KR101424175B1

KR101424175B1 - 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR101424175B1
Application number: KR1020120152716A
Authority: KR
Inventors: 윤광섭
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2014-08-01
Also published as: KR20140083224A

Abstract

본 발명은 유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 혼합하여 제조하는 단계를 포함하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출 혼합물을 함유하는 조성물은 항산화 활성이 증진되고 탈모방지 또는 발모촉진에 효과적이므로 기능성 식품의 소재로 다양한 분야에서 활용 가치가 있어, 산업적으로 매우 유용할 것으로 판단된다.

Description

검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법{Method for producing composition for preventing hair loss or stimulating hair growth with increased antioxidant ability and hair growth ability comprising extracts of black bean, hasuo, gamtae and sea tangle}

본 발명은 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 혼합하여 제조하는 단계를 포함하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

인간에서의 모발은 비록 생명에 관계되는 중요한 기능은 없으나, 사람의 인상 및 외모에 결정적인 영향을 미치기 때문에 관심의 대상이 되고 있다. 최근 고도화, 산업화되는 사회적 추세에 따라 사회 활동의 증가에 따른 과도한 스트레스, 생활 습관의 변화 등 탈모에 직·간접적으로 영향을 미칠 수 있는 사회 문화적인 요인들이 변화하면서 탈모 인구가 급격히 증가하고 있다. 뿐만 아니라, 최근에는 중년 남성뿐 아니라 젊은층과 여성층으로 탈모의 발생이 확대되고 있어 탈모의 다양한 원인을 분석하고 이를 해결하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

탈모는 원인이 다양한 만큼 이를 해결하기 위하여 사용하는 방법도 다양하다. 탈모를 방지하고 육모를 촉진하기 위해서 혈관을 확장시켜 모근에 영양 공급이 잘 이루어지도록 하거나, 모발의 구성 성분과 유사한 성분을 직접 모근에 공급하는 외용제나 건강보조 식품, 의약품 등이 출시되고 있다. 하지만, 화학약품의 사용으로 인하여 약물이상 반응(협심증, 피부병, 가려움증 등)이나 부작용에 대한 사례가 보고되어 있으며, 치료를 위하여 고가의 돈을 투자하지만 그만큼의 효과를 얻지 못하는 등의 문제점이 있다.

한편, 백발은 일반적으로 연령이 높아지면 발생하는 것으로, 노령이라는 느낌을 들게 하고, 특히 젊은 나이에 있어서 백발은 불청객이다. 그 때문에 백발을 감추기 위하여 염색 등에 의해 모발을 검게 염색하는 염색제가 많이 연구되고, 또한 널리 시판되고 있다. 그러나 흑발염색은 일시적인 방법으로 백발의 성장에 의해 다시 염색해야하는 번거로움이 있고, 현재 널리 사용되고 있는 산화형 흑발염색은 산화제 등의 사용에 의해 두피에 손상을 준다. 따라서 백발의 발생을 방지하는 백발방지제에 대해서도 각종 연구가 행해지고 있다. 또한 인체는 산화과정을 거치면서 노화가 진행되는데 탈모는 노화의 진행이므로 항산화에 대한 치료가 이루어져야 하며, 여러 요인에 의한 생체 내에서의 스트레스와 염증이 모발의 생장에 어려움을 주는 것으로 알려져 있어 항염증에 관한 연구도 이루어지고 있다(Jones et al., 2007 J Exp Bot 58, 1261).

본 발명에서는 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마의 추출물을 이용하여 발모 효능을 측정하고 발모 및 탈모 방지 효과 이외에도 건강 기능성 및 흑모 효과를 측정하고자 하였다.

검은콩은 단백질의 주 공급원으로 모발 성장에 필수 성분인 시스테인(cysteine)이 함유되어 있어 탈모를 방지하는 데도 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 다량의 단백질 외에도 레시틴(lecithin), 피토에스트로겐(phytoestrogen), 불포화지방산, 안토시아닌(anthocyanins) 등이 함유되어 있어 항산화 작용, 항암작용, 항비만 작용, 에스트로겐 활성 작용, 면역조절 작용 등 다양한 약리 작용을 나타낸다.

하수오(polygonum multiflorum Thunb)는 마디풀과(polygonaceae)에 속하는 덩이뿌리로 인삼, 구기자와 함께 3대 정력초로 불리며 자양강장약으로 오래 살게 하는 약초로 이름이 높다. 또한 정력과 기를 보호하고 머리를 검게 해주며 간장의 기능을 좋게 하여 피곤함을 없애고 뇌를 튼튼하게 하며 혈을 보충하고 신경쇠약이나 불면증에도 효과가 있다.

또한 감태(Ecklonia cava Kjellman)는 비식용 해조류로 갈조 식물 다시마목(Laminariales) 미역과의 식물로서 우리나라에서는 주로 제주연안 수심 10m 내외에서 서식하고 있다. 감태는 식용 해조류로서 항산화성, 항암성, 항고혈압성 등 여러 가지 기능들이 밝혀져 있고, 새로운 기능성 소재로서 충분한 가치가 있는 것으로 보고되고 있다. 특히, 감태의 주요 성분인 플로로탄닌(phlorotannin)은 플로로글루시놀(phloroglucinol)을 기본 구성단위로 하는 폴리페놀화합물로서, 플로로탄닌은 혈전생성 저해활성, 항산화활성, 심혈관 보호효과 및 항바이러스활성 등을 나타낸다고 보고된 바 있다.

또한 다시마는 갈조류에 속하는 해조류로서 다시마에 풍부하게 들어 있는 칼슘은 뼈 및 이를 구성하는 주요 요소이며, 체내에서 칼슘활동을 증진시켜주는 마그네슘 역시 풍부하게 들어있어 뼈 및 이를 강화시키는데 효과적이다. 다시마에는 머리카락을 구성하는 단백질, 비타민, 요오드, 아연, 유황, 칼슘, 철분 등이 다량 함유되어 있고 모발 발육 촉진제의 역할을 하는 옥소라는 성분도 함유되어 있기 때문에 탈모 치료에도 효과적이다.

한편, 한국등록특허 제1206998호에는 '탈모방지 및 발모용 두피 케어 조성물 및 이를 이용한 헤어 제품'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1085948호에는 '발모촉진용 조성물과 그 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 혼합하여 제조한 추출 혼합물이 항산화 활성을 증가시키고, 비듬균 활성을 저해시키며 멜라닌 생성량을 증가시키는 것을 확인하였다. 이 때 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물의 최적 혼합 비율을 결정하여, 항산화 활성이 증진되고 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법을 완성함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 혼합하여 제조하는 단계를 포함하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물의 혼합물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출 혼합물은 천연재료로부터 얻어진 물질로 세포독성이 없으며, 다양한 산화적 스트레스로부터 신체를 보호할 수 있는 항산화 효과가 뛰어나고, 비듬균의 활성을 저해시키며 멜라닌 생성량을 증가시켜 발모 효능이 뛰어나다. 따라서 본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출 혼합물을 함유하는 조성물은 항산화 활성이 증진되고 탈모방지 또는 발모촉진에 효과적이며 기능성 식품의 소재로 다양한 분야에서 활용 가치가 있으므로, 산업적으로 매우 유용할 것으로 판단된다.

도 1은 검은콩(Black bean), 하수오(Hasuo), 감태(Gamtae) 및 다시마(Sea tangle)의 추출 혼합물인 GS(Gamtae:Sea tangle, 1:1, w/w), GSH(Gamtae:Sea tangle:Hasuo, 1:1:1, w/w), GSB(Gamtae:Sea tangle:Black bean, 1:1:1, w/w), GSHB(Gamtae:Sea tangle:Hasuo:Black bean, 1:1:1:1, w/w)의 (A) ABTS 라디칼 소건능(radical scavenging ability, RSA), (B) 전자공여능(electron donating ability, EDA) 및 (C) 환원력(reducing power)을 나타낸다. 값은 3회 반복 시험값의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 막대의 다른 첨자(a-c)는 유의차를 나타낸다(p＜0.05).
도 2는 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마의 추출 혼합물인 GS, GSH, GSB 및 GSHB의 (A) 지질산패억제능(Thiobarbituric acid reactive, TBARS) 및 (B) 잔틴 산화효소 억제활성(xanthine oxidase inhibitory activity)을 나타낸다. 값은 3회 반복 시험값의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 막대의 다른 첨자(a-c)는 유의차를 나타낸다(p＜0.05).
도 3은 비듬균 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur)에 대한 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마의 추출 혼합물인 GS, GSH, GSB 및 GSHB의 항균 활성을 나타낸다. (a) 6% 추출물, (b) 8% 추출물, (c) 2% 추출물, (d) 4% 추출물.
도 4는 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마의 추출 혼합물인 GS, GSH, GSB 및 GSHB의 농도별 자극에 따른 NIH3T3 세포의 성장(A) 및 GS, GSH, GSB 및 GSHB에 의한 B16 멜라노마 세포의 멜라닌 생성량(B)을 나타낸다. 값은 3회 반복 시험값의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 막대의 다른 첨자(a-c)는 유의차를 나타낸다(p＜0.05).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 혼합하여 제조하는 단계를 포함하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에서, 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올,에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르,클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다.

상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출액을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 바람직하게는,

(a) 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 각각에 65~75% 에탄올을 첨가하여 55~65℃에서 2~4시간씩 3회 반복 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 에탄올 추출물 각각을 감압농축시킨 후 동결건조하는 단계; 및

(c) 유효성분으로 상기 (b)단계의 동결건조된 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 동일 중량비율로 혼합하여 제조할 수 있고,

가장 바람직하게는,

(a) 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 각각에 70% 에탄올을 첨가하여 60℃에서 3시간씩 3회 반복 추출하는 단계;

(c) 유효성분으로 상기 (b)단계의 동결건조된 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 동일 중량비율로 혼합하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물의 혼합물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있고, 바람직하게는 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 각각에 65~75% 에탄올을 첨가하여 55~65℃에서 2~4시간씩 3회 반복 추출할 수 있고, 더욱 바람직하게는 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 각각에 70% 에탄올을 첨가하여 60℃에서 3시간씩 3회 반복 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 각각의 에탄올 추출물은 혼합물 중에 동일 중량비율로 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 포함하는 조성물은, 약학 조성물로 제조될 수 있고, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 팩제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 탈모 부위의 도포, 복강 내 투여, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 포함하는 조성물은, 식품 첨가 조성물로 제조될 수 있고, 상기 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.

상기 외에 본 발명의 유효성분은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 유효성분은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 유효성분 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1) 균주 및 세포

실험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받은 말레세지아 퍼퍼(Malessezia furfur) KCCM 12679를 사용하였으며 세포는 한국세포주은행에서 분양받은 NIH3T3 세포(ATCC, manassas, VA, 미국) 및 B16 멜라노마(melanoma) 세포(ATCC CRL 6323)를 사용하였다.

2) 재료 및 추출물 제조

본 발명에 사용된 검은콩은 ㈜정우당에서 구입하였으며, 하수오는 ㈜해성당, 감태는 완도바다식품, 다시마는 금일 수산에서 제공받은 것을 사용하였다. 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마를 추출하기 위하여 70% 에탄올을 사용하였다. 환류 냉각관을 부착시키고 시료 100g에 70% 에탄올 800㎖을 첨가하여 60℃의 맨틀 상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 Whatman No. 1 여과지로 여과하였다. 다음 회전식 감압농축기(rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, 일본)로 감압농축한 후에 동결건조기(FD SFDSM12, Samwon, 한국)를 이용하여 동결건조된 분말을 제조하였다. 동결건조된 분말 시료는 -50℃에 보관하였다. 각 추출물의 수율은 추출액을 동결 건조시켜 건물 중량을 구한 후, 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 계산하였다.

3) 추출 혼합물의 제조

70% 에탄올로 추출하여 동결 건조한 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 동일 중량비율로 혼합하여 추출 혼합물을 제조하였다. 감태(Gamtae) 및 다시마(Sea tangle) 추출물(GS)을 1:1(w/w), 감태, 다시마 및 하수오(Hasuo) 추출물(GSH)을 1:1:1(w/w), 감태, 다시마 및 검은콩(Black bean) 추출물(GSB)을 1:1:1(w/w), 감태, 다시마, 하수오 및 검은콩 추출물(GSHB)을 1:1:1:1(w/w)로 혼합하여 제조하였으며, 추출 혼합물의 항산화 활성 및 발모효능을 측정하였다. 제조된 각 혼합물을 4℃ 냉장고에 보관하였고, 실험 직전에 일정 농도로 증류수에 용해하여 사용하였다.

4) 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(Dewanto et al., 2002 J Agric Food Chem 50, 3010-3014)의 방법에 따라 시약 100㎕에 2% 소듐 카보네이트 2㎖ 및 50% Folin-Ciocalteu 시약 100㎕를 첨가한 후 720nm에서 흡광도를 측정하였으며, 갈산(gallic acid, Sigma-Aldrich Co., 미국)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.

5) ABTS 라디칼 소거능 ( radical scavenging ability ) 측정

Re(Re R, 1999 Free Radic Biol Med 26, 1231-1237)의 방법에 따라 7.4mM ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt] 및 2.6mM 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 혼합하여 실온 및 암소에 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시켰다. 그 후 실험 직전에 ABTS 용액을 732nm에서 흡광도가 0.700±0.030이 되도록 PBS 버퍼(pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 희석된 용액 950㎕에 시료 50㎕를 가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732nm에서 흡광도를 측정하였다. 계산식 ABTS 라디칼 소거능(ABTS radical scavenging ability, %)=100-[(시료 O.D./대조군 O.D.)x100]에 의하여 활성을 산출하였다.

6) 전자공여활성( electron donating ability ) 측정

Blois(Blois MS, 1958 Nature 26, 1199-1200)의 방법에 따라 시료 0.2㎖에 0.4mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 용액 0.8㎖을 첨가하여 볼텍싱하고 10분간 방치하였다. 그 후 525nm에서 흡광도를 측정하였으며, 계산식 전자공여활성(electron donating ability, %)=100-[(시료 O.D. / 대조군 O.D.)x100]에 의하여 활성도를 산출하였다.

7) 환원력( reducing power ) 측정

환원력 측정을 위하여 시약 1㎖에 0.2M 인산완충액(phosphate buffer, pH 6.6) 2.5㎖ 및 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 용액 2.5㎖을 첨가한 후 50℃에서 30분간 반응시켰다. 다음에 10% TCA(trichloroacetic acid) 용액 2.5㎖을 첨가한 후 1,650 x g에서 10분간 원심분리 하였으며, 상층액 2.5㎖에 증류수 2.5㎖ 및 0.1% FeCl₃ 용액 0.5㎖을 첨가한 후 700nm에서 흡광도를 측정하였다.

8) TBARS ( Thiobarbituric acid reactive substances ) 측정

TBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)는 Buege 등(Buege et al., 1978 Methods Enzymol 52, 302-310)의 방법에 따라 측정하였다. 피쉬 오일(Fish oil) 0.5㎖을 함유하는 0.1M 말레산 버퍼(maleic acid buffer, pH 6.5) 8㎖ 및 50㎕의 트윈-20을 혼합하여 제조한 피쉬 오일 유화액(emulsion) 0.5㎖에 FeCl₂ 및 CuSO₄ _·5H₂O를 Fe² ⁺및 Cu² ⁺양으로 50ppm이 되게 한 용액 0.1㎖와 추출물 1㎖ 및 증류수 1㎖을 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 7.2% BHT(dibutylhydroxytoluene) 50㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 다음에 35% TCA 및 0.75% TBA를 1㎖씩 가하여 100℃ 수욕 상에서 15분간 가열한 다음 3,000rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 상층액의 흡광도를 531nm에서 측정하여 계산식 TBARS(%)=100-[(시료 O.D./대조군 O.D.)x100]에 의하여 산출하였다.

9) 잔틴 산화효소( Xanthine oxidase ) 저해활성 측정

Stirpe 등(Stirpe et al., 1969 J Biol Chem 244, 3855-3862)의 방법에 따라 시료 0.1㎖ 및 0.1M PBS(pH 7.5) 0.6㎖ 에 2mM 잔틴(xanthine) 기질액 0.2㎖을 첨가하고 잔틴 산화효소(xanthine oxidase, 0.2 U/㎖) 0.1㎖을 첨가하였다. 그 후 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1N HCl 1㎖을 첨가하여 반응을 종결시키고, 반응액 중에 생성된 요산(uric acid)의 양을 292nm에서 흡광도로 측정하였다. 계산식 잔틴 산화효소 저해활성(xanthine oxidase inhibitory activity, %)=100-[(시료 O.D. / 대조군 O.D.)x100]에 의하여 활성을 산출하였다.

10) 비듬균 활성 저해능

각 시료 추출물들의 항균활성을 측정하기 위해 먼저 비듬균인 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur) ATCC 12679를 피티로스포룸(pityrosporum) 액체 배지에 접종하여 37℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 약 3일 동안 배양하였다. 상기 배양액 0.1㎖을 다시 피티로스포룸 평판 배지에 균일하게 도말하고, 상기 평판 배지 위에 지름 6mm 페이퍼 디스크(paper disc)를 놓은 후 시료 추출물을 각 농도별로 50㎕씩 분주하였다. 그 후 37℃에서 12시간 배양하고, 디스크 주위에 나타난 투명 부위(clear zone)를 확인하여 항균성을 분석하였고 투명 부위의 직경을 측정하였다.

11) 모세 혈관 확장 효과

모세 혈관 확장 효과는 NIT 3T3 세포(ATCC, Manassas, VA, 미국)를 이용하여 K⁺ 채널 오프닝(channel opening)을 간접적으로 평가하는 방법을 이용하였다. 세포 배양에 사용한 배지는 10% FCS(fetal calf serum, Hyclone)를 포함하며 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지를 기본 배지로 사용하였고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. NIH3T3 세포를 24웰 플레이트에 한 웰당 1x10⁴개씩 분주하여 10% FCS가 들어있는 배지에서 약 24시간 배양하였다. 그 후 5% FCS가 포함된 새로운 배지에 추출물의 최종 농도가 1mg/㎖이 되도록 희석하여 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 세포의 증식은 cell counting kit(CCK-8; Dojindo Molecular Tech, Kumamoto, 일본)를 이용하여 평가하였다.

12) 멜라닌 생성량 측정

흑모 생성 촉진 효과를 검정하는 방법으로서, B16F1 멜라노마에 대한 멜라닌 생성율을 측정하여 흑모 생성 촉진 효과를 판단하였다. 세포주는 B16 멜라노마 세포를 사용하였으며, 멜라닌 함량 측정을 위하여 B16F1 흑색종 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 6웰 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰이 되도록 분주하여 5% CO₂ 및 37℃ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 시료를 농도별로 배지에 희석하여 교체한 후, 최종 200mM α-MSH가 되도록 첨가하여 48시간 동안 추가로 배양하였다. 시료를 첨가하지 않고 α-MSH만 첨가한 것을 대조군으로 사용하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 첨가한 후 50℃ 항온조에서 세포 내 멜라닌을 용해시켰다. 상기 용액을 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준 정량 곡선을 이용하여 멜라닌 양을 측정하였으며, 총 단백질로 보정하였다.

13) 통계처리

모든 실험은 3회 반복으로 수행하여 평균치 및 표준편차로 나타내었고, 유의성 검증은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, version 12, SPSS Inc., Chicago, IL, 미국)의 소프트웨어 패키지 프로그램을 이용하여 Duncan's multiple range 테스트 및 t-테스트를 수행하였다.

실시예 1. 추출 혼합물의 총 폴리페놀 함량

검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물의 항산화 효능 및 발모 효능을 평가한 결과, 높은 항산화 효능 및 발모 효능을 확인할 수 있었다. 하지만 각각의 시료에서 모두 높은 항산화 활성 및 발모 효능을 나타내지는 않았다. 따라서 이들을 혼합함으로써 시너지 효과를 통해 높은 항산화 효능 및 발모 효능을 가지는 혼합물의 품질 특성을 측정하고자 하였다.

검은콩(Black bean), 하수오(Hasuo), 감태(Gamtae) 및 다시마(Sea tangle) 추출물을 동량으로 혼합하여 감태:다시마(GS, 1:1, w/w), 감태:다시마:하수오(GSH, 1:1:1, w/w), 감태:다시마:검은콩(GSB, 1:1:1, w/w), 감태:다시마:하수오:검은콩(GSHB, 1:1:1:1, w/w)의 혼합물을 제조하였으며 추출 혼합물의 배합비는 표 1에 나타내었다. 혼합물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 표 2에 나타내었다.

감태:다시마:하수오:검은콩의 추출 혼합물(GSHB), 감태:다시마:하수오의 추출 혼합물(GSH), 감태:다시마:검은콩의 추출 혼합물(GSB) 및 감태:다시마의 추출 혼합물(GS)의 총 폴리페놀 함량은 각각 9.88mg/g, 9.40mg/g, 7.80mg/g 및 6.25mg/g으로, 4가지 시료를 모두 섞은 GSHB 추출 혼합물에서 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타내는 것을 확인하였다.

¹⁾GS, 감태:다시마(1:1, w/w); GSH, 감태:다시마:하수오(1:1:1, w/w); GSB, 감태:다시마:검은콩(1:1:1, w/w); GSHB, 감태:다시마:하수오:검은콩(1:1:1:1, w/w)

²⁾값은 3회 반복 시험값의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

³⁾행의 다른 첨자(a-d)는 유의차를 나타낸다(p＜0.05).

실시예 2. 추출 혼합물의 ABTS 라디칼 소거능 , 전자공여능 및 환원력

검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출 혼합물의 혼합 농도에 따른 항산화 활성을 측정하기 위하여 ABTS 라디칼 소거능(ABTS radical scavenging ability), 전자공여능(electron donating ability) 및 환원력(reducing power)을 측정하였다. 그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, ABTS 라디칼 소거능 및 전자공여능은 모두 추출물의 혼합 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 각 재료의 단일 추출물보다 추출 혼합물에서 활성이 다소 증가하였다. ABTS 라디칼 소거능은 감태:다시마:하수오:검은콩의 추출 혼합물(GSHB)이 98.80%로 가장 높은 활성을 나타내었다. 전자공여능 또한 폴리페놀의 함량이 높았던 감태:다시마:하수오:검은콩의 추출 혼합물(GSHB) 10mg/㎖에서 41.45%로 가장 높은 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능은 전자공여능 보다 훨씬 낮은 혼합 농도에서도 강한 활성을 보여주었는데, 이는 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성 간의 상관 관계에 의한 것으로 판단된다.

환원력을 발휘하는 물질은 전자공여체로 작용하며, 지질과산화 과정에서 중간 생성물의 형성을 감소시켜 2차적인 항산화제 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 혼합 농도 10mg/㎖에서 환원력을 측정한 결과, 감태:다시마:하수오:검은콩의 추출 혼합물(GSHB)이 0.71 및 감태:다시마:하수오의 추출 혼합물(GSH)이 0.72로 두 혼합물 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 상기 결과를 바탕으로, 추출 혼합물의 환원력 또한 시료 중 총 페놀 화합물의 함량에 기인한 것으로 사료된다.

실시예 3. 추출 혼합물의 지질산패억제능 및 잔틴 산화효소 억제활성

최근 불포화 지방산을 다량 함유한 음식물의 소비가 늘어가는 추세에 따라 지방산의 산화를 방지하기 위한 항산화제의 중요성이 증가하고 있다. TBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)는 지질과산화물의 분해로 생성된 알데히드(aldehyde)의 생성 정도를 나타내는 지표로서, 수치가 높을수록 지질과산화물의 생성 정도가 높음을 의미한다. 추출 혼합물의 TBARS 수치를 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 혼합 농도에서 감태:다시마:하수오:검은콩 추출 혼합물(GSHB)의 활성이 가장 높게 나타났다. 또한, 혼합 농도 5mg/㎖ 및 10mg/㎖의 농도에 따라 감태:다시마:하수오 추출 혼합물(GSH)이 15.45% 정도 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 인체에서 지질과산화를 억제하고 항산화 효소 활성을 증가시키는데 효과적인 하수오에 의한 영향인 것으로 판단된다.

잔틴 산화효소(Xanthine oxidase, XO)는 퓨린(purine) 대사에 관여하는 효소로써 잔틴(xanthine) 또는 하이포잔틴(hypoxanthine)의 산소를 떼어내면서 과산화수소(H₂O₂)를 생성하고, 나머지 골격이 요산(uric acid)을 형성하여 혈장 내에 과량 존재하게 되면 골절에 축적되어 심한 통증을 유발하는 통풍과 신장에 침착되어 신장질환을 일으키는 효소로 알려져 있다. 잔틴 산화효소 저해 활성 측정 결과, 1 mg/㎖의 농도에서 감태:다시마:하수오:검은콩의 추출 혼합물(GSHB) > 감태:다시마:검은콩의 추출 혼합물(GSB) > 감태:다시마:하수오의 추출 혼합물(GSH) > 감태:다시마의 추출 혼합물(GS)의 순으로 나타났다. 상기 결과는 식물계에 존재하는 페놀성 물질의 생리활성이 하이드록시(hydroxy)기의 위치에 따라 각종 효소의 저해 효과가 다르기 때문인 것으로 판단된다.

실시예 4. 비듬균 활성 저해능

검은콩, 하수오, 감태, 다시마의 추출물을 등량으로 혼합한 추출 혼합물의 비듬균 활성 저해능을 페이퍼 디스크(paper disc) 방법으로 측정한 결과는 도 3에 나타내었다. 각 시료 추출물을 8%, 6%, 4% 및 2%로 제조하여 혼합한 후, 농도별 항균 활성을 측정하였다. 비듬균 활성 저해능은 모든 구간의 8%, 6%, 4%의 농도에서 투명 부위(clear zone)를 형성하는 것을 확인할 수 있었으며, 농도 의존적으로 직경의 크기는 증가하였다.

상기 결과로서 감태 추출물이 비듬균 활성 저해능에 대한 활성이 우수한 것을 확인하였고, 감태 추출물의 항균 활성은 세제나 천연 항생제, 발모제 등의 다양한 항균 활성 소재 개발에 있어서 그 가치가 상당할 것으로 판단된다.

실시예 5. 모세혈관 확장효과 및 멜라닌 생성량 측정

검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출 혼합물의 모세혈관 확장 효과 및 멜라닌 생성량을 측정한 결과는 도 4에 나타내었다. 모세혈관 확장 효과 평가 결과, 농도에 따라 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, NIH 3T3 세포에 대한 저해능은 나타나지 않았다. 또한 멜라닌 생성량은 대조군(100%)에 비하여 모든 시료에서 높은 함량을 나타내었고, 감태:다시마:하수오:검은콩 추출 혼합물(GSHB)의 멜라닌 생성량이 118.86%로 가장 높았으며, 감태:다시마 추출 혼합물(GS)이 116.84%, 감태:다시마:검은콩 추출 혼합물(GSB)이 112.22% 및 감태:다시마:하수오 추출 혼합물(GSH)이 101.66%를 나타내었다.

종합적으로 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마의 시너지 효과를 위하여 이들을 동량으로 혼합한 결과, 항산화 활성이 우수하여 탈모를 유발하는 원인이 되는 산화적 스트레스를 효과적으로 감소시키는 효과를 확인하였고, 이로 인해 탈모 예방에 효과적일 것으로 판단되며, 비듬균 활성 저해능 및 멜라닌 생성량에 대한 활성을 확인하였다. 따라서 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마의 추출 혼합물은 산화적 스트레스 및 비듬균에 의한 탈모 방지 및 흑모 효과를 가지며, 건강 기능성이 높은 우수한 탈모 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

(a) 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 각각에 65~75 부피% 에탄올을 첨가하여 55~65℃에서 2~4시간씩 3회 반복 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 에탄올 추출물 각각을 감압농축시킨 후 동결건조하는 단계; 및
(c) 유효성분으로 상기 (b)단계의 동결건조된 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 동일 중량비율로 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법.
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유효성분으로 검은콩, 하수오, 감태 또는 다시마 각각에 65~75 부피% 에탄올을 첨가하여 55~65℃에서 2~4시간씩 3회 반복 추출하고 감압농축시킨 후 동결건조된 검은콩, 하수오, 감태 및 다시마 추출물을 동일 중량비율로 혼합한 혼합물을 함유하는 항산화 효능 및 발모 효능이 증진된 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
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