KR101406126B1 - 백운풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백운풀 추출물 또는 분획물은 생체 내 독성이나 부작용이 없으면서도, 비만 동물모델에서 우수한 비만 치료 효과를 가지고 있어, 비만 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

백운풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 {Composition containing Hedyotis diffusa extract for treating or preventing obesity}

본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 있었다. 특히, 바쁜 현대인들의 경우 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 체중 과다 및 비만이 증가하고 있다. 체중 과다는 체질량 지수 (BMI, 체중을 키의 제곱으로 나눈 비만 척도)가 25 이상 30 미만을 의미하며, 비만은 체질량 지수가 30 이상일 때를 의미한다.

미국 성인의 3분의 2는 체중 과다이거나 비만이며, 체중 과다는 혈압과 콜레스테롤 수치를 높여 심장 질환 등의 각종 성인병의 발병률을 증가시킨다. 비만이 여러 가지 질병에 미치는 영향은 매우 심각하여 전 세계 당뇨병 환자의 80 %, 심장질환의 21 %가 비만이 원인인 것으로 알려져 있다. 이 외에도 자궁암, 신장암, 유방암 등 각종 암 또한 비만과 직, 간접적으로 연관되어 있으며, 비만이나 과체중의 경우 수면무호흡증, 골관절염, 담석증 등의 발병률도 정상인보다 높다 (Stein CJ, Colditz GA. The epidemic of obesity. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 2522-2525. ; Kopelman PG. Obesity as a medical problem. Nature 2000 Apr 6; 404(6778): 635-43.).

비만은 한 가지 원인으로 발생하는 질병이 아니라 유전적, 환경-사회적, 정신적 등 여러 가지 요인들이 복합적으로 작용하여 발생하기 때문에 어느 한 가지 방법으로 치료하기는 어렵다. 현재 비만을 치료하기 위한 방법은 식사요법, 운동요법, 행동요법 등 생활 습관을 교정하는 방법과 약물치료 및 수술적 치료로 나눌 수 있다. 약물이나 수술적 치료에 앞서 생활습관을 교정하기 위한 적극적인 노력이 선행되어야 하지만, 생활습관을 교정하는 일이 쉽지 않을 뿐 아니라 생활습관 교정만으로 감소시킬 수 있는 체중은 한계가 있다. 따라서 많은 경우에 생활습관 교정과 함께 약물치료가 필요하다.

이러한 비만의 약물 치료를 위해 매년 많은 항비만 제제들이 개발되고 있지만 현재 사용 가능한 비만 치료 약물은 많지 않으며, 대부분 소화나 식욕을 억제시키는 제제에 국한되어 있다. 소화나 식욕을 조절하는 제제의 경우, 습관성 때문에 향정신성 약물로 분류되며, 소화억제제는 설사, 변비 등의 부작용을 나타낸다. 2010년까지 미국 FDA가 장기사용을 승인한 대표적 비만치료 약물은 노르에피네프린 (norepinephrine)과 세로토닌 (serotonin)의 재흡수를 억제하는 작용을 가진 시부트라민 (sibutramine; Reductil)과 췌장 및 소화기계에서 분비되는 리파아제 (lipase)를 억제하여 효과를 나타내는 오르리스타트 (orlistat; Xenical)가 있었다 (Yanovski SZ, Yanovski JA. Obesity. N Engl J Med 2002; 346: 591-602.).

그러나 시부트라민 (Sibutramine)은 혈압상승, 불면증, 구강 건조, 어지러움 등의 부작용이 흔하고, 심근경색과 뇌졸중 등 심혈관계 증상이 나타날 위험이 있어 2010년 10월 미국 및 국내에서 퇴출되었다. 또한, 오르리스타트 (Orlistat)는 설사, 지방변, 분실금 등의 부작용이 흔하고 한국인과 같이 서양인에 비해 지방섭취가 적은 경우에는 약물의 효과가 뚜렷하지 않아 사용이 제한되고 있다 (김상만. Orlistat에 대한 연구. 대한비만학회지 1998; 7(4): 287-92.).

따라서, 비만 억제 효과가 우수하고, 장기 복용의 안전성이 확인된 비만 예방 또는 치료제가 요구되는 실정이다.

한편, 백운풀 (Hedyotis diffusa; 또는 백화사설초)은 쌍떡잎식물 꼭두서니목 꼭두서니과의 한해살이 풀이다. 유사한 외형을 지닌 중국산 산방화이초 (H. corymbosa)를 수십 년 전부터 민간에서 항암제로 사용해왔으며, 그로 인해 국내 토종 백운풀이 멸종위기에 처하였다. 이에 도종묵씨가 전국에서 자생하고 있는 토종 백운풀의 종자를 수집하고, 수 차례의 시행착오 끝에 2006년 재배법을 확인하게 되었으며, 이 후 백운풀의 효능에 대한 연구가 계속되었다. 그러나 아직까지 백운풀 추출물의 항비만 효과에 관해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 생체 내 독성이나 부작용이 없고 안정성이 우수한 천연물로부터 유래한 항비만제를 찾기 위한 연구를 계속 하던 중, 백운풀 추출물 또는 분획물이 비만 동물모델에서 우수한 비만 치료 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

국내특허출원번호 : 10-2002-0004551

본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 백운풀 추출물 또는 분획물은 생체 내 독성이나 부작용이 없으면서도, 비만 동물모델에서 우수한 비만 치료 효과를 가지고 있어, 비만 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1 은 백운풀 추출물 및 분획물의 분리 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 백운풀 에탄올 (50%, 75% 또는 95%) 추출물의 AMPK 및 ACC 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 백운풀 분획물 (디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물)의 AMPK 및 ACC 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 백운풀 디클로로메탄 분획물의 분리 과정을 나타낸 도이다.
도 5 및 도 6은 백운풀 디클로로메탄 분획물로부터 분리한 각 분획 (Fr. 1~5)의 AMPK 및 ACC 활성을 나타낸 도이다.
도 7은 백운풀 디클로로메탄 분획물로부터 분리한 분획 3(Fr. 3)의 분리 과정을 나타낸 도이다.
도 8은 백운풀 에틸아세테이트 분획물의 분리 과정을 나타낸 도이다.
도 9는 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD1의 TLC 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD1의 ¹³C-NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD1의 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD2의 ¹H-NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD2의 ¹³C-NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD2의 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD3의 ¹H-NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD3의 ¹³C-NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 백운풀 분획물로부터 분리한 활성물질인 HD3의 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 18 및 도 19는 백운풀 디클로로메탄 분획물, 이로부터 분리한 분획 3, HD1, HD2 및 HD3 의 AMPK 및 ACC 활성을 나타낸 도이다.
도 20은 비만 동물모델에서 백운풀 에탄올 추출물이 체중 증가에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 21은 비만 동물모델에서 백운풀 에탄올 추출물이 복부 지방 증가에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 22는 비만 동물모델에서 백운풀 에탄올 추출물이 혈중 콜레스테롤 농도에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 23은 비만 동물모델에서 백운풀 에탄올 추출물이 간 조직 내 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

본 발명은 백운풀 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 백운풀 추출물 또는 분획물은 하기와 같은 방법으로 수득될 수 있다.

먼저, 백운풀을 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조하고 분쇄한다. 백운풀은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 분쇄된 백운풀에 적당한 양의 용매를 첨가하여 완전히 침지되도록 한다. 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매가 바람직하며, 보다 바람직하게는 50~99 % 에탄올이다. 추출방법은 실온에서 함침하거나 가온할 수 있으며, 보다 바람직하게는 60 내지 95℃에서 2 내지 10시간 동안 환류추출하며, 상기 과정을 반복할 수 있다. 상기 추출물을 여과 및 농축하여 최종 백운풀 추출물을 수득한다.

또한, 상기 추출물을 물에 현탁시킨 후 디클로로메탄 (CH₂Cl₂), 에틸아세테이트 (EtOAc) 및 부탄올 (n-BuOH)로 순차적으로 분획하고, 각 분획물을 농축하여 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 수득한다.

상기 분획물 중 AMPK 및 ACC 활성이 우수하게 나타난 백운풀 디클로로메탄 분획물과 백운풀 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 통해 분리하여, 각각 5개의 분획과 6개의 분획을 얻었다. 백운풀 디클로로메탄 분획물로부터 얻은 5개의 분획 중 분획 3과 백운풀 에틸아세테이트 분획물로부터 얻은 6개의 분획 중 분획 1 및 분획 5가 AMPK 및 ACC 활성이 가장 우수하게 나타남을 확인하였다.

따라서, 이들 분획으로부터 활성 성분 (HD1, HD2, HD3)을 분리하고, 이들 성분을 각각 화학식 1의 우르솔산 (ursolic acid), 화학식 2의 2-하이드록시-3-메틸-안트라퀴논 (2-hydroxy-3-methyl-anthraquinone) 또는 화학식 3의 2-하이드록시-1-메톡시-3-메틸-안트라퀴논 (2-hydroxy-1-methoxy-3-methyl-anthraquinone, digitolutein)으로 동정하였다.

본 발명에 따른 백운풀 추출물 또는 분획물은 생체 내 독성이나 부작용이 없으면서도, 세포 내에서 AMPK의 활성을 촉진하고, 비만 동물모델에서 체중 감소, 체지방 감소, 총 콜레스테롤 감소, 간 조직 내 지방 축적 억제 등 우수한 비만 치료 효과를 가지고 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 백운풀 추출물 또는 분획물은 비만 치료 효과가 우수하므로, 비만 예방 또는 치료에 유용한 의약품 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 백운풀 추출물 또는 분획물과 함께 비만 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 1 mg/ kg 내지 300 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 비만 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 건강기능식품이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 백운풀 추출물 또는 분획물은 비만 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 백운풀 추출물 또는 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 백운풀 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 백운풀 추출물 또는 분획물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 백운풀 에탄올 추출물 및 분획물의 제조

백운풀을 깨끗이 물로 세척하여 이물질을 제거한 후, 건조하였다. 건조된 백운풀 10.8 kg을 95% 에탄올로 각각 80℃에서 5시간 동안 2회 반복 환류추출하였다. 이를 여과한 후, 감압농축 하여, 백운풀 에탄올 추출물 (1326.3 g)을 수득하였다.

상기 백운풀 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후, 디클로로메탄 (CH₂Cl₂), 에틸아세테이트 (EtOAc) 및 부탄올 (n-BuOH)을 이용하여 순차적으로 분획하였다. 수득된 디클로로메탄 층을 소금물 (brine)로 세척한 후, 무수 Na₂SO₄로 건조한 다음 여과하고, 그 여과액을 탈수, 감압농축하여 백운풀 디클로로메탄 분획물 (343.1 g)을 수득하였다. 동일한 방법으로 백운풀 에틸아세테이트 분획물 (84.96 g), 백운풀 부탄올 분획물 (208.6 g) 및 백운풀 물 분획물을 수득하였다.

상기 백운풀 추출물 및 분획물의 수득 과정을 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 백운풀 에탄올 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 95% 에탄올 대신 50% 또는 75% 에탄올을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 백운풀 50% 에탄올 추출물 또는 백운풀 75% 에탄올 추출물을 수득하였다.

실험예 1. 백운풀 에탄올 추출물 또는 분획물이 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향 분석

1-1. 백운풀 에탄올 추출물이 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향

상기 실시예 1 및 2에서 수득한 백운풀 에탄올 추출물이 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, L6 근관 세포 (myotube cell)를 10% FBS α-MEM의 배지 상에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 12시간 이상 배양한 후, 세포가 정착된 것이 확인되면 2% FBS α-MEM으로 배지를 교체하여 배양하였다. 48시간 마다 배지를 교환해 주면서 총 10일 동안 세포를 배양한 뒤에 FBS를 포함하지 않은 α-MEM 배지로 교환하였다. 5시간 후, 상기 실시예 1 및 2에서 수득한 백운풀 추출물 (50%, 75% 또는 95% 에탄올 추출물, 60 μg/mL)을 2시간 동안 처리하고, 세포 용해 완충액 (cell lysis buffer)을 이용하여 단백질을 분리한 후, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 양성대조군으로 알려진 AMPK 활성 물질인 메트포민 (metformin, 2mM)을 이용하였으며, 모든 실험은 2회 반복하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 백운풀 추출물은 AMPK 및 ACC 인산화 활성을 가지고 있었으며, 특히 추출 용매로 95% 에탄올을 이용하였을 때, 양성 대조군인 메트포민과 유사한 수준의 AMPK 활성 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다.

1-2. 백운풀 분획물이 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 수득한 백운풀 디클로로메탄 분획물, 백운풀 에틸아세테이트 분획물, 백운풀 부탄올 분획물 및 백운풀 물 분획물이 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험예 1-1과 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 4종의 백운풀 분획물 중 백운풀 디클로로메탄 분획물 및 백운풀 에틸아세테이트 분획물이 우수한 AMPK 인산화 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 3. 백운풀 분획물에서 활성 성분의 분리

상기 실험예 1에서 우수한 AMPK 인산화 활성을 나타낸 백운풀 디클로로메탄 분획물 및 백운풀 에틸아세테이트 분획물로부터 활성 성분을 분리하기 위하여, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Ø 11x53 cm)를 수행하였다.

3-1. 백운풀 디클로로메탄 분획물에서 활성 성분의 분리

백운풀 디클로로메탄 분획물 (9.26 g)은 용출 용매 (헥산:EtOAc=50:1~1:1, 디클로로메탄:메탄올=20:1~1:1, 메탄올 100%)를 이용하여 총 5개의 분획 (Fr. 1~5)으로 분리하였다. 상기 분리 과정을 도 4에 나타내었다.

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 각 분획 (30 또는 60 μg/mL)이 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 백운풀 디클로로메탄 분획물에서 분리한 5개의 분획 중 분획 3 (Fr. 3)에서 가장 높은 AMPK 및 ACC 인산화 효과를 확인하였다.

또한, 백운풀 디클로로메탄 분획물에서 분리한 분획 3 (Fr. 3, 1.21 g)에 대해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Φ 3×45 cm)를 재실시하여, 분획 3-2로부터 HD3 (4.3 mg)을 수득하였다. 또한, 분획 3-4 (1.04 g)에 대해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Φ 3×57 cm)를 재실시하여, HD2 (60 mg) 및 HD1 (220 mg)을 수득하였다. 상기 분리 과정을 도 7에 나타내었다.

3-2. 백운풀 에틸아세테이트 분획물에서 활성 성분의 분리

백운풀 에틸아세테이트 분획물 (84.96 g)은 용출 용매 (헥산:CHCl₃=1:1, CHCl₃ 100%, CHCH₃:메탄올=100:1~50:1, 메탄올 100%)를 이용하여 총 6개의 분획 (Fr. 1~6)으로 분리하였으며, 이 중 분획 1 (Fr. 1)로부터 HD1(5.35 g)을 수득하였다. 또한, 분획 5 (Fr. 5, 17.26 g)에 대해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Ø 8x42 cm)를 재실시하여 HD2 (2.4 g)를 수득하였다. 상기 분리 과정을 도 8에 나타내었다.

실시예 4. 백운풀 분획물에서 분리한 활성 성분의 동정

4-1. HD1 구조 동정

상기 실시예 3에서 수득한 HD1의 구조 동정을 위하여 TLC, 질량 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, TLC 분석 결과, HD1은 UV를 흡수하지는 않았지만, 10% 황산을 이용한 정색반응에서는 붉은색으로 발색된 것으로 보아 트리테르페노이드 (triterpenoid) 또는 스테로이드 (steroid)계 화합물로 예상할 수 있었다. 또한, 기존에 백운풀로부터 분리된 바 있는 대표적인 트리테르페노이드계 화합물인 우르솔산 (ursolic acid)과 동일한 Rf치를 가지는 것을 확인하였다.

또한, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 질량 스펙트럼 결과 및 ¹³C-NMR 분석 결과를 문헌치와 비교하여, 최종적으로 HD1을 우르솔산 (ursolic acid)으로 동정하였다.

¹³C-NMR 분석 요약 결과를 하기와 같이 나타내었다.

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ: 178.67 (C-28), 138.54 (C-13), 124.93 (C-12), 77.17 (C-3), 55.11 (C-5), 52.71 (C-18), 47.34 (C-17), 47.17 (C-9), 41.99 (C-14), 38.85 (C-19), 38.77 (C-8, C-20), 38.74 (C-10), 38.55 (C-1), 36.87 (C-4), 36.66 (C-22), 33.04 (C-7), 30.76 (C-21), 28.61 (C-23), 27.88 (C-15), 27.32 (C-2), 24.14 (C-16), 23.62 (C-27), 23.19 (C-11), 21.45 (C-30), 18.36 (C-6), 17.39 (C-26), 17.26 (C-29), 16.45 (C-25), 15.58 (C-24)

[화학식 1]

4-2. HD2 구조 동정

상기 실시예 3에서 수득한 HD2의 구조 동정을 위하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 12 내지 도 14에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, ¹H-NMR 분석 결과, δ2.29에서 메틸 그룹에 의한 인테그랄 3에 해당되는 피크가 관측되었으며, δ 11.08에서 인테그랄 1의 하이드록시 그룹에 의한 피크를 확인하였다.

또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, ¹³C-NMR 분석 결과, δ182.95와 δ181.77에서 피크가 관찰됨에 따라 케톤 구조를 가지고 있음을 확인하였으며, δ16.57에서 나타난 피크를 통해 1개의 메틸 그룹이 존재함을 확인하였다.

또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 질량 스펙트럼 결과를 문헌치와 비교하여, 최종적으로 HD2를 2-하이드록시-3-메틸-안트라퀴논 (2-hydroxy-3-methyl-anthraquinone)으로 동정하였다.

¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석 요약 결과를 하기와 같이 나타내었다.

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 11.08 (1H, s, OH), 8.14 - 8.18 (2H, m, 5,8-Hs), 7.97 (1H, s, 4-H), 7.86 - 7.92 (2H, m, 6,7-Hs), 7.55 (1H, s, 1-H), 2.29 (3H, s, CH₃)

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆) δ: 182.95 (C-10), 181.77 (C-9), 161.74 (C-3), 134.79 (C-7), 134.34 (C-6), 133.55 (C-8a), 133.53 (C-10a), 133.43 (C-4a), 132.34 (C-2), 126.92 (C-5), 126.89 (C-8), 125.36 (C-9a), 111.58 (C-4), 16.57 (CH₃)

[화학식 2]

4-3. HD3 구조 동정

상기 실시예 3에서 수득한 HD3의 구조 동정을 위하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, ¹H-NMR 분석 결과, δ4.03에서 메틸 그룹에 의한 인테그랄 3에 해당되는 피크가 관측되었으며, δ2.41에서 메틸 그룹에 의한 피크를 확인하였고, δ6.75에서 인테그랄 1의 하이드록시 그룹에 의한 피크를 확인하였다.

또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, ¹³C-NMR 분석 결과, HD2의 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 나타난 안트라퀴논의 특징적인 패턴이 동일하게 나타남을 확인하였으며, δ62.16에서 나타난 피크를 통해 메톡시 그룹이 추가적으로 포함된 것을 확인하였다.

또한, 도 17에 나타낸 바와 같이, 질량 스펙트럼 결과를 문헌치와 비교하여, 최종적으로 HD3을 2-하이드록시-1-메톡시-3-메틸-안트라퀴논 (2-hydroxy-1-methoxy-3-methyl-anthraquinone, digitolutein)으로 동정하였다.

¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석 요약 결과를 하기와 같이 나타내었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.24 - 8.26 (2H, m, 5-H and 8-H), 7.99 (1H, s, 4-H), 7.75 - 7.77 (2H, m, 6-H and 7-H), 6.75 (1H, s, OH), 4.03 (3H, s, OCH3), 2.41 (3H, s, CH₃)

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 182.55 (C-9), 182.44 (C-10), 153.76 (C-3), 146.02 (C-4), 134.49 (C-10a), 133.77 (C-6), 133.67 (C-7), 132.98 (C-8a), 131.33 (C-2), 126.98 (C-5), 126.78 (C-8), 126.68 (C-1), 126.50 (C-9a), 123.52 (C-4a), 62.16 (OCH₃), 16.34 (CH₃)

[화학식 3]

실험예 2. 백운풀 분획물에서 분리한 활성 성분의 활성 분석

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 백운풀 디클로로메탄 분획물, 이의 분획 3, HD1, HD2 및 HD3 (30 또는 60 μg/mL)가 AMPK 및 ACC 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.

도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 백운풀 디클로로메탄 분획물 및 이로부터 분리한 3종의 화합물이 모두 강력한 AMPK 활성을 가지고 있으며, 이의 하위 메커니즘인 ACC의 인산화를 효과적으로 촉진시킴을 확인하였다.

실험예 3. 동물 모델에서 백운풀 에탄올 추출물의 항 비만 효과 검증

상기 실시예 1에서 제조한 백운풀 에탄올 추출물의 항 비만 효과를 검증하기 위하여 동물 실험을 수행하였다. 마우스에 비만을 유도하기 위하여, 8주간 고지방 식이 (High fat diet, HFD)를 급여하였다. 실험군은 고지방 식이와 함께 백운풀 95% 에탄올 추출물을 150 mg/kg 또는 300 mg/kg의 농도로 매일 경구투여하였다. 비만 유도가 정상적으로 이루어졌는지 확인하기 위하여, 정상군 (Control)은 일반 식이를 급여하였다.

약물 투여 기간이 끝난 후, 각 마우스의 체중 측정, 복부 지방 분석, 혈액 분석, 간 조직의 오일 레드 오 (oil red O) 염색을 수행하였다. 그 결과를 각각 도 20 내지 도 23에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 각 마우스의 체중 측정 결과, 정상 식이를 한 정상군에 비해 고지방 식이를 한 대조군은 약 30%가량 무게가 증가한 것을 확인하였으며, 고지방 식이와 함께 백운풀 에탄올 추출물을 투여한 군은 이러한 체중 증가가 통계적으로 유의하게 억제된 것을 확인하였다(** P>0.01; * P>0.05).

또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, 각 마우스의 복부 지방 분석 결과, 정상 식이를 한 정상군에 비해 고지방 식이를 한 대조군의 복부 지방이 현저하게 증가한 것을 확인하였으며, 고지방 식이와 함께 백운풀 에탄올 추출물을 투여한 군에서는 이러한 복부 지방 증가가 억제된 것을 확인하였다.

또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 각 마우스의 혈액 분석 결과, 정상 식이를 한 정상군에 비해 고지방 식이를 한 대조군의 총 콜레스테롤 수치가 크게 증가하였으며, 고지방 식이와 함께 백운풀 에탄올 추출물을 투여한 군은 이러한 총 콜레스테롤 증가가 통계적으로 유의하게 억제된 것을 확인하였다 (* P>0.05). LDL-콜레스테롤의 경우에는 각 군간 유의한 차이를 보이지 않았다.

또한, 도 23에 나타낸 바와 같이, 각 마우스의 간 조직 오일 레드 오 염색 결과, 정상 식이를 한 정상군에 비해 고지방 식이를 한 대조군의 간 조직에서 지방이 크게 증가하였으며, 고지방 식이와 함께 백운풀 에탄올 추출물을 투여한 군은 이러한 간 조직 내 지방 증가가 현저하게 억제된 것을 확인하였다

상기 실험 결과를 통하여, 백운풀 추출물은 체중 감소 및 체지방 감소에 우수한 효과를 보이며, 총 콜레스테롤 증가를 억제하고, 간 조직 내 지방 축적을 억제하는 항 비만 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

이하 본 발명의 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 조성물의 제조

2-1. 건강식품의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2-2. 건강음료의 제조

백운풀 추출물 또는 분획물 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 백운풀 디클로로메탄 분획물 또는 백운풀 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 백운풀 디클로로메탄 분획물 또는 백운풀 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
11. 삭제

Images