하다.
본원에서 정의되는 WW 추출 분획물은 마늘의 껍질을 제거한 뒤 으깨는 제 1단계; 으깬 마늘을 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 바람직하게는 28 내지 33℃ 수욕상에서 1 분 내지 60분, 바람직하게는 3 분 내지 30분, 바람직하게는 5 분 내지 20분마다 저어주며 20분 내지 6시간, 바람직하게는 30분 내지 2시간, 바람직하게는 45 분 내지 80분 동안 가온 처리하는 제 2단계; 가온처리된 상기 2단계의 마늘에 마늘 중량의 1 내지 10배(w/w), 바람직하게는 1 내지 5배(w/w), 보다 바람직하게는 1 내지 3배(w/w) 중량의 물을 가한 후 10 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50 내지 70℃에서 20분 내지 6시간, 바람직하게는 30분 내지 2시간, 바람직하게는 45 분 내지 80분 동안 추출하여 물추출물을 얻는 제 3단계; 3단계의 물 추출물을 농축 및 건조하는 제 4단계 공정을 통하여 본 발명의 “WW 추출 분획물”을 수득가능하다.
본원에서 정의되는 ME 추출 분획물은 마늘의 껍질을 제거한 뒤 으깨는 제 1단계; 으깬 마늘을 마이크로웨이브 오븐에 넣고 1 분 내지 10분, 바람직하게는 1 분 내지 5분 동안 초음파 처리하여 초음파 처리 마늘을 수득하는 제 2단계; 제 2단계의 초음파 처리 마늘 중량의 중량의 1 내지 10배(w/w), 바람직하게는 1 내지 5배(w/w), 보다 바람직하게는 1 내지 3배(w/w) 중량의 중량의 물을 가한 후, 1 내지 10배(w/w), 바람직하게는 1 내지 5배(w/w), 보다 바람직하게는 1 내지 3배(w/w) 중량의 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매, 보다 더 바람직하게는, 에틸아세테이트 용매를 추가로 가하고 분획하여 비극성용매 가용분획물을 수득하는 제 3단계; 제 3단계의 비극성용매 가용분획물을 농축 및 건조하는 제 4단계 공정을 통하여 본 발명의 “ME 추출 분획물”을 수득가능하다.
따라서, 본 발명은 상기한 (1) EW추출 분획물, (2) WE추출 분획물, (3) WH 추출 분획물, (4) WB추출 분획물, (5) WW추출 분획물 또는 (6) ME 추출 분획물의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명의 화합물들은 상기 (1) EW추출 분획물을 대상으로 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물들 즉, Z- 또는 E-아조엔을 각각 정제 및 수득하거나, 일반 상업적 회사 (시그마 사 등)로부터 용이하게 입수가능하다.
본원에서 정의되는 마늘 추출물로부터 분리된 화합물은 Z-아조엔, E-아조엔 또는 이의 구조이성체 혼합물, 바람직하게는 Z-아조엔임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 근육관련 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육질환, 구체적으로, 노인성근위축 또는 암으로 인한 근육관련 질환, 보다 구체적으로는, 노인성근위축 또는 암으로 인한 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia), 노인성근육감소증(sarcopenia) 및 근육소실증을 포함한다.
또한 본 발명은 마늘 추출물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암으로 인한 근육관련 질환의 예방 및 치료제 또는 항암 보조 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 마늘 추출물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 마늘 추출물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암에 의한 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 항암치료 보조제 또는 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 기존 항암제는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메토트랙세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 무스틴(Mustine), 비크리스틴(vincristine), 프로카바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드 (etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 시스풀라틴(cisplatin), 카페시타빈(capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등을 포함한다.
본원에서 정의되는 암질환는 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암(=결장암), 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암), 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST, 기스트), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암, 혈액암 등을 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 마늘 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.
예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 추출물을 대상으로 (1) 6 가지 마늘 추출물(실험예 1)의 근원세포 분화 효능 평가를 위해, 분화된 C2C12 세포에서 MHC 발현 정도를 웨스턴 블롯팅 분석한 결과, 본원 발명자가 이미 특허 등록한 아조엔 함량이 강화된 추출법 (한국 특허등록 제 10-1242580호)과 가장 유사하게 추출한 EW 추출 분획물을 가장 강력한 MHC 발현 분획 추출물로 확인하였으며 (실험예 2), (2) 본 발명의 EW추출 분획물에 의해 MHC, myoD의 발현 증가와 더불어 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로의 분화가 농도의존적으로 유도되었음을 확인하였다 (실험예 3). 또한 본 발명의 아조엔은 (3) MHC의 발현과 실린더 형 다핵성 근관세포 형성을 증가시킴을 확인하였고 (실험예 4), (4) 근원세포 분화 시 증가하는 myoD 와 미오게닌 발현 증가와 p38 MAPK 신호전달계가 화합물에 의해 활성화됨을 확인하였으며 (실험예 5), (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육 소실 생체 내 (시험관 내) (in vitro) 실험 모델에서 본 발명의 아조엔에 의해 MHC와 myoD의 발현을 회복하여, 근육 재생 능력이 있음을 확인하였고 (실험에 6), (6) CT-26 대장암 세포주를 BALB/c 마우스에 피하주사하여 암 악액질을 유도한 동물실험 모델(in vivo)에서 본 발명의 EW추출 분획물 섭취에 의한 근 소실 억제 효과를 확인하였다 (실험예 7). 이로써, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물 또는 화합물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 분획물 또는 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 분획물 또는 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 분획물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 분획물 또는 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 마우스, 생마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 노인성근위축증 또는 악액질 치료제를 제공하며, 이러한 치료제는 노인성근위축증 또는 악액질의 병용요법에서 체중 변화나 식욕 회복의 개선 효과를 위한 것으로서, 악액질 치료에서 항암제 단독투여보다는 본 발명의 조성물을 이용한 병용요법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물 또는 화합물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.
더욱이, 본 발명의 조성물은 근육관련 질환의 치료 및 개선을 목적으로 한 건강식품일 수 있다.
또한, 근육관련 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또한, 본 발명은 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 분획물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.
또한, 본 발명은 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 분획물 또는 화합물을 식품첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 분획물 또는 화합물은 목적 질환이 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 분획물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 마늘 추출 분획물, 이로부터 분리된 화합물을 대상으로 (1) 6 가지 마늘 추출물의 (EW, WE, WH, WB, WW, ME (실험예 1) 근원세포 분화 효능 평가를 위해, 분화된 C2C12 세포에서 MHC 발현 정도를 웨스턴 블롯팅 분석한 결과, 본원 발명자이 이미 특허 출원한 아조엔 함량이 강화된 추출법과 가장 유사하게 추출한 EW추출 분획물을 가장 강력한 MHC 발현 분획 추출물로 확인하였으며 (실험예 2), (2) 본 발명의 EW추출 분획물에 의해 MHC, myoD의 발현 증가와 더불어 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)로의 분화가 농도의존적으로 유도되었음을 확인하였다 (실험예 3). 또한 본 발명의 마늘 성분인 아조엔은 (3) MHC의 발현과 실린더 형 다핵성 근관세포 형성을 증가시킴을 확인하였고 (실험예 4), (4) 근원세포 분화 시 증가하는 myoD 와 미오게닌 발현 증가와 p38 MAPK 신호전달계가 화합물에 의해 활성화됨을 확인하였으며 (실험예 5), (5) CT-26 대장암 세포주의 배양액을 이용한 근육 소실 생체 내 (시험관 내) (in vitro) 실험 모델에서 본 발명의 아조앤에 의해 MHC와 myoD의 발현을 회복하였으며 (실험예 6), (6) CT-26 대장암 세포주를 BALB/c 마우스에 피하주사하여 암 악액질(cachexia)을 유도한 동물실험 모델(in vivo)에서도 본 발명의 EW추출 분획물의 투여에 의해 암에 의한 근 소실을 억제시킴을 증명하여 (실험예 7) 근육 재생 능력이 있음을 확인함으로써, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다. 이러한 상기 실험 결과는 본 발명의 추출물 및 화합물들이 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia) 등의 근육 질환 치료제 또는 보조제로 사용 가능함을 확인함으로써, 상기 조성물을 근육질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용함을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 마늘 추출 분획물은 (1) EW 추출 분획물, (2) WE 추출 분획물, (3) WH 추출 분획물, (4) WB 추출 분획물, (5) WW 추출 분획물 또는 (6) ME 추출 분획물을 수득하는 과정을 나타낸 도이며;
도 2은 본 발명의 6 가지 마늘 추출 분획물들이 MHC (myosin heavy chain) 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 3는 본 발명 추출물에 포함되어 있는 화합물의 함량을 구하기 위한 HPLC 크로마토그램을 나타내는 도이며;
도 4A는 본 발명의 EW 추출 분획물이 MHC와 myoD 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 4B는 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 5A는 본 발명의 아조엔의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 5B는 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 6A는 본 발명 아조엔의 처리 시간에 따른 MHC, myoD와 미오게닌 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 6B는 p38 MAP 키나제(kinase) 신호전달계 활성화에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 7는 마우스 대장암 세포주 배양액을 분화된 근관세포에 처리하여 근육 손실을 유도한 모델에서, 아조엔에 의한 근육 재생능력을 나타낸 도이다. 도 7A는 본 발명 아조엔의 MHC과 myoD 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 7B는 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 마우스 대장암 세포주를 BALB/c 마우스에 피하주사하여 암 악액질(cachexia)을 유도한 동물실험 모델에서, 본 발명 EW 추출 분획물 투여에 의한 근육 소실 억제 효과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 마늘 추출 분획물(EW)의 제조(도 1 참조)
- 마늘(Allium sativum, 경북 의성군)의 껍질을 제거한 뒤 으깨어 31℃ 수욕상에서 10 분마다 저어주며 1 시간 동안 처리하였다. 둥근바닥플라스크(100ml, HOREX, 삼신글라스)에 상기 으깬 마늘 50 g을 넣고 에틸아세테이트 50ml를 가한 후 60℃에서 1 시간 동안 추출하고, 물을 가하여 분획한 후 에틸아세테이트 층을 농축 및 건조하여 EW 추출물(100mg)을 수득하였다.
실시예 2. 마늘 추출 분획물(WE, WH, WB)들의 제조(도 1 참조)
- 마늘(Allium sativum, 경북 의성군)의 껍질을 제거한 뒤 으깨어 31℃ 수욕상에서 10 분마다 저어주며 1 시간 동안 처리하였다. 3개의 둥근바닥플라스크(100ml, HOREX, 삼신글라스)에 상기 으깬 마늘 50 g을 각각 넣고 물 50ml을 가하여 60℃에서 1 시간 동안 추출한 다음, 에틸아세테이트 50ml, 헥산 50ml, 부탄올 50ml을 각각 플라스크에 가한 후 분획하여, 에틸아세테이트층, 헥산층, 부탄올층을 농축하여 각각 WE 추출물 (30mg), WH 추출물 (40mg), 및 WB 추출물 (20mg)을 각각 수득하였다.
실시예 3. 마늘 추출 분획물(WW)의 제조(도 1 참조)
- 마늘(Allium sativum, 경북 의성군)의 껍질을 제거한 뒤 으깨어 31℃ 수욕상에서 10 분마다 저어주며 1 시간 동안 처리하였다. 둥근바닥플라스크(100ml, HOREX, 삼신글라스)에 상기 으깬 마늘 50 g을 넣고 물 50ml을 가하여 60℃에서 1 시간 동안 추출한 다음 여과하고 물층을 농축하여 WW 추출물 (1.65g)을 수득하였다.
실시예 4. 마늘 추출 분획물(ME)의 제조(도 1 참조)
- 마늘(Allium sativum, 경북 의성군)의 껍질을 제거한 뒤 으깨어 31℃ 수욕상에서 10 분마다 저어주며 1 시간 동안 처리하였다. 둥근바닥플라스크(100ml, HOREX, 삼신글라스)에 상기 으깬 마늘 50 g을 마이크로웨이브 오븐(MW202LW, LG전자)에 넣고 3분 동안 처리한 다음에 에틸아세테이트 50ml와 물 50ml을 넣고 분획하여 에틸아세테이트 층을 농축하여 ME 추출물 (20mg)을 수득하였다.
실시예 5. 마늘로부터 아조엔의 분리
본 발명의Z-아조엔, E-아조엔은 하기와 같이 분리 정제할 수 있다. 마늘 (1 kg)을 세척 및 세절 후 실시예 1과 동일한 방법으로 EW 추출분획물 (2.1 g)을 수득한다. 위 분획물을 실리카컬럼 상에서 헥산(A 용매)과 10% 이소프로파놀 함유 에틸아세테이트(B 용매)를 이동상으로 하여 10:1부터 1:1 까지 기울기 용리하여 4번째 컬럼분획에서 Z- 아조엔(120 mg)을, 6번째 분획에서 E-아조엔(56 mg)을 각각 분리하여 문헌에 기재된 물성치와 비교하여 동정하였고, 각각 하기 실험예 시료로 사용하였다.(9. J. Med. Food, 2012, 15, 992).
[화학식 1]
Figure pat00001
Z-아조엔
물성치: 1H-NMR (CDCl3); δ6.55 (H-6, d, J=9.6 Hz), δ5.8 (H-2 and H-8, m), δ5.7(H-5, m), δ5.4(H-1, m), δ5.12(H-9, m), δ3.57(H-3 and H-4, m), δ3.39(H-7, m).
[화학식 2]
Figure pat00002
E-아조엔
물성치: 1H-NMR (CDCl3); δ6.54(H-6, d, J=14.8 Hz ), δ5.59(H-2, 5 and 8,m), δ5.49(H-1, m), δ5.18(H-9, m), δ3.91(H-4, d, J=7.6Hz), δ3.82(H-3, d, J=7.2Hz), δ3.40(H-7, d, J=7.2Hz).
실험예 1. 성분 분석
상기 실시예 1에서 얻은 마늘 추출물들의 성분 분석을 위해 실시한 HPLC 조건은 다음과 같다.
HPLC 컬럼은 Waters Spherisorb Silica(4.6 × 250 mm, 5 mm)를 사용하였으며, 이동상은 n-Hexane/EtOAc/i-PrOH=67:30:3을 사용하고 유속은 1.0 ㎖/min, UV 254 nm에서 검출하였다. 순수하게 분리한 Z-아조엔과 E-아조엔 표준품을 이용하여 검량선을 제작하여 아조엔 함량을 정량하였다.
EW 추출 분획물 45mg을 정량한 결과, Z-아조엔은 5.04 mg, E-아조엔은 1.37mg이 함유된 것으로 분석되었고, 이는 최종 EW 추출 분획물 중 Z-아조엔 11.2%, E-아조엔 3.0% 함유하는 것으로 확인되었다 (표 1, 도 3).
EW 추출 분획물 중 아조엔의 함량 (도 3)
EW 추출 분획물 (45mg)
Z-아조엔 E-아조엔
함량 (mg) 5.04 1.37
EW 추출 분획물 중 함량(%) 11.2 3.0
실험예 2. 마늘 추출물들의 근원세포 분화 ( myoblast differentiation) 촉진 효능 평가
상기 실시예의 마늘 추출물들의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 참고문헌을 토대로, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 추출물 1 μg/ml 씩 처리하여 근원세포 분화의 마커인 MHC 발현량을 통해 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하였다 (10. Bioorg Med Chem Lett. 2017, 15, 27).
2-1. 실험 과정
C2C12 근원세포 (Cat# CRL-1771, ATCC)에 마늘 6 가지 추출물들 (1 μg/ml)을 처리하여 분화 배지 (differentiation medium, 2% horse serum-containing DMEM, Cat# 11965-084, Gibco)상에서 3일간 처리하면서 분화를 유도하였다.
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 각 시료를 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC를 4°C에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
2-2. 실험 결과 (표 2, 도2)
도 2에서는 6 가지 마늘 추출물들 (EW, WE, WH, WB, WW, ME)에 의한 MHC 발현에 대한 효과를 측정하였다. 근원세포의 분화 배지에 1 μg/ml의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군 세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 6 가지 마늘 추출물들 (EW, WE, WH, WB, WW, ME)을 처리하였을 때 각각 2.2, 0.2, 0.5, 0.7, 0.2, 0.2배 각각 증가하였다 (표 2).
마늘 추출물들에 의한 MHC 발현 증가활성 (도 2)
마늘 추출물 [1 μg/ml]
마늘 추출물 0 EW WE WH WB WW ME
MHC/pan-cadherin 발현 (배) 1.0 2.2 0.2 0.5 0.7 0.2 0.2
실험예 3. EW 추출 분획물의 근원세포 분화 ( myoblast differentiation) 촉진 효능 평가
상기 실시예의 EW 추출 분획물의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 참고문헌을 토대로, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 EW 추출 분획물을 0, 0.01, 0.1, 1 μg/ml 처리하여 근원세포 분화의 마커인 MHC와 myoD 발현량을 통해 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하였다.
각각의 시료를 첨가하여 분화된 세포에서 세포 용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법을 통해 MHC의 단백질 발현 수준을 평가하였으며 (도 4A), 마우스 항(mouse anti)-MHC 및 형광 물질에 결합된 마우스 항체로 (anti-mouse IgG2b Alexa-fluor 568) 면역 염색법을 수행하여 근관세포에서 EW 추출 분획물에 의한 MHC 발현 변화를 평가하였다 (도 4B) (11. Chem . Biol . Interact. 2016, 248, 60).
3-1. 실험 과정
C2C12 근원세포 (Cat# CRL-1771, ATCC)에 EW 추출 분획물 (0, 0.01, 0.1, 1 μg/ml)을 처리하여 분화 배지 (differentiation medium, 2% horse serum-containing DMEM, Cat# 11965-084, Gibco)상에서 3일간 처리하면서 분화를 유도하였다.
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위해 약 3 X 104 의 근원세포를 60 mm 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 분화 배지에 각 시료를 첨가하여 3 일간 분화시킨 후, 세포 용해 버퍼로 (lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany) 단백질 추출물을 얻고 25 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electorphoresis (PAGE)를 실시하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes로 이동시켰다. 이 블롯에 일차 마우스 항-MHC 또는 항-myoD를 4 °C에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC와 myoD 단백질량을 분석하였다. 이 때 적재 대조군(loading control)으로 pan-cadherin(Cat# 3678, Sigma)을 사용하였다.
위와 같은 방법으로 각각의 시료를 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜, 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각의 분화 배지를 제거하고, 인산완충 생리식염수로 2회 세척 후, 4% paraformaldehyde로 20 분간 고정하였다. 다시 인산완충 생리식염수로 2회 세척하고, 0.1% tritonX-100에 20 분간 처리하였다. 인산 완충 생리식염수로 2회 세척하고, 5% 말 혈청 용액에서 블로킹한 후, 마우스 항-MHC (MAB4470, R&D systems)을 넣고 12 시간 동안 4°C에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 세척한 후 Alexa Flouor 568-결합된 2차 항 마우스 (A-21144, MicoProbes)와 DAPI (D9542, Sigma)를 이용하여 MHC 발현을 분석하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다.
3-2. 실험 결과 (표 3, 4 및 도 4)
도 4A에서는 EW 추출 분획물에 의한 MHC와 myoD 발현에 대한 효과를 측정하였다. 근원세포의 분화 배지에 0, 0.01, 0.1, 1 μg/ml의 농도로 처리하여 근관섬유로 3 일간 분화시키고 세포를 수확하여, 근관섬유로의 분화 마커인 MHC와 myoD의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다.
분석 결과, 대조군 세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때 EW 추출 분획물을 처리하였을 때는 농도에 따라 1.7, 1.9, 그리고 2.0배 각각 증가하였으며, myoD의 경우, 1.2, 1.4, 그리고 2.6배 각각 증가하였다.
도 4B에서는, 항(anti)-MHC 항체(antibodies) 및 DAPI를 이용한 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 EW 추출 분획물의 근육분화 활성을 측정하였다. 증가된 적색형광(red-fluorescence)은 EW 추출 분획물이 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 농도 의존적으로 촉진함을 의미하며, DAPI 염색(counter staining)을 통해서는 MHC가 발현되는 실린더 형(cylinder-shaped) 근관세포가 다핵성(multinucleated)임을 확인할 수 있었다.
상기 실험에서 EW 추출 분획물은 농도 의존적으로, 근관세포에서의 MHC, myoD 발현과 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes)의 수를 증가시킴을 알 수 있었으며 근육 세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다 (표 3, 4 및 도 4).
EW 추출 분획물에 의한 MHC, myoD 발현 증가활성 (도 4A)
EW 추출 분획물
농도 [μg/ml] 0 0.01 0.1 1
MHC /pan-cadherin 발현 (배) 1 1.7 1.9 2.0
myoD /pan-cadherin 발현 (배) 1 1.2 1.4 2.6
EW 추출 분획물에 의한 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 증가활성 (도 4B)
EW 추출 분획물
농도 [μg/ml] 0 0.1 1
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며 MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1.0 2.5 4.1
실험예 4. 아조엔의 근원세포 분화 ( myoblast differentiation) 촉진 효능 평가
상기 실시예의 아조엔의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 참고문헌을 토대로, 마우스 근원세포주인 C2C12 세포에 EW 추출 분획물로부터 분리된 아조엔을 0, 0.1, 1, 10, 그리고 100 nM의 농도로 처리하여 근원세포 분화의 마커인 MHC 발현량을 통해 근원세포의 분화촉진 효능을 평가하였다 (도 5A).
또한 마우스 항(mouse anti)-MHC) 및 형광 물질에 결합된 마우스 항체로 (anti-mouse IgG2b Alexa-fluor 568) 면역 염색법을 수행하여 근관세포에서 아조엔에 의한 MHC 발현 변화를 평가하였다 (도 5B) (11. Chem . Biol . Interact. 2016, 248, 60).
4-1. 실험 과정
실험예 2와 같은 방법으로 아조엔(Z형)을 (0, 0.1, 1, 10, 100 nM) 첨가한 분화 배지에서 근원세포를 분화시켜 단백질 추출물을 얻고, 웨스턴 분석법을 통해 MHC 발현량을 분석하였다. 이 때 pan-cadherin 발현량은 적재 대조군(loading control)으로 사용하였다 (도 5A).
또한 같은 조건에서 분화된 세포에서 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하여 마늘 화합물에 의한 MHC-양성 근관세포 (positive myotubes) 형성의 증가를 관찰하였다. MHC-양성 근관세포 (positive myotubes)의 면역형광(Immunofluorescence) 결과는 적색으로 시각화하고 DAPI-표지된 핵은 청색으로 시각화하였다 (도 5B).
4-2. 실험 결과 (표 5, 6 및 도 5)
아조엔의 MHC 발현에 대한 효과를 웨스턴 분석법으로 확인한 결과, 대조군세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 아조엔 농도 (0, 0.1, 1, 10, 100 nM)에 따라 각각 1.0, 2.6, 3.1, 3.3, 그리고 3.9배 각각 증가하였다 (도 5A).
도 5B에서는, 항(anti)-MHC 항체(antibodies) 및 DAPI을 이용한 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 화합물의 근육분화 활성을 측정하였다. 증가된 적색형광(red-fluorescence)은 아조엔이 C2C12 세포에서의 MHC 발현을 농도 의존적으로 촉진함을 의미하며, DAPI 염색(counter staining)을 통해서는 MHC가 발현되는 실린더 형(cylinder-shaped) 근관세포가 다핵성(multinucleated)임을 확인할 수 있었다.
상기 실험에서 아조엔은 매우 낮은 농도에서, 근관세포에서의 MHC 발현과 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 수를 증가시킴을 알 수 있었으며 근육 세포 분화를 촉진시킴을 입증하였다.
아조엔의 MHC 단백질 발현 증가활성 (도 5A)
아조엔
농도 [nM] 0 0.1 1 10 100
MHC 발현량 (배) 1.0 1.0 2.6 3.1 3.9
아조엔의 다핵성 근관섬유에서의 MHC 발현 증가 활성 (도 5B)
아조엔
농도 [nM] 0 10 100
5개 이상의 핵을 가진 다핵성이며 MHC가 발현된 근관 섬유의 수 (배) 1.0 1.5 2.7
실험예 5. 아조엔의 근원세포 분화( myoblast differentiation) 와 p38 MAPK 신호전달 체계 기전 연구
상기 실시예의 아조엔의 근원세포의 분화(myogenic effect)에 미치는 영향을 더 자세히 알아보기 위하여, 아조엔 처리한 후 근원세포 분화의 마커인 MHC, myoD, 그리고 미오게닌의 발현량을 분화 기간 동안 측정하였다 (도 6A) (9. Bioorg Med Chem Lett. 2017, 15, 27).
p38 MAPK 신호전달계는 근원세포 분화(myoblast differentiation)에 매우 중요한 기전으로 알려져 있으므로, 상기 실시예의 아조엔이 근원세포 분화(myoblast differentiation) 동안 p38 MAPK 신호전달계에 영향을 주는지 알아보기 위하여 참고문헌에 기재된 방법을 실험을 수행하였다 (도 6B) (12. Mol. Biol. Cell. 2010, 21, 2399).
p38 미토겐-활성화 프로테인 키나제 (mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)는 MyoD 활성화에 중요한 역할을 수행하는데, p38MAPK는 근원세포 분화인자(myogenic factors) 발현을 유도하기 위한 Myo D의 이량화(dimerization)를 촉진한다 (13. Trends Cell Biol. 2006, 16, 36). p38 MAPK와 더불어 Akt는 근육 세포 내에서 근육-특이적인 유전자 발현을 유도하고 (14. Int J Mol Med. 2015, 36, 1073) 근육 분화에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
5-1. 실험 과정
본 발명자들은 근원세포에 아조엔(100 nM)을 처리하여 분화 1, 2, 그리고 3일 째에 근관세포(differentiated myotubes) 용해물을 얻어 MHC, myoD, 미오게닌, 그리고 인산화된 p38 MAPK 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅 분석법으로 분석하였다. 이를 위해 일차 마우스 항-MHC (Cat# MAB4470, R&D systems), 토끼 항-myoD (sc-32758, SantaCruz) 또는 마우스 항-미오게닌 (sc-12732, SantaCruz)과 Horseradish peroxidase가 연결된 항 마우스 또는 토끼 2차 항체 (goat anti-mouse IgG-HRP, sc-2005, SantaCruz) (goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2030, SantaCruz)를 결합한 후, 화학발광으로 MHC, myoD, 그리고 미오게닌 단백질량을 분석하였으며, 일차 토끼-항 인산화 p38 MAPK(Cat# 9211, Cell Signaling Technology)와 이에 대한 항 토끼 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, sc-2004, SantaCruz)를 반응시켜 인산화 p38 MAPK 발현을 측정하였고, 이 때 적재 대조군(loading control)인 총 p38 MAPK의 발현량을 분석하기 위해 일차 토끼-항 p38 MAPK(Cat# 9212, Cell Signaling Technology)를 사용하였다.
5-2. 실험 결과 (표 7, 8 및 도 6)
아조엔의 MHC, myoD, 그리고 미오게닌 발현에 대한 효과를 웨스턴 분석법으로 확인한 결과, 분화 1일째 세포에서의 각 단백질 발현을 1로 하였을 때, 아조엔 처리 후, 분화 동안 각각 증가하였다 (표 7 및 도 6A).
MHC의 경우, 분화 3일째 가장 발현량이 컸으며, 아조엔 처리 시, 처리하지 않은 세포군에서보다 MHC의 발현이 2.3배 증가하였다.
myoD의 경우, 분화 2일째 가장 발현량이 컸으며, 아조엔 처리 시, 처리하지 않은 세포군에서보다 MHC의 발현이 3.0배 증가하였다.
미오게닌의 경우, 분화 3일째 가장 발현량이 컸으며, 아조엔 처리 시, 처리하지 않은 세포군에서보다 MHC의 발현이 2.9배 증가하였다.
근원 세포 분화에 중요한 p38 MAPK 신호 전달계 또한 아조엔 처리에 의해 분화기간 동안 더욱 활성화되었다. 분석 결과, 분화 1일째 세포에서의 p38 MAPK의 인산화 정도를 1로 하였을 때, 3일째에 가장 증가하였고, 아조엔에 의해 1.7배 증가하였다 (표 8 및 도 6B).
상기 실험 결과는 아조엔에 의해 근원세포 분화(myoblast differentiation)가 촉진되며 이 때 p38 MAPK 활성화가 중요하게 작용함을 의미한다.
아조엔의 MHC, myoD, 그리고 미오게닌 발현 증가 활성 (도 6A)
분화기간 (일) 1 2 3
화합물 - + - + - +
MHC/pan-cadherin 발현량 (배) 1.0 1.2 1.2 1.6 2.0 2.3
myoD/pan-cadherin 발현량 (배) 1.0 1.1 2.8 3.0 1.3 2.2
미오게닌/pan-cadherin 발현량 (배) 1.0 0.9 1.4 1.9 2.4 2.9
아조엔의 p38 MAPK 활성 (도 6B)
분화기간 (일) 1 2 3
화합물 - + - + - +
인산화-p38 /p38 발현량 (배) 1.0 1.2 1.1 1.4 1.6 1.7
실험예 6. 근육 소실 시험관내 (in vitro) 모델에서의 아조엔의 근육 분화 활성
상기 실시예의 아조엔에 의한 근육 소실에 대한 억제 효과를 밝히기 위해 CT-26, 마우스 대장암 세포주 배양액을 근관세포에 처리하여 근육 소실의 in virto 모델을 확립하고 (15. Sci Rep. 2016, 11, 24214. doi: 10.1038/srep24214) 하기와 같이 실험을 진행하였다.
6-1. 실험 과정
본 발명자들은 근육 소실의 in vitro 모델을 확립하기 위해 5 X 106 개의 CT-26 마우스 대장암 세포를 T75 플라스크에 분주하여 배양 배지 (10% 우태 혈청을 포함한 DMEM)에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 인산 완충 생리 식염수로 2회 세척하고, 혈청이 없는 DMEM으로 1회 세척하였다. 혈청 내의 염증성 인자들의 영향을 배제하기 위해, 세척된 세포에 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지를 21 ml를 넣고 24 시간 동안 배양한 후, 배양을 취하여 syringe filter (idameter 25mm, pore size 20 μm, Hyundai Co., LTD)를 이용해 필터링한 후 -20°C에서 보관하였다.
약 3 x 104 의 근원세포(C2C12)를 60 mm 플레이트에 분주하고 24 시간 후 2% 말 혈청을 첨가한 DMEM 분화 배지에서 8 일 동안 배양하여 근관세포로 분화시켰다. 이 때 새로운 분화 배지로 3일 마다 교체해 주었다. 분화된 근관세포에 시료를 0, 0.1, 1, 10 μM 농도로 아조엔을 처리하여 3 시간 동안 배양한 후, CT-26 마우스 대장암 세포의 배양액을 최종 농도가 20% 되도록 첨가하여 3일간 더 분화시켰다. 분화와 시료 처리가 완료된 세포를 인산 완충 생리 식염수로 세척하여 준비하였다. 준비된 세포를 이용해 각각 근육 분화 인자들의 단백질 발현을 보기 위한 웨스턴 블롯팅 (도 7A)과 MHC 발현 확인을 위한 면역 형광 염색(도 7B)을 수행하였다.
6-2. 실험 결과 (표 9, 10 및 도 7)
각 세포군에서 MHC와 myoD 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석법을 통해 분석한 결과, 대장암 배양액을 첨가하지 않은 대조군 (NC) 근관세포에서의 MHC 발현을 1로 하였을 때, 암세포주 배양액만을 처리하여 근육 손실을 유도한 근관 세포군에서의 MHC 발현은 0.7배로 급격히 감소하였으나, 아조엔의 농도에 따라 10 μM에서 1.4배로 근육 손실이 유도되지 않은 대조군 근관세포군의 MHC 발현 수준 이상으로 회복되었다.
근육 분화에 중요한 전사인자인 myoD의 발현도 대장암 배양액을 첨가하여 근육 손실을 유도한 근관 세포군에서는 0.9 배로 감소하였으나, 아조엔의 농도에 따라 10 μM에서 1.3배로 증가하여 대조군 근관세포군의 myoD 발현 수준으로 회복됨이 관찰되었다. MHC와 myoD 모두 아조엔 농도 증가에 따른 발현 증가 패턴을 보였다 (표 9 및 도 7A).
도 6B에 나타난 바와 같이, 암세포주 배양액에 의해 감소한 근육 재생 능력을 시료에 의한 회복능력을 확인하기 위하여, 대장암 배양액을 첨가한 근관세포에서 적색형광의 수준으로 MHC 발현을 평가하였고, DAPI 판독 염색으로는 화합물 처리에 의하여 실린더 형(cylinder-shaped) 다핵성 근관세포(multinucleated myotubes) 형성을 평가하였다. 대장암세포 배양액을 첨가하지 않은 대조군 (NC) 근관세포와 비교하여, 암 세포주 배양액에 의해 근육분화가 현저히 억제되었다. 이때 아조엔을 처리한 결과, 암 세포주 배양액에 의해 감소한 다핵성 (multinucleated) MHC-양성 세포(positive cells)의 수가 회복되었다 (표 10 및 도 7B). 본 발명의 시료에 의한 근육 재생이 효과적으로 촉진됨을 입증한 것이다.
Figure pat00003
Figure pat00004
실험예 7. 암 악액질 동물실험(in vivo ) 모델에서의 EW 추출 분획물의 근육 소실 완화 효과 평가
상기 실시예의 EW 추출 분획물의 근육 소실에 대한 억제 효과를 in vivo 모델에서 규명하기 위해, CT-26 마우스 대장암 세포주를 BALB/c 마우스에 피하주사하여 암 악액질 동물모델을 확립하고 배양액을 근관세포에 처리하여 근육 소실의 in vivo 모델을 확립하고 (16. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2014, 5, 321) 하기와 같이 실험을 진행하였다.
7-1. 실험 과정
본 발명자들은 근육 소실의 in vivo 모델을 확립하기 위해 6주령의 수컷 BALB/c 마우스 입고 후 1주일 적응 기간을 거친 다음, 군당 평균체중이 유사하도록 무작위로 선출하여 2군(대조군과 악액질 유도군)으로 분류하고 실험동물을 마취시켜 대조군에는 멸균한 PBS를 200 μl 주사하고, 악액질 유도군에는 멸균한 PBS에 CT-26 마우스 대장암 세포를 1×106 cells/ml의 농도로 200μl 한 차례 피하주사하여 암의 형성을 유도하였다. 2주 이후 충분한 암의 형성이 이루어지면, 악액질을 유도한 군을 체중이 유사하도록 다시 무작위로 선출하여 4군으로 나누고, 각 군에 0, 5, 10, 20 mg/마우스 체중 kg의 EW 추출 분획물을 1주일 동안 복강주사하였다. 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하며 실험기간 동안 실험동물의 체중과 식이섭취량은 매주 2회 측정하였다. 12시간 동안 절식시킨 마우스에 마취제를 투여하여 실험동물의 움직임을 방지하고, 고통을 최소화하여 희생하였다. 전체 해부과정 동안 사용하는 모든 기구들은 멸균과 소독하여 준비하였고, 근육조직을 적출하여 식염수에 세척한 후 물기를 제거하고 무게를 측정하였다.
7-2. 실험 결과 (표 11 및 도 8)
암 악액질이 유도된 동물모델에서 각 군별 아조엔 공급이 근육 소실에 미치는 효과를 살펴본 결과, 암이 유도되지 않은 대조군의 근육량을 1로 하였을 때 CT-26 대장암 세포에 의해 암이 유도된 군 중 EW 추출 분획물을 공급하지 않은 군은 근육량이 0. 86배로 급격히 감소하였으나, EW 추출 분획물을 공급한 3군에서 모두 악액질로 인한 근 소실이 억제되었음을 관찰하였다. 마우스 체중 kg 당 5 mg과 20 mg의 EW 추출 분획물을 투여한 군은 근육량이 0.94배, 특히 EW 추출 분획물을 10 mg 투여한 군에서 근육량이 0.99배로 암으로 인해 유도된 근 소실이 가장 효과적으로 억제되었다 (표 11 및 도 8). 이상과 같이 본 발명의 EW 추출 분획물에 의한 암 악액질로 유도된 근육 소실 억제효과를 in vivo 모델에서 재확인하였다.
Figure pat00005
하기에 본 발명의 시료 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
추출 분획물 (EW) ---------------------------------------- 20 mg
유당 --------------------------------------------------- 100 mg
탈크 ---------------------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
추출 분획물 (WE) --------------------------------------- 10 mg
옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg
유당 -------------------------------------------------- 100 mg
스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
추출 분획물 (WH) --------------------------------------- 10 mg
결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg
락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
추출 분획물 (WB) --------------------------------------- 10 mg
만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg
주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg
Na2HPO4,12H2O ------------------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
추출 분획물 (WW) ---------------------------------------- 20 mg
이성화당 ------------------------------------------------- 10 g
만니톨 ---------------------------------------------------- 5 g
정제수 --------------------------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
추출 분획물 (EW) -------------------------------------- 1000 ㎎
비타민 혼합물 -------------------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 ------------------------------------- 70 ㎍
비타민 E ----------------------------------------------- 1.0 ㎎
비타민 B1 --------------------------------------------- 0.13 ㎎
비타민 B2 --------------------------------------------- 0.15 ㎎
비타민 B6 ---------------------------------------------- 0.5 ㎎
비타민 B12 --------------------------------------------- 0.2 ㎍
비타민 C ------------------------------------------------ 10 ㎎
비오틴 -------------------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ----------------------------------------- 1.7 ㎎
엽산 ---------------------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ------------------------------------------ 0.5 ㎎
무기질 혼합물 -------------------------------------------- 적량
황산제1철 --------------------------------------------- 1.75 ㎎
산화아연 ---------------------------------------------- 0.82 ㎎
탄산마그네슘 ------------------------------------------ 25.3 ㎎
제1인산칼륨 --------------------------------------------- 15 ㎎
제2인산칼슘 --------------------------------------------- 55 ㎎
구연산칼륨 ---------------------------------------------- 90 ㎎
탄산칼슘 ----------------------------------------------- 100 ㎎
염화마그네슘 ------------------------------------------ 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
추출 분획물 (WW) ---------------------------------------- 1000㎎
구연산 ------------------------------------------------- 1000 ㎎
올리고당 ------------------------------------------------- 100 g
매실농축액 ------------------------------------------------- 2 g
타우린 ----------------------------------------------------- 1 g
정제수를 가하여 ------------------------------------ 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (11)

  1. 마늘 추출 분획물로부터 분리된 아조엔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 치료 및 예방 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 마늘 (Allium sativum L.)의 비늘 줄기, 줄기 또는 열매를 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 마늘 추출 분획물은 (1) EW 추출 분획물, (2) WE 추출 분획물, (3) WH 추출 분획물, (4) WB 추출 분획물, (5) WW 추출 분획물 또는 (6) ME 추출 분획물임을 특징으로 하는 약학조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 EW추출 분획물은 마늘의 껍질을 제거한 뒤 으깨는 제 1단계; 으깬 마늘을 10 내지 50℃ 수욕상에서 1 내지 60분마다 저어주며 20분 내지 6시간 동안 가온 처리하는 제 2단계; 가온처리된 상기 2단계의 마늘에 마늘 중량의 1 내지 10배(w/w) 중량의 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 메틸렌클로리드로부터 선택된 비극성 용매를 가한 후 10 내지 100℃에서 20분 내지 6시간 동안 추출하여 비극성용매 가용분획을 얻는 제 3단계; 3단계의 비극성용매 가용분획에 물을 가하여 반복적으로 분획하여 물층을 제거하고 에틸아세테이트 층을 농축 및 건조하는 제 4단계 공정을 통하여 Z-아조엔 5 내지 30%(w/w) 및 E-아조엔 1 내지 10%(w/w)를 주성분으로 함유함을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 마늘 추출 분획물로부터 분리된 화합물은 Z-아조엔, E-아조엔 또는 이의 구조이성체 혼합물임을 특징으로 하는 약학조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 근육관련 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육질환임을 특징으로 하는 약학조성물.
  7. 마늘 추출 분획물로부터 분리된 아조엔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료 형태인 건강기능식품.
  9. 마늘 추출 분획물로부터 분리된 아조엔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품.
  10. 마늘 추출 분획물로부터 분리된 아조엔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제.
  11. 마늘 추출 분획물로부터 분리된 아조엔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 항암 보조 치료제.
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