KR101891408B1 - 영지버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증 조성물 - Google Patents

영지버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 영지버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 겉보리영지버섯 추출물을 포함하는 조성물은 항산화 또는 항염증 활성을 나타내므로, 산화작용 및 염증 작용에 유발되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 식품, 화장품 및 의약품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

영지버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증 조성물{A composition comprising ganoderma lucidum grown on hulled barley extracts having anti-oxidation or anti-inflammation activity}
본 발명은 영지버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증 조성물에 관한 것이다.
인체는 산화촉진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체 내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 암 등을 초래하게 된다.
한편, 인체 내에서 대식세포는 병원체에 반응하여 종양 괴사 인자-α(tumor necrotic factor-α, TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 등과 같은 염증유발인자를 생성하고, 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 일산화질소(NO) 및 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)을 생성한다. 생리학적으로 NO는 세균과 종양을 제거하고 혈압을 조절하거나 신경 전달을 매개하는 등 다양한 역할을 한다. 그러나 염증 반응이 일어나게 되면 관련 세포들에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO가 생성되고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자변이, 신경 손상 등을 유발하며, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다.
염증 반응 시에는 다양한 염증유발인자와 더불어 다양한 자유기(free radical)가 생성된다. 정상적인 자유기는 세포의 항상성 유지에 관여하며, 세포의 분화, 성장, 생존, 노화에 영향을 준다. 이러한 자유기 중 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포 내의 미토콘드리아에서 호흡과 면역 반응에 의한 산소의 산화와 환원과정을 통해 끊임없이 생성된다. 유해한 ROS는 일반적으로 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 카탈라제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase), 글루타민 리덕타제(glutamine reductase), 비타민 C, 비타민 E, 요산, 빌리루빈(bilirubin)과 같은 항산화 체계의 작용으로 제거된다. 그러나 자유기의 생성과 소거의 균형이 무너지게 되면 산화적 스트레스(oxidative stress)가 발생하게 되어 염증, 노화 또는 암과 같은 다양한 병리학적인 변화를 일으킨다. 실제로 많은 임상 질환에서 산화적 스트레스가 증가되는 것이 확인되었으며, 이러한 산화적 스트레스를 줄이기 위해 새로운 항산화 물질에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항산화 또는 항염증 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연물을 찾고자 예의 연구노력한 결과, 겉보리를 영지버섯균사체로 배양한 추출물에서 높은 항산화 및 항염증 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 오나성하였다.
[선행기술문헌 정보]
1. Protoplasma (2011) 248:683-694 (2010.11.07)
2. Annals of Botany 104: 1243-1253, 2009 (2009.09.16)
3. Annals of Botany 110: 57-69, 2012 (2012.05.31)
본 발명의 목적은 (a) 영지버섯균사체를 배지에 배양하는 단계; (b) 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 배양하여 겉보리영지버섯 배양물을 수득하는 단계; 및(c) 겉보리영지버섯 배양물을 건조 후 추출하는 단계;를 포함하는 겉보리영지버섯 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 목적은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 영지버섯균사체를 배지에 배양하는 단계; (b) 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 배양하여 겉보리영지버섯 배양물을 수득하는 단계; 및 (c) 겉보리영지버섯 배양물을 건조 후 추출하는 단계;를 포함하는 겉보리영지버섯 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)단계의 배양은 10 ~ 40℃의 온도에서 100 ~ 200rpm의 속도로 10 ~ 20일간 종균배양할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계의 배양은 10 ~ 40℃의 온도의 배양기에서 3 ~ 5주간 배양할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계의 추출은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 추출할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 겉보리영지버섯 추출물을 포함하는 조성물은 항산화 또는 항염증 활성을 나타내므로, 산화작용 및 염증 작용에 유발되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 식품, 화장품 및 의약품 등에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 겉보리영지버섯 열수 추출물 또는 에탄올 추출물의 항산화 활성 정도를 측정한 결과이다(A; DPPH radical scavenging activity, B; ABTS radical scavenging activity, C; Nitrite radical scavenging activity, D; Reducing power).
도 2는 본 발명에 따른 겉보리영지버섯 열수 추출물 또는 에탄올 추출물의 세포 내의 ROS 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 겉보리영지버섯 열수 추출물 또는 에탄올 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 겉보리영지버섯 열수 추출물 또는 에탄올 추출물의 NO 정도를 측정한 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 “겉보리영지버섯 추출물”은 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 추출한 것으로서, (a) 영지버섯균사체를 배지에 배양하는 단계;(b) 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 배양하여 겉보리영지버섯 배양물을 수득하는 단계; 및 (c) 겉보리영지버섯 배양물을 건조 후 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 (a)단계의 배양은 10 ~ 40℃의 온도에서 100 ~ 200rpm의 속도로 10 ~ 20일간 종균배양한 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 가장 바람직하게는 28℃에서 140rpm의 속도로 14일간 종균배양한 것이다.
또한, 상기 (b)단계의 배양은 10 ~ 40℃의 온도의 배양기에서 3 ~ 5주간 배양할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 가장 바람직하게는 28℃에서에서 4주 배양한 것이다.
본 발명자들은 상기 방법으로 제조된 겉보리영지버섯 추출물이 항산화 및 항염증 효과가 있음을 확인하고, 이를 식품 또는 화장품, 및 나아가서는 의약품에 적용할 수 있음을 확인한 것이다.
본 발명의 용어 "추출물"은 겉보리영지버섯을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 본 발명의 추출물은 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출용매는 이에 제한되지는 않으나, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 용매로서 70% 에탄올을 이용한 추출물을 제조하였다.
상기 겉보리영지버섯 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO2, ONOO-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증 반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역 세포 들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다. 상기와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다. 따라서, 본 발명의 겉보리영지버섯 추출물을 식품에 포함시키면 항산화 효과를 달성함으로써, 건강증진에 기여할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 겉보리영지버섯 추출물의 총 페놀, 폴리페놀, 아스코르빅 산 함량 및 DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, Nitrite 소거능을 분석하여 강한 항산화능을 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항산화 효과는 활성 산소종 제거에 의해 달성되는 것일 수 있다. 본 발명의 용어 "항염증"은 염증를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 염증 반응의 조절은 대단히 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS와 RNS가 과다 생성되고 그 결과로 영구적인 유전자의 변형이 야기된다. 이처럼 ROS와 RNS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 염증유도 사이토카인(proinflammatory cytokines), 아질산(nitric oxide, NO) 그리고 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)이 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase-2, COX-2)에 의해 생성된다. 염증은 다양한 염증성 질환을 유발하는 원인으로써, 본 발명의 겉보리영지버섯 추출물을 포함하는 조성물은 항염증 작용을 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 겉보리영지버섯 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 하므로 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다.
본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 용어 "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 겉보리영지버섯 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 겉보리영지버섯 추출물에 관해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 추출물은 항산화 효과 및 항염증 효과를 갖기 때문에 항산화 또는 항염증을 목적으로 화장료 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 겉보리영지버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 약학 조성물을 제공한다. 상기 겉보리영지버섯 추출물에 관해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 추출물은 활성산소를 제거하는 항산화 효과 및 항염증 효과를 갖기 때문에 약학 조성물로 활용하여 활성산소로 인해 발생하는 질환들 및 염증성 질환들을 예방, 개선 및 치료하기 위한 의약품에 포함시킬 수 있다.
상기 항산화에 대해서는 전술한 바와 같으며, 그에 따라 항산화를 목적으로 하는 약학 조성물에 포함될 수 있으며, 활성산소로 인해 발생하는 질환의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다. 상기 활성산소로 인해 발생하는 질환들은 이에 제한되지는 않으나, 동맥경화증, 루게릭병, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축색경화증 및 헌팅톤병을 포함하는 퇴행성 신경질환, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 허혈성 심장질환을 포함하는 심혈관 질환, 뇌졸중을 포함하는 허혈성 뇌질환, 당뇨병, 위염 및 위암을 포함하는 소화기계 질환, 암, 백혈병, 노화, 류마티스 관절염, 간염, 아토피성 피부염 등 다양한 질환을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 활성산소에 의해 발생되는 노화일 수 있다.
또한, 상기 항염증에 대해서는 전술한 바와 같으며, 그에 따라 항염증, 즉 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염, 및 인플루엔자 감염증일 수 있다.
상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 겉보리영지버섯 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어 "개체"란 는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 겉보리영지버섯 추출물은 천연물을 원료로 하므로 식품 조성물, 화장료 조성물, 또는 약학적 조성물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로 안전하게 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
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< 실시예 1>
겉보리영지버섯 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 제조방법
균사체 배양에 있어 Potato dextrose agar 평판 배지에 생육된 영지버섯 균사체를 직경 7 mm의 cork border로 일정하게 절취하여, glass homogenizer로 균질화 한 다음, 300 ml potato dextrose broth가 들어 있는 500 ml shaking flask에 옮겨 28℃에서 140rpm의 속도로 14일간 종균배양 하였다. 배양한 균사체를 여과하여 homogenizer로 균질화 한 다음, 겉보리에 접종한 뒤 배양기에서 4주간 배양하였다. 열풍건조기에서 2일간 건조 후 중량대비 20배의 증류수로 55℃에서 2시간씩 3번 환류추출하여 열수 추출물을 얻었다. 에탄올 추출물은 중량대비 20배의 70% 에탄올로 실온에서 7일간 침지하여 추출하였다. 각각의 열수 및 에탄올 추출물을 rotary evaporator(Eyela, Japan)를 사용하여 50℃에서 감압농축하고, 이 농축액을 -80℃에서 동결 건조하여 제조하였다. 겉보리영지버섯 열수 및 에탄올 추출물의 최종 수율(yield)은 각각 열수 추출물이 17.69%, 에탄올 추출물이 25.77%이다. 건조된 열수 및 에탄올 추출물을 각각 증류수 및 70% 에탄올에 농도 10 mg/ml로 희석하여 본 발명에 따른 항산화 및 항염증 조성물을 제조하였다.
< 실험예 1>
겉보리영지버섯 추출물의 총 페놀 및 폴리페놀, 아스코르빅 산 함량 확인
총 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위해 Folin-Ciocalteu's 방법을 이용하였다. Standard인 Galic acid를 사용하였고, Standard 곡선을 획득하여 sample을 10mg/㎖의 농도로 제조 하여 0.04㎖를 96 well plate에 분주해준 뒤 Folin-Ciocalteu phenol reagent 0.02㎖와 Na2CO3(20%,w/v) 0.06㎖를 혼합하여 준다. 암실에서 30분간 반응을 시킨 후 ELISA reader를 이용해 700nm로 흡광도를 측정하였다. 측정 후 얻어진 페놀 농도에 Standard 곡선과 수율을 이용해 총 페놀 함량 값을 얻는다.
총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해 카테킨(catechin)을 사용하였고, Standard 곡선을 획득하여 sample을 10mg/㎖의 농도로 제조 하여 96 well plate에 0.025㎖를 분주 한 후 0.125㎖의 증류수로 희석하였다. 다음은 5% Sodium nitric(NaNO2) 0.008㎖를 첨가해주고 섞은 뒤 5분간 상온에서 반응시켰다. 그 후 10% alumium chloride 0.015㎖를 참가하여 섞어준 뒤 6분간 반응 후 1M Sodium hydroxide(NaOH) 0.05㎖와 0.027㎖의 DW를 첨가하여 잘 섞어 준 후 ELISA reader를 이용해 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험하여 얻어진 결과인 플라보노이드 농도에 standard 곡선과 수율을 통해 총 플라보노이드 함량 값을 얻었다.
아스코르빅 산 함량을 측정하기 위해 메타인산(metaphosphoric acid)을 10 ㎎/㎖ 농도로 1 ㎖를 만들었다. 여기에 각 시료를 10 ㎎를 첨가한 후 실온에서 45분간 반응시킨다. 45분 후 반응물을 필터를 이용하여 여과를 시키고 여과물 0.1 ㎖와 2,6-dichloroindophenol (0.05mM) 0.9 ㎖를 섞은 sample군과 여과물 0.1 ㎖와 증류수 0.9 ㎖를 섞은 Blank 군을 만든다. 96 well plate에 150ul씩 3번 분주하여 ELISA로 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 아스코르브산 측정(Ascorbic acid determination)을 구하기 위한 standard 곡선은 Ascorbic acid 1 ㎎/㎖를 최고 농도로 하여 총 8개의 농도를 각각 농도를 100 ㎕ 씩 따서 E-tube에 3회 분주하여 515 nm에서 흡광도를 측정하여 standard 곡선을 구한다. 이 standard 곡선과 시료의 수율을 통해 함량을 구하였다.
상기와 같이 겉보리영지버섯 추출물의 총 페놀성 화합물과 플라보노이드, 아스코르빅산 함량을 측정한 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 겉보리 영지버섯 열수 및 에탄올 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 각각 29.84㎎/100g과 53.43㎎/100g이고 총 플라보노이드 함량은 각각 10.32㎎/100g과 13.31㎎/100g이며, 아스코르빅산 함량은 각각 7.96㎎/100g과 19.33㎎/100g으로 나타났다.
확인 결과, 겉보리영지버섯 에탄올추출물에서 총 페놀성 화합물과 플라보노이드, 아스코르빅산 함량이 상당히 높음을 알 수 있었다.
Figure 112016118934401-pat00001
< 실험예 2>
겉보리영지버섯 추출물의 DPPH radical 소거능 측정
DPPH는 radical을 갖는 물질 중에서 비교적 안정한 화합물로 Et-OH에서 보라색으로 발색된다. 그러나 항산화 활성을 갖는 물질과 반응하면 항산화 활성물질이 DPPH radical을 소거시켜 그 색을 잃고 탈색되며 UV 측정 시 그 수치도 낮아진다.
또한 지방질 산화를 억제시키는 척도로 사용되고 있고, 활성 radical에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다. DPPH radical scavenging activity는 시료를 10mg/㎖를 DW 1㎖로 희석하여 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/㎖의 농도로 각각 1㎖씩 제조하고, standard로 사용되는 BHT 10mg/㎖를 methanol 1㎖로 희석하여서 동일 농도로 각각 1㎖씩 제조하였다. 농도별로 만든 sample과 BHT를 96 well plate에 각각 80ul씩 분주한 뒤 DW, methanol, DPPH 순서로 80ul씩 분주한 후 빛과 반응하지 못하게 foil로 감싸준 뒤 실온에서 30분간 방치한 후 ELISA reader를 이용해 517nm 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 겉보리영지버섯 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 2mg/ml에서 14.07% (GLHB-W), 30.15% (GLHB-E)로 나타났음을 알 수 있었다. 겉보리영지버섯은 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 더 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보임을 확인할 수 있었다(도 1A 참조). 한편, 양성대조군인 Ascorbic acid는 2mg/ml에서 96.61% 소거능을 보였다.
< 실험예 3>
겉보리영지버섯 추출물의 ABTS radical 소거능 측정
sample과 standard인 Ascorbic acid를 농도 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/㎖로 만들어 준 후 ABTS 용액 0.8㎖와 각각의 sample과 standard 0.2㎖를 큐벳(cuvette)에 혼합하여 준 뒤 5분간 반응 시킨 뒤 분광계에서 734nm로 측정하였다. 다음으로 Potassium persulphate 0.8㎖와 sample과 standard 0.2㎖를 큐벳에 혼합하여 준 뒤 바로 분광계에서 734nm로 측정하여 주고 ABTS 용액 0.8㎖와 DW 0.2㎖를 큐벳에 혼합하여 준 뒤 5분간 반응 시킨 뒤 분광계에서 734nm로 측정하였다.
또한 Potassium persulphate 0.8㎖와 DW 0.2㎖를 큐벳에 혼합하여 준 뒤 바로 분광계에서 734nm로 흡광도를 측정하였다. 이때. ABTS 계산법은 하기와 같다.
ABTS scavenging activity (%)={(C-D)-(A-B)/(C-D)}×100
그 결과, 겉보리영지버섯 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 농도 2mg/ml에서 45.65% (GLHB-W), 71.24% (GLHB-E)로 나타남을 확인할 수 있었다. 겉보리영지버섯은 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 더 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보임을 알 수 있었다(도 1B 참조). 한편, 양성대조군인 Ascorbic acid는 2mg/ml에서 101.5% 소거능을 보였다.
< 실험예 4>
겉보리영지버섯 추출물의 Nitrite 소거능 측정
Oyaizu의 방법에 따라 Sodium Phosphate buffer(PBS)와 1% 페리시안화칼륨(Potassium Ferricyanide) 2.5㎖를 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/㎖의 농도로 만든 sample과 standard인 BHT, Ascorbic acid 2.5㎖과 Control 2.5㎖에 각각 혼합시킨 후 50℃에서 20분 동안 인큐베이션해 준 뒤 반응이 끝난 혼합물을 각각 5㎖씩 따서 새 tube로 옮긴 뒤 여기에 Trichloroacetic acid(TCA) 2.5㎖를 첨가하여 센트리퓨지(centrifuge)에서 3,000rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 상층액 5㎖에 DW 5㎖와 염화 제2철(Ferric chloride) 1㎖를 첨가한 후 96well plate에 0.15㎖씩 분주 해준 뒤 ELISA reader를 이용해 700nm로 흡광도를 측정하였다.
확인 결과, 겉보리영지버섯 추출물의 Nitrite 라디칼 소거능은 농도 2mg/ml에서 10.92% (GLHB-W), 18.74% (GLHB-E)로 나타남을 알 수 있었다(도 1C 참조). 겉보리영지버섯은 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 더 높은 아질산염 소거능을 보임을 알 수 있었다. 한편, 양성대조군인 Ascorbic acid는 2mg/ml에서 58.27% 소거능을 보였다.
< 실험예 5>
겉보리영지버섯 추출물의 환원력 측정
Oyaizu의 방법에 따라 Sodium Phosphate buffer(PBS)와 1% Potassium Ferricyanide를 2.5㎖를 0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/㎖의 농도로 만든 sample과 standard인 BHT, Ascorbic acid 2.5㎖과 Control 2.5㎖에 각각 혼합시킨 후 50℃에서 20분 동안 인큐베이션해 준 뒤 반응이 끝난 혼합물을 각각 5㎖씩 따서 새 tube로 옮긴 뒤 여기에 Trichloroacetic acid(TCA) 2.5㎖를 첨가하여 센트리퓨지(centrifuge)에서 3,000rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 상층액 5㎖에 DW 5㎖와 염화 제2철(Ferric chloride) 1㎖를 첨가한 후 96well plate에 0.15㎖씩 분주 해준 뒤 ELISA reader를 이용해 700nm로 흡광도를 측정하였다.
겉보리영지버섯 추출물의 환원력 측정 실험으로 농도 0.25mg/ml에서 ascorbic acid 다음으로 겉보리영지버섯 에탄올추출물이 높은 환원력을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 1D 참조).
< 실험예 6>
겉보리영지버섯 추출물의 ROS 억제 정도 확인
본 발명자들은 겉보리영지버섯 추출물에 세포 내에서 산화 스트레스에 의해 발생하는 ROS 생성을 억제하는 효과가 있는지를 알아보기 위하여 RAW264.7 세포에 H2O2로 유도한 ROS 발생의 양을 측정하였다.
먼저, 겉보리영지버섯 추출물은 RAW264.7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 이용한 세포생존율을 평가하였다. 그 결과, 겉보리영지버섯 열수추출물의 세포생존율은 50 ㎍/㎖농도에서 86.55%, 에탄올추출물은 3000㎍/㎖농도에서 92.82%로 나타남을 알 수 있었다(데이터 미도시).
양성대조군(Positive control)에 비해 600μM H2O2를 1시간 처리한 음성 대조군(Negative control)의 세포간(intercellular) ROS 생성은 1.5배 증가하였으며, 겉보리영지버섯 에탄올추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 ROS 생성이 억제되었음을 알 수 있었다(도 2 참조).
따라서, 상기의 결과로 미루어 보아 겉보리영지버섯 에탄올추출물은 다양한 라디칼 소거능 뿐만 아니라 세포수준에서 H2O2로 유도된 산화적 스트레스에도 강한 억제능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
< 실험예 7>
겉보리영지버섯 추출물의 세포생존율 확인
본 발명의 도 3은 RAW 264.7 cell에 LPS(Lipopolysaccharide)를 1㎍/㎖와 겉보리영지버섯 추출물을 처리하여 MTT를 처리한 결과이다.
LPS는 그람 음성 세균 외막의 주성분으로 RAW 264.7의 표면 분자와 반응하게 되면, interleukin-1β(IL-1β)와 tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등의 전염증성 사이토카인(cytokine)의 발현이 유도되고, nitric oxide(NO), PGE2 등의 물질을 생성하게 하여 염증반응에 관여하게 된다.
본 발명에서는 겉보리영지버섯 추출물의 세포생존율을 확인하기 위하여 LPS를 처리하지 않은 control과 LPS 처리군을 비교하였을 때 세포의 생존율을 알아본 결과, LPS를 처리하였을 때 세포의 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 겉보리영지버섯 추출물과 LPS를 같이 처리한 군을 비교하였을 때 열수 추출물은 세포생존율이 감소하였으나 에탄올 추출물은 세포생존율이 증가하는 경향을 보임을 알 수 있었다(도 3 참조).
< 실험예 8>
겉보리영지버섯 추출물의 NO 억제 정도 확인
도 4는 Raw 264.7 cell에 LPS(Lipopolysaccharide)를 1㎍/㎖와 겉보리영지버섯 추출물을 처리하여 MTT를 처리한 결과이다.
NO는 항박테리아, 항종양 등의 효과를 나타낼 수 있지만, 병리적 원인에 의해 과도하게 생성되어 분비되면 염증을 유발하게 되고 과도한 혈관 확장에 의한 패혈성 쇼크 및 신경조직의 손상 등의 작용을 나타낼 수 있다고 알려져 있다.
본 발명자들은 겉보리영지버섯 추출물의 NO 억제 정도 확인하기 위하여 RAW 264.7 cell에 LPS를 처리하여 NO를 유도하였다. Control과 LPS 처리군을 비교하였을 때 NO생성량이 증가하였으며, 본 발명의 겉보리영지버섯 에탄올 추출물을 처리하였을 때는 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소함을 알 수 있었다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의 겉보리영지버섯 에탄올 추출물은 NO를 억제하는 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. (a) 영지버섯균사체를 배지에 배양하는 단계;
    (b) 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 배양하여 겉보리영지버섯 배양물을 수득하는 단계; 및
    (c) 겉보리영지버섯 배양물을 건조 후 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 겉보리영지버섯 추출물을 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계의 배양은 10 ~ 40℃의 온도에서 100 ~ 200rpm의 속도로 10 ~ 20일간 종균배양하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계의 배양은 10 ~ 40℃의 온도의 배양기에서 3 ~ 5주간 배양하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c)단계의 추출은 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  5. 삭제
  6. (a) 영지버섯균사체를 배지에 배양하는 단계;
    (b) 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 배양하여 겉보리영지버섯 배양물을 수득하는 단계; 및
    (c) 겉보리영지버섯 배양물을 건조 후 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 겉보리영지버섯 추출물을 포함하는 항산화 활성을 갖는 건강식품.
  7. (a) 영지버섯균사체를 배지에 배양하는 단계;
    (b) 배양한 영지버섯균사체를 겉보리에 접종한 후 배양하여 겉보리영지버섯 배양물을 수득하는 단계; 및
    (c) 겉보리영지버섯 배양물을 건조 후 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 겉보리영지버섯 추출물을 포함하는 항산화 활성을 갖는 건강기능식품.
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