KR102087165B1

KR102087165B1 - 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102087165B1
Application number: KR1020180050926A
Authority: KR
Inventors: 이민원
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-05-02
Also published as: KR20190126684A

Abstract

본 발명은 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 항산화, 항염증 효과를 비롯하여 일산화 질소(nitric oxide, NO) 생성 억제, 및 IL-6 또는 TNF-α 사이토카인 분비 억제 효과가 있으며, 효소 가수분해하지 않은 오가피 추출물에 비하여 항산화 및 항염 효과가 더 우수함을 확인하였다. 따라서 부작용이 거의 없는 천연물인 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 항산화, 항염, 및 근골동통 치료제, 건강기능성 식품 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for Anti-oxidative or Anti-inflammatory comprising extract processed by Enzymatic hydrolysis of the Bark of Eleutherococcus sessiliflorus}

본 발명은 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Eleutherococcus 종은 시베리아 인삼, "touch-me-not", 악마의 관목, 가시 오가피(prickly eleutherococcus), 및 야생 고추(wild pepper)로 일반적으로 알려져 있다. E. sessiliflorus는 뿌리-껍질과 줄기-껍질, 원통형 또는 반원형, 길이 5 ~ 10cm, 지름 5 ~ 8mm, 두께 1mm이며, 바깥 쪽 표면은 황갈색에서 암회색으로 평평해지고 줄기 껍질이나 자국에는 가시가 있다. 안쪽 표면은 황백색이며 쉽게 부러지며 섬유질이다. 가지는 뿌리 부근에서 넓게 퍼지며 작은 가지는 담갈색이며 털이 없고 거의 보이지 않는다. 잎은 손바닥 같은 잎, 3~5개의 작은 잎과 난(ovate)형이다. 톱니 모양의 가장자리가 있으며 톱니가 녹색이며 등은 연한 녹색이며 잎맥 위에 가는 털이 있고 잎자루는 길이가 3~10cm이다. 꽃은 가지의 끝에 붙은 붉은 꽃이다. 꽃잎은 자주색이며 꽃받침은 삼각형이다. 꽃잎은 타원형이며 5개가 끝까지 결합되어 있다. 열매는 베리(berries)이며 둥글게 모여 있다. 이는 검은 색으로 익으며 그것은 식용 가능하다. 개화기는 8월에서 9월 사이이고, 10월에 만발한다.

오갈피 나무(Eleutherococcus sessiliflorus;Rupr. & Maxim.)는 낙엽 관목으로, 두릅나무과 및 다년생 종 E. sessiliflorus이며 주로 한국, 일본, 중국 등 동북 아시아에 분포한다. 뿌리의 피질 조직은 주로 진통제, 소염제, 해열제 및 이뇨 작용을 위해 의약 용도로 사용된다. 오래된 잎도 말린 다음 차 대용으로 사용한다. 많은 종류의 Eleutherococcus는 자연 서식지에서 과도한 상업적 수확으로 인해 위협을 받고 있는 종으로 기록되고 있다. 뿌리 수확시에는 Eleutherococcus의 식물을 베어 버려야 하고, 18개월 이상은 접합체 배아의 성숙과 발아 모두에 필요하기 때문에 씨앗을 사용하여 식물을 번식시키는 것은 어렵다.

하지만, 오갈피 속 식물은 전통적으로 그 줄기와 뿌리를 이용하여 진정 및 류머티즘에 치료하는 강장제, 당뇨병, 위궤양, 고혈압, 간 질환, 심장질환 등에 사용 되어지고 있다. 최근까지 오갈피 속 식물에 대한 많은 연구들은 줄기, 잎, 열매를 위주로 진행되어 왔으며 줄기 껍질에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다.

김지현 외,　Caffeic Acid의 항산화 활성 및 Amyloid beta와 LPS에 의한 C6 Glial 세포의 산화적 스트레스 보호 효과. 생약학회지 46권2호 109-115(7pages), 2015년 06월

본 발명자들은 종래의 문제점을 극복하기 위하여, 오가피 수피로부터 추출물을 얻고 효소 가수분해하여 획득한 오가피 효소 가수분해 추출물(E. sessiliflorus 효소 가수분해 추출물; EES)이 현저히 향상된 항산화, 항염증 효과를 나타냄을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 카페산(caffeic acid), 팔카린디올(falcarindiol), 파르네솔(farnesol), 리놀레산(linoleic acid), 아칸토사이드 B(acanthoside B), 및 아칸토사이드 D(acanthoside D)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거 활성, 또는 니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitrotetrazolium Blue chloride, NBT) 수퍼옥사이드(superoxide) 소거 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 일산화 질소(nitric oxide, NO) 생성 억제; 또는 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6) 또는 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α) 사이토카인 생산을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은, 오가피 수피를 환류 추출한 후 농축하여 오가피 추출물을 수득하는 단계; 상기 수득된 오가피 추출물, 효소, 및 증류수를 혼합한 후, 효소 가수분해하여 오가피 효소 가수분해 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 수득된 오가피 효소 가수분해 추출물의 효소를 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 효소는 배당체에 결합한 당을 분해하는 효소일 수 있다.

본 발명에 따른 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 항산화, 항염증 효과를 비롯하여 일산화 질소(nitric oxide, NO) 생성 억제; 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6) 또는 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α) 사이토카인 분비 억제 효과가 있으며, 효소 가수분해하지 않은 오가피 추출물(E. sessiliflorus; ES)에 비하여 항산화와 항염 효과가 더 우수함을 확인하였다. 따라서 부작용이 거의 없는 천연물인 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 항산화, 항염, 및 근골동통 치료제, 건강기능성 식품 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 화합물 1~6의 추출 및 분리 과정을 나타낸 플로우차트이다.
도 2는 본 발명의 오가피(Eleutherococcus sessiliflorus;ES)와 EES의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 분리된 화합물 1의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600MHz, DMSO+D2O)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 분리된 화합물 2의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600MHz, CDCl3)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 분리된 화합물 3의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 화합물 3의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600MHz, CDCl3)을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 분리된 화합물 4의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 화합물 4의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600MHz, CDCl3)을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 분리된 화합물 5의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 화합물 5의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600MHz, CD3OD + D2O)을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물(EES)로부터 분리된 화합물 6의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 화합물 6의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600MHz, Pyridine-d5)을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 항산화 활성을 측정하기 위한 경로(pathway)로 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거 활성과 니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitrotetrazolium Blue chloride, NBT) 수퍼옥사이드(superoxide) 소거 활성의 측정을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물의 항산화 효과 검증방법 중 하나인 DPPH 라디칼 소거 활성 측정법의 DPPH 반응을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 항산화 효과 검증방법 중 하나인 NBT 수퍼옥사이드(superoxide) 소거 활성 측정법의 NBT 반응을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 항산화 효과 검증 중 하나인 DPPH 라디칼 소거 활성의 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 NBT 수퍼옥사이드 소거 활성 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생산 억제 활성의 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 RAW 264.7 대식세포에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)의 실험 과정을 나타낸 것이다.

본 발명자들은 천연물 유래의 항산화 및 항염증 치료제 개발을 위해 예의 연구한 결과, 아직 연구가 미비한 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물의 항산화 및 항염 활성 효과가 효소 가수분해하지 않은 오가피 추출물에 비하여 현저하게 뛰어남을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 많은 종류의 오갈피(Eleutherococcus) 속이 자연 서식지에서 과도한 상업적 수확으로 인해 위협을 받고 있는 종으로 기록되고 있고, 뿌리 수확시에는 오갈피 속의 식물을 베어 버려야 하고, 18 개월 이상은 접합체 배아의 성숙과 발아 모두에 필요하기 때문에 씨앗을 사용하여 식물을 번식시키는 것은 어렵다는 사실을 확인하였다. 하지만, 오갈피 속 식물은 전통적으로 그 줄기와 뿌리를 이용하여 진정 및 류머티즘에 치료하는 강장제, 당뇨병, 위궤양, 고혈압, 간 질환, 심장질환 등에 사용되어지고 있다. 또한 최근까지 오갈피 속 식물에 대한 많은 연구들은 줄기, 잎, 열매를 위주로 진행되어져 왔으며 줄기 껍질에 대한 연구는 아직 미비한 실정이라는 사실을 확인하였다.

본 발명자들은 효소 분해가 배당체에 결합한 당을 분해하여 비당체로 만들어지며, 일반적으로 비당체가 생리활성 측면에서 배당체보다 더 뛰어난 효과를 기대하고, 이에 기초하여 본 발명을 시작하였다.

본 발명자들은 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물의 준비한 후(실시예 1 참조), 상기 효소 가수분해 추출물의 항산화 활성을 확인한 결과, 상기 효소 가수분해 추출물이 효소 가수분해하지 않은 오가피 추출물에 비하여 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 또는 NBT 수퍼옥사이드 소거 활성이 더 우수함을 확인하였다(실험예 1 참조). 또한, 상기 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물의 항염증 활성을 확인한 결과, 상기 추출물이 NO 생산에 대한 억제 활성 또는 사이토카인 생산 억제 활성이 우수함을 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명에 있어서, 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물은 간단하게는 오가피 수피를 환류 추출한 후 농축하여 오가피 추출물을 얻어내고, 상기 오가피 추출물, 효소, 및 증류수를 혼합한 후, 효소 가수분해하여 오가피 효소 가수분해 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 수득된 오가피 효소 가수분해 추출물의 효소를 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 수득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 있어서, 상기 효소 가수분해 추출물은 항산화제, 항염증제, 근골동통의 예방 또는 치료, 또는 건강기능식품의 용도를 제공한다.

본 명세서에 있어서, '효소 가수분해'는 일반적으로는 효소가 물 성분을 첨가하여 분자결합의 절단을 촉진시키는 과정을 의미한다. 또한, 효소 분해가 배당체에 결합한 당을 분해하여 비당체로 만들어지며, 일반적으로 비당체가 생리활성 측면에서 배당체보다 더 뛰어난 효과를 나타냄을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항산화 또는 항염증용 조성물은 항산화 또는 항염증 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 항산화 또는 항염증용 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, '약제학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/ 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/ 또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 항산화 또는 항염증용 조성물은 건강기능식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 건강기능성식품 조성물은 유효성분으로서 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 재료 준비

1-1. 오가피 수피의 준비

오가피(Eleutherococcus sessiliflorus;ES)의 껍질은 2017년 6월 김성식 박사 (포천 국립 수목원)의 인증을 받아 서산에서 준비되었다.

1-2. 오가피 수피의 효소 가수분해 추출물 준비

노보자임(Novozyme)에서 구입한 효소 'Pectinex® Ultra SP-L (펙티넥스, Pectinex)'을 얻어 본 실험에 사용하였다. 구입한 효소를 ES 수피 추출물과 증류수에 혼합하였다. 혼합 비율은 ES추출물: 펙티넥스 : 증류수 = 1 : 3 : 1이었다. 이후 상기 혼합물을 펙티넥스로 37 ℃에서 3 일간 반응시켰다. 효소 가수 분해 후, 농축을 위해 증발시켜 오가피 효소분해 추출물(EES)을 얻었다. 이 농축물을 물에 희석시킨 후 EA층과 1 : 1의 비율로 혼합하였다. 그 후, 상층액(EA층)과 하층액(물층)으로 분획한 후 증발시켜 농축하였다.

펙티넥스 효소가 동반된 오가피(ES)의 효소 가수 분해(EES)가 처리되어, ES와 비교하여 다양한 차이를 보였다. EES의 HPLC 크로마토그램은 배당체의 감소를 나타냈다(도 2).

1-3. 추출 및 분리

오가피(4.0 kg)의 수피를 75℃ 온도에서 70 % 프레탄올 A(Prethanol A)로 6회 환류 추출하였다. 추출물 140g을 진공 하에서 프레탄올 A를 제거한 후 농축시켰다. ES 추출물, 효소 및 증류수를 혼합한 후 펙티넥스를 이용하여 효소 가수분해 처리하였다. 효소 가수분해를 ES 추출물 148.4g에 적용하였다. 그리고 EES를 물 및 에틸 아세테이트로 분획하였다. EES의 에틸 아세테이트층 (EES-EA) 및 EES의 수층 (EES-W)은 각각 40.35g 및 108.5g 얻어졌다. 에틸 아세테이트층을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토 그래피에 적용하여 메탄올(MeOH) : 물(H₂O) 구배(gradient) (4:6 내지 10:0)로 용리시켜 18개의 하위 분획물 (EES-EA 1 내지 18)을 수득하였다.

MeOH : H₂O (3:7 내지 10:0)의 용매 구배(gradient) 시스템을 갖춘 MCI gel column을 사용하여 EES-EA-6의 분획에서 화합물 1(카페산, 260.4 mg)을 산출하였다. EES-EA-6.9 반복 컬럼 크로마토그래피는 MPLC 시스템(5mL/분, 220 nm)에서 67 % 아세토나이트릴(acetonitrile)을 나타내었고, 화합물 2(팔카린디올, 131 mg)를 산출하였으며 EES-EA-6.12를 반복 컬럼 크로마토그래피를 통해 77 % MPLC 시스템 (5 mL / min, 220 nm)을 사용하여 화합물 3 (파르네솔, 107.6 mg)을 산출하였다. EES-EA-10은 등용매 시스템(isocratic solvent system) 및 클로로포름(CHCl₃) : MeOH(15 : 1)로 실리카겔 60 컬럼을 사용하여 4개의 하위 분획을 제공하였다. H₂O : MeOH (70:30 ~ 0 : 100) 및 MPLC 시스템(5mL/분, 220 nm) 중 87 % 아세토니트릴(acetonitrile)의 구배 용매 시스템을 갖춘 ODS 겔 컬럼을 사용하여 분획 EES-EA-10.2의 컬럼 크로마토 그래피를 반복하여 화합물 4 (리놀레산, 29 mg)를 산출하였다.

EES-W층을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 수행하고, MeOH : H₂O 구배 (0:10 내지 10 : 0)로 용리시켜 8개의 하위 분획물 (EES-W 1 내지 8)을 수득하였다.

MCI 겔 컬럼을 사용하여 분획 EES-W-3 컬럼 크로마토그래피를 반복하여 18개의 분획을 제공했다. MPLC 시스템 (5 mL / min, 220 nm)에서 H₂O : 에탄올(EtOH)(2 : 8) 및 27 % 아세토 니트릴의 등용 매성 용매 시스템을 사용하여 세파덱스 LH-20을 사용하여 화합물 5 (아칸토사이드 B, 84.3 mg). 그리고 나서 EES-W-3.12를 H₂O : MeOH의 구배 용제 시스템 (100:0에서 0:100까지)으로 ODS 겔 컬럼에 넣고 화합물 6 (아칸토사이드 D, 168.9 mg)을 얻었다.

70%의 프레탄올에서 활성 유도 분리를 수행하였다. 오가피 추출물은 효소 가수 분해를 통해 세파덱스 LH-20, MCI-gel CHP 20P, 토요펄(Toyopearl) HW-40F 및 ODS-B gel을 사용하여 6개 페놀 화합물 (1~6)을 얻었다. ODS-B gel 또한 MPLC 시스템에서 고정상(stationary phase)으로 사용되었다. EES로부터 분리된 화합물의 구조는 [카페산(1), 팔카린디올(2), 파르네솔(3), 리놀레산(4), 아칸토사이드 B(5), 아칸토사이드 D(6)]로 밝혀졌다.

실시예 2. 실험 방법

2-1. 일반적 실험 과정

세파덱스 LH-20 (10-25 μm, GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sweden), MCI-gel CHP 20P (75-150 μm, Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan), ODS- B gel(40-60 μm, Daiso, Osaka, Japan) 및 Silica gel 60(0.040-0.063 mm, 230-400 mesh ASTM, Merck, Germany)에서 컬럼 크로마토그래피 분리(column chromatographic isolation)를 시행했다. 또한, ODS-B gel을 중압 액체 크로마토 그래피(middle pressure liquid chromatography;MPLC) 시스템에서 고정상(stationary phase)으로 사용하였다.

클로로포름, 메탄올(15 : 1, 부피비), 및 클로로포름, 메탄올 및 물(70 : 30 : 4, 부피비)상에서 미리 코팅된 실리카겔 60F₂₅₄ 판 (Merck, Darmastadt, Germany)을 사용하여 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)를 수행했다. 점(spots)은 자외선 (254nm) 및 염화철(FeCl₃) 및 10 % 황산(H₂SO₄) 또는 아니스알데히드(anisaldehyde)- 황산(H₂SO₄)로 분무 한 다음 가열함으로써 검출되었다.

화학 구조는 여러 가지 형태의 도구 분석에 의해 검증되었다. 중앙 대학교 연구 시설의 중심에 JEOL (JEOL, Massachusetts, USA)을 이용하여 1H-(600MHz) 및 13C-(150MHz) 핵자기공명 (NMR) 실험과 같은 1D-NMR을 기록했다. 중앙대학교의 연구 시설 3000 RSLC 시스템 (Thermo, USA)으로 고해상도 액체 크로마토그램 질량 스펙트럼(HR-LC-MS)을 실시하였다.

컬럼(Hector C18 HPLC column 5㎕, 250 x 4.6 mm), 제어기(Waters 600 제어기), 펌프(Waters 600 펌프)와 같은 고성능 액체 크로마토그래피(Waters 600 펌프, 미국), 검출기 (Waters 112 UV / VIS (280nm))를 사용하여 일부 화합물 함량의 정량 분석을 수행하였다.

2-2. HPLC 분석

고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 화합물의 양적 및 양적 함량 분석을 수행했다. 이동상(mobile phases)은 용매 A (0.2 % 아세트산) 및 B (ACN)를 사용 하였다. (표 1)

추출 샘플(ES, EES)은 50 % 메탄올, 20 mg/ml에 용해시켰다.

하기 표 1과 같이, HPLC 분석 조건을 설정하였다.

HPLC conditions
Mobile phase		A) 0.2% Acetic acid B) Acetonitrile	Flow rate 1.0㎖/min Injection vol. 10.0㎕
Gradient profile		Time (min)	A (%)	B (%)
		0.0 40.0 42.0 52.0	90 70 100 100	10 30 0 0
High pressure liquid chromatography
Controller	Waters 600 controller
Pump	Waters 600 pump
Column	Hector C18HPLC column(5㎕,250*4.6mm)
Detector	Waters 112UV/VIS(220nm)

2-3. 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. SPSS(Statistical Package for the Social Sciences) 소프트웨어 팩을 사용한 Student-Newman-Keuls (SNK) 테스트에 이어 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석한 결과 p값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있다고 판단되었다. 같은 열에 다른 위첨자가 있는 값은 다른 데이터와 유의미하게 다르다.

실시예 3. 화합물의 구조 동정

실시예 1 에서 얻은 화합물들의 1H 및 13C-NMR spectra를 측정하였고, 그 결과는 하기와 같다.

3-1. 화합물 1(카페산)

① ¹H-NMR (600 MHz, DMSO)

: δ 7.38 (1H, d, J =16.2Hz, H-7), 7.00 (1H, brs, H-2), 6.92 (1H, d, J = 7.8Hz, H-6), 6.73 (1H, d, J = 8.4Hz, H-5), 6.80 (1H d, J = 8.4Hz, H-5), 6.16 (1H, d, J =16.2Hz, H-8)

② ¹³C-NMR (150 MHz, DMSO)

: δ 168.6 (C-7), 148.5 (C-9), 145.9 (C-4), 145.1 (C-3), 126.3 (C-1), 121.8 (C-6), 116.2 (C-5), 115.7 (C-8), 114.9 (C-2) (도 3, 4),

이러한 결과를 바탕으로 화합물 1의 구조는 카페산으로 밝혀졌다.

3-2. 화합물 2(팔카린디올)

① ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃)

: δ 5.95 (1H, ddd, J =16.2, 10.8, 5.4Hz, H-2 ), 5.60 (1H, m, H-1b), 5.51 (1H, m, H-9), 5.48 (1H, m, H-10), 5.25 (1H, d, J =10.2Hz, H-1a), 5.20 (1H, m, H-8), 4.93 (1H, brd, J = 5.4Hz, H-3), 2.11 (2H, m, H-11), 1.38 (2H, m, H-12), 1.29 (8H, m, H-13, 14, 15, 16) 0.87 (3H, t, J = 13.8, 6.8Hz, H-17)

② ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃)

: δ 135.9 (C-2), 134.8 (C-10), 127.8 (C-9), 117.5 (C-1), 79.9 (C-7), 78.3 (C-4), 70.3(C-5), 68.8 (C-6), 63.5 (C-3), 58.6 (C-8), 31.9 (C-15), 29.4 (C-12), 29.2 (C-13), 29.1 (C-14), 27.8 (C-11), 22.7 (C-16), 14.2 (C-17) (도 5, 6)

이 결과는 스펙트럼 데이터를 다른 연구에서 보고 된 값과 비교하여 화합물 2가 팔카린디올으로 구성되었음을 보여 주었다.

3-3. 화합물 3(파르네솔)

① ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃)

: δ 5.42 (1H, dt, J = 6.6, 1.2Hz, H-2), 5.01 (1H, m, H-6), 5.01 (1H, m, H-10), 4.14 (1H, d, J = 6.6Hz, H-1), 2.16 (2H, m, H-5), 2.08 (2H, m, H-9), 2.05 (2H, m, H-4), 1.97 (2H, m, H-8), 1.67 (6H, s, H-14, 15), 1.59 (6H, s, H-12, 13)

② ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃)

: δ 135.9 (C-2), 134.8 (C-10), 127.8 (C-9), 117.5 (C-1), 79.9 (C-7), 78.3 (C-4), 70.3(C-5), 68.8 (C-6), 63.5 (C-3), 58.6 (C-8), 31.9 (C-15), 29.4 (C-12), 29.2 (C-13), 29.1 (C-14), 27.8 (C-11), 22.7 (C-16), 14.2 (C-17) (도 7, 8)

따라서 화합물 3은 다른 연구에서 보고된 값과 스펙트럼 데이터를 비교함으로써 파르네솔로 확인되었다.

3-4. 화합물 4(리놀레산)

① ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃)

: δ 5.38 (4H, m, H-9, 10, 12, 13), 2.77 (2H, m, H-11), 2.35 (2H, m, H-2), 2.05 (2H, m, H-8), 2.03 (2H, m, H-14), 1.63 (2H, m, H-3), 1.35~1.287 (14H, m, H-4, 5, 6, 7, 15, 16, 17), 0.9 (3H, dd, J = 6.6, 7.2Hz, H-18)

② ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃)

: δ 180.2 (C-1), 130.3 (C-12), 130.1 (C-9), 128.1 (C-10), 128.0 (C-11), 34.2 (C-2), 31.6 (C-16), 29.7 (C-14), 29.4 (C-7), 29.2 (C-4), 29.2 (C-5), 29.1 (C-6), 27.3 (C-15), 27.3 (C-8), 25.7 (C-13), 24.8 (C-3), 22.7 (C-17), 14.2 (C-18) (도 9, 10)

따라서, 화합물 4는 스펙트럼 데이터를 다른 연구에서 보고된 값과 비교함으로써 리놀레산으로 확인되었다.

3-5. 화합물 5(아칸토사이드 B)

① ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD)

: δ 6.69 (2H, s, H-2'', 6''), 6.62 (2H, s, H-2', 6'), 4.86 (1H, d, J = 7.2Hz, H-1'''), 4.76 (1H, brs, H-2), 4.71 (1H, brs, H-6), 4.28 (2H, dd, J = 14.4, 7.8Hz, H-4b, 8b), 3.90 (2H, brd, J = 9.0Hz, H-4a, 8a), 3.83 (6H, s, OCH3-3'',5''), 3.81 (6H, s, OCH3-3',5'), 3.73 (1H, brd, J = 12.0Hz, H-6'''a), 3.67 (1H, dd, J = 12.0, 4.2Hz, H-6'''b), 3.50 (1H, m, H-2'''), 3.43 (2H, m, H-3''', 4'''), 3.20 (1H, m, H-5'''), 3.12(2H, bs, H-1, 5)

② ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD)

: δ 153.0 (C-3', 5'), 148.0 (C-3'', 5''), 138.1 (C- 1'), 134.7 (C-4''), 134.0 (C-4'), 131.7 (C-1''), 103.8 (C-2', 6'), 103.5 (C-2'', 6''), 103.2 (C-1'''), 86.3 (C-6), 85.9 (C-2), 76.8 (C-3'''), 76.3 (C-5'''), 74.2 (C-2'''), 71.6 (C-8), 71.5 (C-4), 69.7 (C-4'''), 60.9 (C-6'''), 55.9 (C-3', 5' -OCH3), 55.7 (C-3'', 5'' - OCH3), 54.2 (C-5), 54.0 (C-1)

이 결과에 기초하여 화합물5의 구조는 다른 연구에서 보고된 값과 스펙트럼 데이터를 비교하여 아칸토사이드 B (도 11, 12)로 밝혀졌다.

3-6. 화합물 6(아칸토사이드 D)

① ¹H-NMR (600 MHz, Pyridine-d ₅ )

: δ 6.61 (4H, s, H-2', 6', 2'', 6''), 4.83 (2H, d, J = 4.2Hz, H-1''', 1''''), 4.63 (2H, d, J =3.6Hz, H-2, 6), 4.17 (2H, m, H-4b, 8b), 3.79 (2H, dd, J = 3.0, 2.0Hz, H-4a, 8a), 3.36 (2H, dd, J = 6.6, 14.4Hz, H-6'''a, 6'''a'), 3.16-3.04 (8H, m, 2''', 3''', 4''', 5''', 2'''', 3'''', 4'''', 5''''), 2.99-2.97 (2H, m, H-1, 5)

② ¹³C-NMR (150 MHz, Pyridine-d ₅ )

: δ 153.1(C-3', 5', 3'', 5''), 137.7 (C-4', 4''), 134.1 (C- 1', 1''), 104.6 (C-2', 6', 2'', 6''), 103.2 (C-1''', 1''''), 85.6 (C-2, 6), 77.6 (C-5''', 5''''), 76.7 (C-3''', 3''''), 74.5 (C-2''', 2''''), 71.9 (C-4, 8), 70.2 (C-4''', 4''''), 61.2 (C-6''', 6''''), 56.9 (C-3', 5', 3'', 5'' -OCH3), 54.1 (C-1, 5)

이 결과로부터, 스펙트럼의 데이터를 다른 연구에서 보고된 값과 비교함으로써 아칸토사이드 D로 화합물 6의 구조가 밝혀졌다(도 13, 14).

[실험예]

실험 결과에 따르면 EES의 항산화 및 항염증 작용은 ES의 항산화 및 항염증 활동보다 더 우수했다. 화합물 수준에서 1과 5는 양성 대조군에 비해 강력한 항산화 효과를 보였다. 또한 2, 3, 4는 양성 대조군에 비해 우수한 항염증 효과를 나타내었고, 3은 우수한 염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 유전자 발현 억제를 보였다.

실험예 1. 항산화 활성 확인

EES로부터 추출물과 분리 된 화합물의 항산화 활성을 간단하게 측정하기 위해 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거능과 니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitrotetrazolium Blue chloride, NBT) 수퍼옥사이드(superoxide) 소거능을 측정 하였다(도 15).

DPPH는 질소에 불안정한 원소이기 때문에 쉽게 수소를 받을 수 있는 특징이 있다. DPPH가 풍부한 산화 방지제의 수소를 가지고 있을 때, 항산화 활성은 특성에 의해 보라색을 잃을 수 있다(도 16).

니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitrotetrazolium Blue chloride, NBT) 수퍼옥사이드(superoxide)는 불안정한 음이온 때문에 쉽게 수퍼옥사이드를 받을 수 있는 특징이 있다. 따라서 항산화 활성은 NBT가 풍부한 수퍼옥사이드를 받았을 때 황색을 잃을 수 있는 특성으로 측정 할 수 있었다(Parejo et al., 2002) (도 17).

1-1. DPPH 자유 라디칼 소거 활성의 측정

항산화제 활성은 안정한 DPPH 자유 라디칼(Sigma, St. Louis, USA)의 소거 활성에 기초하여 평가하였다. 수분을 함유하지 않은 에탄올(anhydrous-ethanol;무수 에탄올)에서 각 시료 20 μL를 DPPH 용액(0.2 mM, 무수 에탄올에 용해) 180 μL에 넣었다. 가볍게 혼합하고 12시간 동안 방치한 후, ELISA 리더(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거능은 [저해율(%) = 100- (샘플 O.D. / 대조 O.D.) Х 100]으로 계산되었다. L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)을 양성 대조군으로 사용하였다. IC₅₀값은 50 % DPPH 자유 라디칼을 제거 할 수있는 농도로 규정하였다(도 18).

DPPH 라디칼 소거 활성은 여러 가지 EES 추출물의 처리로 평가되었다. 표 2에 나타난 바와 같이, 추출물 수준에서 EES 및 ES의 항산화 활성에 관해서, DPPH 라디칼 소거 활성을 평가 하였다. 이 결과들로부터 (표 2), EES (IC₅₀ = 76.05 ± 1.49 μg / mL)는 ES와 비교할 때 강력한 DPPH 라디칼 소거능을 보였다(IC₅₀ = 109.45 ± 2.87 μg / mL).

또한, EES로부터 분리된 6가지 화합물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능을 다시 평가하였다. 결과 (표 2)에 따르면, 화합물 1 (IC₅₀ = 17.91 ± 0.45 μM), 화합물 2 (IC₅₀ = 136.54 ± 3.70 μM), IC₅₀ = 39.87 ± 1.45 μM은 양성과 비교했을 때 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다. 대조군, L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)(IC₅₀ = 59.81 ± 1.63 μM).

하기 표2와 같이, DPPH 라디칼 소거 활성에 대한 EES의 추출물 및 화합물의 IC₅₀ 값을 확인하였다.

Extract	IC ₅₀ (ug/mL)
ES	109.45±2.87^c
EES	76.05±1.49^b
L-ascorbic acid	16.42±0.13^a
compound	IC ₅₀ (ug/mL)
1	17.91±0.45^a
2	136.54±3.70^a
3	>200
4	>200
5	39.87±1.45^a
6	>200
L-ascorbic acid	59.81±1.63^a

1-1. NBT/ 수퍼옥사이드(superoxide) 소거 활성의 측정

K-EDTA(1 mM), 히포크산틴(hypoxanthine, 0.6 mM), NBT (0.2 mM)(시그마, 세인트 루이스, MO), 20 μL의 수성 추출물(대조군을 위한 증류수), 및 20 μL의 잔틴 산화효소(xantine oxidase, 2.0 U/μL)를 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.5)을 사용하여 최종 부피 20 mL의 반응 혼합물을 제조하였다 (Sigma, St. Louis, MO). 잔틴 산화효소(xantine oxidase)는 마지막으로 첨가되었다 (Youn et al., 2017). 각 샘플에 대해 blank(참조)를 수행했다. NBT 축소는 실온에서 5분간 배양한 후 590 nm에서 흡광도를 분광 광도계로 측정하였다. NBT/ 슈퍼옥사이드 음이온 제거 활성은 [100 - (샘플 O.D.- blank O.D.)/ (대조군 O.D. - blank O.D.) Х 100]으로 계산되었다. 알로푸리놀(Allopurinol)은 양성 대조군으로 사용되었다. 그리고 NBT/ 수퍼옥사이드 음이온 제거 활성은 NBT/ 수퍼옥사이드 음이온의 50 %가 제거되는 농도로 정의된 IC₅₀ 값으로 표현되었다(도 19).

NBT 수퍼옥사이드 소거 활성은 EES의 처리와 함께 확인되었다. 표 3에서 보는 바와 같이 EES NBT로부터 분리 된 화합물의 항산화 활성을 평가하기 위해, 과산화물 소거 활성을 다시 측정 하였다. 결과 (표 3)에 따르면, EES (IC₅₀ = 95.35 ± 16.09 μg / mL)는 ES (IC₅₀ = 152.33 ± 11.79 μg / mL)에 비해 양성 NBT 과산화물 소거능을 보였다. 화합물 1 (IC₅₀ = 57.14 ± 0.87 μM), 화합물 2 (IC₅₀ = 176.23 ± 18.32 μM), 화합물 4 (IC₅₀ = 222.01 ± 3.51 μM), 화합물 5 (IC₅₀ = 259.09 ± 24.62 μM)는 강력한 NBT 과산화물 소거능 양성 대조군인 알로푸리놀(Allopurinol) (IC₅₀ = 46.38 ± 0.06 μM)과 비교 하였다.

하기 표3과 같이, NBT 수퍼옥사이드 소거 활성에 대한 ES, EES 와 EES유래 화합물들의 IC₅₀ 값을 확인하였다.

Extract	IC ₅₀ (ug/mL)
ES	152.33±11.79^c
EES	95.35±16.09^b
Allopurinol	8.7±5.02^a
compound	IC ₅₀ (ug/mL)
1	57.14±0.87^a
2	176.23±18.32^{a, b}
3	>300
4	222.01±3.51^b
5	259.09±24.62^b
6	>300
Allopurinol	46.38±0.06^a

실험예 2. 항염증 활성 확인

2-1. Raw 264.7 세포 배양

쥐 대식세포 Raw 264.7은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)에서 구입하였다. 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 IU/㎖ 페니실린 G 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)(Mosmann, T. 1983)을 포함하는 DMEM 배지 (Dulbecco 's Modified Eagles 's Medium, Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 37 ℃의 가습 조건(약 5 % CO₂)에서 자랐고, 혈구 계수기(hemocytometer)로 세포를 헤아린 후 사용하였다.

2-2. 대식세포 분화 및 자극

분화된 Raw 264.7 대식세포를 96 well plates에서 배양하고 가습 대기(5% CO₂), 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 0.1 μg/ml LPS(Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 샘플을 포함하는 배지에서 배양하였다.

추가 24시간 동안 배양한 후(Sigma, St. Louis, MO, USA), 세포를 추가 24시간 동안 배양한 후, 샘플 처리한 세포로부터 각각의 상층액을 취해 그리스 시약(Griess reagent)과 반응시켜 일산화 질소(nitric oxide, NO) 활성을 측정하였다. 상기 과정 중 각각의 상층액을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 저장하여 사이토카인 생성 억제 활성에도 활용하였다(Ahn et al. , 2012, Chanput, Mes, Vreeburg, Savelkoul, & Wichers, 2010).

2-3. NO 생산에 대한 억제 활성의 측정

Raw 264.7 대식세포를 96 well plates에서 배양(cultured)하고 가습 조건(약 5 % CO₂) 37 ℃에서 5시간 동안 배양(incubated)하였다. 세포를 각 샘플 및 10㎍/ml LPS (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 함유하는 배지에서 배양하였다. 추가로 20시간 배양한 후, NO 함량을 그리스(Griess) 분석법으로 평가하였다. 샘플로 처리한 세포로부터 상등액을 얻은 후, 그리스 시약(5% H₃PO₄ 용액 안에 0.1% naphthylethylenediamine과 1 % sulfanilamide)(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가하였다. NO 성분은 표준 아질산나트륨 곡선(standard sodium nitrite curve)에 대해 540 nm의 흡광도로 읽혀지지 않았다(Stamler, J., 1996; Hwang, B., 2005). L-NMMA를 양성 대조군으로 사용하였다. NO 생성 억제 활성을 억제율 (%) = 100 - (샘플 O.D. - blank O.D.) / (대조 O.D.- blank O.D.) Х 100으로 계산하였다. IC₅₀ 값은 NO 생산의 50 %를 억제 할 수 있는 농도로서 정의하였다 (Youn et al., 2017) (도 20).

ES, EES 및 EES로부터 분리된 화합물 (1~6)의 항염 활성을 평가하기 위해, NO 생산의 억제 활성은 Raw 246.7 대식세포에서 평가하였다. 표 4에서 보는 바와 같이 ES (IC₅₀ = 1.07 ± 0.40 μg / mL)와 양성 대조군인 L-NMMA (IC₅₀ = 1.35 ±)에 비해 EES (IC₅₀ = 0.74 ± 0.12 μg / mL) 0.35 μg / mL).

EES로부터 화합물의 항염 활성을 위해, NO 생산에 대한 억제 활성을 평가하였다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, (표 4)는 화합물의 대부분은 L-NMMA (IC₅₀ = 33.88 ± 27.87 μM)에 비해 NO 생성에 대한 높은 억제 효과를 보였다. EES로부터 분리된 모든 화합물 1 (IC₅₀ = 2.64 ± 2.84 μM), 2 (IC₅₀ = 0.40 ± 4.61 μM), 3 (IC₅₀ = 4.62 ± 2.70 μM), 4 (IC₅₀ = 0.75 ± 0.14 μM), 5 (IC₅₀ = 0.27 ± 4.16 μM), 6 (IC₅₀ = 2.76 ± 2.08 μM)은 양성대조군인 L-NMMA (IC₅₀ = 11.96 ± 1.40 μM)와 비교했을 때 NO 생산의 강력한 억제 활성을 보였다.

하기 표4와 같이, NO 생산 억제 활성에 대한 ES, EES와 EES 유래 화합물들의 IC₅₀ 값을 확인하였다.

Extract	IC ₅₀ (ug/mL)
ES	1.07±0.40^a
EES	0.74±0.12^a
L-NMMA	1.35±0.35^a
compound	IC ₅₀ ( μM )
1	2.64±2.84^b
2	0.40±4.61^a
3	4.62±2.70^a
4	0.75±0.14^a
5	0.27±4.16^a
6	2.76±2.08^c
L-NMMA	11.96±1.40^a

2-4. 사이토카인 생산 억제 활성의 측정

IL-6 및 TNF-α의 사이토카인 농도는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 배양 상등액에서 결정되었다. ELISA 리더(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 사이토카인 함량을 정량화 하였다. 생산된 사이토카인의 양은 표준 검량선(standard calibration curve)을 사용하여 계산하였다(도 21).

사이토카인(IL-6 및 TNF-α) 생산 억제 활성을 단백질 수준으로 ELISA로 측정하였다. RAW 264.7 대식세포가 LPS에 노출 된 후, 이들 세포로부터의 사이토카인 수준을 ES, EES 및 화합물의 억제 효과에 대해 측정하였다. IL-6 농도는 ES, EES 및 화합물 치료군에서 감소했다(표 5, 6).

EES로부터 분리된 화합물 중 화합물 3은 IL-6 생산에 대한 강한 억제 활성을 나타냈다.

사이토카인 (TNF-α) 생산의 저해는 단백질 수준의 측면에서 ELISA에 의해 측정되었다. RAW 264.7 세포를 LPS에 노출시킨 후, 추출물 및 화합물 (1~6)의 사이토카인 수준에 대한 억제 효과를 측정하였다.

TNF-α 농도는 ES, EES 및 화합물 (1~6) 처리군에서 감소하였다(표 7, 8).

EES로부터 분리된 화합물 중 화합물 3은 TNF-α 생산에 대한 강한 억제 활성을 나타냈다.

하기 표5와 같이, RAW 264.7 대식세포에서 IL-6 생산에 미치는 ES와 EES의 효과를 확인하였다.

	25 ppb	12.5 ppb	6.25 ppb	3.13 ppb	1.56 ppb	0.78ppb
ES	33±24	581±120	499±110	579±94	749±38	901±95
EES	4±9	61±17	997±154	562±94	999±104	1258±246
Control	1949±10
Blank	12±10

하기 표6과 같이, RAW 264.7 대식세포에서 IL-6 생산에 미치는 EES 유래 화합물들의 효과를 확인하였다.

화합물	25 μmol	12.5 μmol	3.13 μmol	1.56 μmol
1	2259±200	4525±519	7600±274	9681±134
2	2879±691	4131±1039	4826±93	5795±112
3	81±53	1258±93	4477±620	5140±871
4	4161±225	8740±94	6920±279	16704±100
5	4989±997	6359±51	5487±604	16181±700
6	4807±134	5506±154	6167±231	10357±114
Control	8582.10±113
Blank	1552.79±120

하기 표7과 같이, RAW 264.7 대식세포에서 TNF-α 생산에 미치는 ES와 EES의 효과를 확인하였다.

	25 ppb	12.5 ppb	6.25 ppb	3.13 ppb	1.56 ppb	0.78ppb
ES	236±107	129±102	1451±623	1274±132	1426±189	3271±143
EES	33±24	581±120	499±110	579±94	749±38	901±95
Control	1412±15
Blank	108±85

하기 표8과 같이, RAW 264.7 대식세포에서 TNF-α 생산에 미치는 EES 유래 화합물들의 효과를 확인하였다.

화합물	25 μmol	12.5 μmol	3.13 μmol	1.56 μmol
1	4620±511	2821±871	2734±572	2226±35
2	2039±202	2217±145	2298±263	3104±150
3	77±12	823±115	1901±270	1979±162
4	2320±454	3100±94	2185±758	5536±171
5	2392±150	2927±221	3669±23	4436±4
6	2041±704	2349±266	2840±355	3134±405
Control	136±109
Blank	2932±181

Claims

오가피(Eleutherococcus sessiliflorus) 수피의 펙티넥스 효소 가수분해 추출물의 에틸 아세테이트 또는 물 분획물을 유효성분으로 포함하고, 상기 분획물에는 파르네솔을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에틸 아세테이트 분획물은 카페산(caffeic acid), 팔카린디올(falcarindiol), 및 리놀레산(linoleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 물 분획물은 아칸토사이드 B(acanthoside B) 및 아칸토사이드 D(acanthoside D)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 일산화 질소(nitric oxide, NO) 생성 억제; 또는 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6) 또는 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α) 사이토카인 생산을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항염증용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은,
오가피 수피를 환류 추출한 후 농축하여 오가피 추출물을 수득하는 단계;
상기 수득된 오가피 추출물, 펙티넥스 효소, 및 증류수를 혼합한 후, 효소 가수분해 추출물을 수득하는 단계;
상기 수득된 오가피 효소 가수분해 추출물의 효소를 제거하는 단계; 및
효소를 제거한 오가피 효소 가수분해 추출물을 에틸 아세테이트 또는 물로 분획하는 단계
를 포함하는 방법으로 수득되는 것을 특징으로 하는, 항염증용 약학적 조성물.
오가피(Eleutherococcus sessiliflorus) 수피의 펙티넥스 효소 가수분해 추출물의 에틸 아세테이트 또는 물 분획물을 유효성분으로 포함하고, 상기 분획물에는 파르네솔을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항산화 또는 염증 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 분획물은 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거 활성, 또는 니트로테트라졸리움 블루 클로라이드(Nitrotetrazolium Blue chloride, NBT) 수퍼옥사이드(superoxide) 소거 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
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제6항에 있어서, 상기 분획물은 리놀레산(linoleic acid) 및 아칸토사이드 D(acanthoside D)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.