KR102256509B1

KR102256509B1 - 신경세포 보호 활성을 갖는 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102256509B1
Application number: KR1020180107815A
Authority: KR
Inventors: 김선오; 김진석; 나주련; 박소이; 이기훈; 정의선
Original assignee: (주)비엔텍
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2018-09-10
Publication date: 2021-05-26
Also published as: KR20200029230A

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 단백질 분해효소로 1차 가수분해 처리되고 아미노펩타이드 분해효소로 2차 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 글루타메이트에 의한 신경세포사멸을 유의성있게 차단함으로써 신경세포의 생존율을 증가시키고 신경세포 보호 효과를 나타낼 수 있는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

신경세포 보호 활성을 갖는 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF DENDROPANAX MOBIFERA HAVING NEURONAL CELL-PROTECTING ACTIVITY FOR PREVENTING AND TREATING BRAIN DISEASES}

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 가수분해효소로 처리되어 우수한 신경세포 보호 활성을 갖는 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

뇌혈관질환은 크게 두 가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다. 허혈성 뇌질환은 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune)등으로 세분할 수 있는데, 허혈성 뇌혈관질환은 주로 혈전과 색전 등에 의하여 뇌에 혈류를 공급하는 혈관에 병리학적 이상이 생긴 것이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되고 신경세포에서 ATP 감소 및 부종(edema)이 발생되어, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간이 경과된 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다

지금까지 가장 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전 중에는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트 (glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전이 있다. 이러한 기전 연구를 바탕으로 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 수행되고 있으나, 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

생약(Crude drugs)은 의약품의 일종으로, 천연으로 산출되는 자연물을 날로 또는 가공하여 의약품으로 사용하거나 그 원료로 삼는 것이다. 단일 성분의 화합물로 된 의약품과는 달리 많은 종류의 성분이 혼재하고 있어 그 효과가 복합적이고 상대적으로 부작용이 적다고 알려져 있다. 황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 우리나라의 남부해안 지역과 제주도 등에서 자생하는 쌍떡잎 식물로, 두릅나무과 상록교목에 속한다. 황칠나무는 겨울에도 낙엽이 지지 않으며, 수피에 상처를 주면 황색 수지액이 나오는데 이를 황칠이라고 한다. 황칠나무 추출물의 항암 활성 등 생리활성이 보고되어 있다.

NO는 혈관 평활근을 이완시켜 혈관을 확장함으로써 혈압을 조절하여 고혈압을 예방하고, 뇌졸중과 심장발작을 유발하는 혈전 형성을 예방하고, 혈관을 부드럽게 하여 동맥경화증을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 NO는 L-아르기닌(L-arginine)이 NOS 합성효소(Nitric Oxide Synthase)에 의해 분해되어 생성되게 된다.

감마아미노산부티르산(Gamma-Amino Butyric Acid; 이하 GABA라 함)은 비단백질 아미노산의 일종으로 포유류의 신경전달물질이다. 뇌의 혈류를 개선하고 혈관중추에 작용하여 항이뇨호르몬의 분비를 억제하고 혈관을 확장시켜 혈관을 낮춤으로 고혈압을 예방하는 효과가 보고되어 있다.

KR

101650773

B1

Kang TC et al., J. Neurocytol., 30, pp945-955, 2001

본 발명은 가수분해 효소로 처리되어 신경세포 보호 활성이 우수한 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 단백질 분해효소로 1차 가수분해 처리되고 브로멜라인 및 파파인을 포함하는 분해효소로 2차 가수분해 처리된 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 포함하는, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 제공될 수 있다.

또한, 상기 단백질 분해효소는 프로테아제 및 트립신을 포함할 수 있다.

삭제

또한, 상기 황칠나무 추출물은 L-아르기닌 15 내지 20mg/g 함량으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 뇌신경 질환은 뇌혈관질환, 뇌졸중, 파킨슨, 치매, 알츠하이머 및 외상으로 인한 뇌신경 손상 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 제제가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 기능성 식품이 제공될 수 있다.

본 발명의 가수분해 효소 처리된 황칠나무 추출물을 포함하는 조성물은 글루타메이트에 의한 신경세포사멸을 유의성있게 차단함으로써 신경세포의 생존율을 증가시키고 신경세포 보호 효과를 나타낼 수 있다. 이를 통하여, 신경세포 괴사로 발생하는 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학조성물 또는 건강보조식품으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 가수분해 효소 처리 황칠나무 추출물을 제조하는 공정을 나타낸 일 실시예의 순서도이고,
도 2는 본 발명의 가수분해 효소 처리 황칠나무 추출물이 우수한 신경세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인한 것이고,
도 3은 본 발명의 가수분해 효소 처리 황칠나무 추출물이 농도의존적으로 우수한 신경세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인한 것이고,
도 4는 본 발명의 가수분해 효소 처리 황칠나무 추출물의 세포독성을 확인한 것이다.

본 발명은 단백질 분해효소로 1차 가수분해 처리되고 분해효소로 2차 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 포함하는, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 황칠나무 추출물은 효소로 가수분해 처리됨으로써, L-아르기닌 및 가바(GABA) 함량이 증가된 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 황칠나무 추출물의 제조방법의 순서도를 도 1에 도시하였다.

도 1을 참고하면, 먼저 황칠나무 원료를 물에 침지하여 추출하는 동시에 단백질 분해효소를 처리하여 1차 가수분해를 수행할 수 있다.

상기 황칠나무의 원료는 황칠나무 추출물을 분리하기 위한 것으로서, 황칠나무의 잎, 가지, 뿌리 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 황칠나무의 잎이 선택되는 것이 좋다. 이를 통상의 방법에 의하여 절단, 건조 또는 분쇄하여 이용할 수 있다. 바람직하게는, 제조되는 황칠나무 추출물의 수율을 향상시키기 위한 측면에서 절단 및 건조하여 이용하는 것이 좋다. 상기 건조 방법은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 자연건조, 열풍건조 또는 동결건조를 이용할 수 있다.

상기 황칠나무 추출물의 제조를 위한 추출방법은 특별히 한정되지는 않으며, 추출물을 제조하기 위하여 당업계에서 통상적으로 이용하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출, 초음파추출 등의 추출장치를 이용하는 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함하는 흡착 수지를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 추출 용매를 처리하여 추출하여 수득할 수 있다. 상기 추출용매는 특별히 한정되지는 않으며, 효소활성을 고려하여 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 물을 이용하는 것으로 설명한다. 추출용매를 처리하여 추출물을 분리할 시에 추출용매는 황칠나무 전체 중량의 1 내지 100배로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 황칠나무 전체 건조 중량의 5 내지 20배로 첨가되는 것이 좋다.

본 단계에서 상기 용매에 효소를 첨가함으로써 황칠나무의 추출과 효소처리가 동시에 수행될 수 있다. 본 단계에서, 처리되는 효소는 단백질 가수분해 효소일 수 있다. 상세하게는, 프로테아제(protease) 또는 트립신(trypsin)일 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 및 트립신을 함께 처리하는 것이 좋다. 상기 단백질 가수분해 효소는 황칠나무 유래 단백질 용출량을 증가시키기 위하여 처리될 수 있다. 상기 프로테아제는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래 효소인 것이 바람직하다. 본 단계에서 첨가 처리되는 효소는 용매에 녹인 효소액의 형태로 처리될 수 있다.

추출용매를 처리하여 추출물을 분리하는 본 단계는 추출 수율과 가수분해 처리되는 효소의 활성온도를 고려하여 30 내지 60℃온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 40 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 본 단계가 수행되는 온도가 60℃초과이면 처리되는 효소의 활성이 저하되고, 30℃ 미만이면 황칠나무 추출 수율이 저하되고 효소 활성이 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 상기 온도범위 내에서 1 내지 12시간 동안 처리하여 황칠나무 추출물의 분리 및 1차 가수분해처리가 수행될 수 있다. 바람직하게는 6 내지 10시간 동안 처리하는 것이 좋다. 필요에 따라, pH가 조절될 수 있다. 본 단계에서 pH는 중성 내지 약염기성인 것이 바람직하다. 상세하게는, pH7 내지 8인 것이 좋다. 본 단계를 통해 1차 가수분해된 황칠나무 추출물을 수득할 수 있다.

다음으로, 분해 효소를 처리하여 2차 가수분해를 수행할 수 있다. 본 단계는 이전 단계의 황칠나무 원료 침지된 추출용액에 효소를 처리하여 수행될 수 있다.

본 단계에서, 1차 가수분해된 추출물을 이용하여 펩타이드를 분해하여 아미노산으로 전환시키기 위하여 분해 효소가 처리될 수 있다. 상기 분해 효소는 브로멜라인 또는 파파인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 1차 가수분해된 황칠나무 추출물에 브로멜라인 및 파파인이 함께 처리되는 것이 좋다. 본 단계에서 처리되는 효소는 용매에 녹인 효소액의 형태로 처리될 수 있다.

본 단계에서 수행되는 2차 가수분해는 전 단계에서 1차 가수분해된 황칠나무 추출물에 효소를 첨가하고 40 내지 60℃, 바람직하게는 50 내지 60℃의 온도에서 10 내지 20시간, 바람직하게는 14 내지 18시간동안 처리하여 수행될 수 있다. 필요에 따라, pH가 조절될 수 있다. 본 단계에서 pH는 약산성인 것이 바람직하다. 상세하게는, pH5 내지 6인 것이 좋다.

다음으로, 황칠나무 추출물에 처리된 효소를 불활성화시킬 수 있다.

본 단계는 황칠나무 원료가 침지된 상태로 효소가 첨가되어 1차 및 2차 가수분해 처리된, 황칠나무 침지된 추출 용액을 100 내지 120℃온도에서 30분 내지 6시간 동안 가열하여 수행될 수 있다. 이를 통하여, 황칠나무의 유효성분을 용매추출하는 동시에 이전 단계에서 처리된 효소를 불활성화시킬 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 일 구현예에 따른 황칠나무 추출물의 제조방법은 이후 여과, 농축 또는 건조과정을 통해 용매를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이를 통하여, 황칠나무 추출물이 농도가 조절된 액체 또는 고체 분말의 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 유용 성분의 농도를 높이고 저장성을 향상시키기 위하여 농축시킨 후 동결건조하여 분말의 형태로 제공되는 것이 좋다. 상기 여과, 농축 또는 건조시키는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 방법으로 수행될 수 있다.

상기 제조방법에 의하여 제조되는 본 발명의 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 유용성분인 L-아르기닌 및 가바(GABA) 함량이 동시에 현저하게 증가된다. 통상 가바의 제조 및 가바의 함량을 증폭시키기 위한 제조기술은 진공처리 공정이 필수적으로 요구되나, 본 발명은 그러한 진공처리 공정을 제외하고도 가바 함량을 증폭시킬 수 있다. 이를 통하여, 뇌질환의 발병원인인 글루타메이트에 의한 신경세포 보호 효과를 현저하게 증진시킬 수 있다. 본 발명의 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 글루타메이트에 의하여 유발되는 과잉 흥분독성에 의한 신경세포 사멸을 보호함으로써, 뇌질환의 치료 및 예방에 대하여 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 이를 통하여, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 용도로 사용될 수 있다. 상기 뇌질환은 예를 들면, 뇌혈관질환, 뇌졸중, 파킨슨, 치매, 알츠하이머 및 외상으로 인한 뇌신경 손상 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 신경계 질환을 포함할 수 있다.

본 발명의 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 뇌질환의 예방 또는 치료용도로 적용하기 위한 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다. 상기 제제는 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.

필요에 따라, 상기 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

필요에 따라, 본 발명의 약제학적 제제는 상기 성분들 이외에 당업계에 공지된 첨가물을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 제제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 피부 도포, 직장 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 조절될 수 있으며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001㎎/㎏ 내지 10g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ 내지 1g/㎏일 수 있다. 필요에 따라 상기 투여량을 수회에 나누어 일정시간 간격으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 숙련된 의사에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 뇌질환의 예방 또는 개선을 위한 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품이란 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 식품소재에 첨가하여 제조된 식품이거나, 이를 캡슐, 분말, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 통상적인 의미의 건강 식품을 포함한다. 상기 식품의 종류로는, 예를 들면, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디, 스넥, 과자, 피자, 면류, 껌, 아이스크림, 스프, 음료, 차, 비타민 복합제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

필요에 따라, 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산, 펙트산염, 알긴산, 알긴산염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제, 과육 등을 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기능성 식품은 드링크제일 수 있다. 상기 드링크제는 향미제 또는 천연 탄수화물을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 향미제로는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

<일반 황칠나무 추출물 제조>

황칠나무 잎 끝을 기준으로 50cm 이내의 녹지 부분까지의 잎을 원료로 2cm 내외로 세절하여 열풍건조를 수행하였다. 황칠나무 원료 중량 기준 20배수 증류수를 첨가하여 100℃에서 4시간 추출하고 30brix 이상 농축을 진행한 후 동결건조하여 동결건조 분말의 형태로 황칠나무 잎의 추출물을 수득하였다. 추출량 및 수율은 하기 표 1에 나타냈다.

구분	원료	원물량(Kg)	추출량(g)	수율(%)
제조예1	세절 건조잎	2.5	521.55	20.9

<가수분해 처리된 황칠나무 추출물 제조>

건조세절한 황칠나무 원료를 일반 황칠나무 추출물의 제조예와 동일하게 준비하여 사용하였다. 황칠나무 원료 100중량부에 대하여 최종 물의 양은 20배수로 설정하고, 그 중 9배수 양만큼을 먼저 완료에 첨가한 후 프로테아제 1g 및 트립신 1g을 녹여 제조한 효소액을 첨가 처리하고 45℃에서 8시간동안 처리하여 침지 및 1차 가수분해를 동시에 실시하였다. 1차 가수분해 종료 후 별도의 물 1배수에 브로멜라인 1g 및 파파인 1g을 녹여 효소액을 제조하여 침지액에 첨가하고 55℃에서 16시간동안 처리하여 2차 가수분해를 실시하였다. 2차 가수분해 종료 후 처음 설정한 20배수 물의 양 중에서 미첨가된 나머지 10배수의 물을 추가로 첨가하고 100℃에서 4시간동안 추출하는 동시에 효소불활성화를 수행하는 과정을 거친 후 30brix로 농축하고 동결건조 분말로 최종 시료화 하여 가수분해 처리된 황칠나무 잎의 추출물을 수득하였다. 이하 이를 제조예 2라 한다.

<L-아르기닌 및 가바 함량 확인>

제조된 황칠나무 추출물의 L-아르기닌 및 가바의 함량을 확인하여, 가수분해 처리로 인한 유효성분 증폭률을 분석하였다. 실시예로는 상기 제조예 2의 시료를 준비하고, 비교예로는 상기 제조예 1의 건조세절한 황칠나무를 원료로 열수추출만을 수행하여 얻은 시료를 대조군으로 준비하였다.

L-아르기닌 및 가바 분석에는 1200 series LC (Agilent, USA)와 결합된 6410A triple quadrupole mass spectroscopy　(Agilent, USA)를 사용하였다. Positive electro-spray ionization (+ESI) 장치로 시료를 이온화시킨 후 multiple reaction monitoring (MRM) mode에서 분석을 실시하며, nebulizer 압력, N₂ gas 유속 및 온도는 각각 40 psi, 10 L/min, 310℃로 설정하고 capillary voltage는 4kV를 유지하였다. Column으로 Gemini-NX C18 (4.6 × 150 mm, 3 μm, Phenomenex)을 사용하며, 시료 주입량은 5㎕, column oven은 35℃를 유지하였다. 이동상으로 5 mM ammonium acetate와 0.1%(v/v) formic acid가 혼합된 water (A)와 methanol (B)을 사용하여 초기 0%(v/v) B에서 시작하여 95%(v/v) B까지 순차적으로 변화시킨 후 다시 0%(v/v) B로 낮춰서 30분간 분석을 실시하며, 유속은 0.5 ㎖/min으로 유지하였다. 각 실시예 및 비교예에 대한 분석은 2회 반복 측정하였으며 그 결과는 하기 표 2에 나타냈다.

조건	측정 반복	L-아르기닌 (㎎/g)	평균 증폭률 (%)	가바 (㎎/g)	평균 증폭률 (%)
비교예	1회	3.45	100%	19.975	100%
	2회	2.903		18.017
	평균	3.177		18.996
실시예	1회	16.840	559%	25.176	146%
	2회	18.730		30.450
	평균	17.770		27.813

상기 표 2를 보면, 본 발명에 따른 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 L-아르기닌 15 내지 20mg/g, 가바 25 내지 35mg/g의 함량으로 포함하는 것으로 나타나, 비교예에 비하여 현저히 증진된 L-아르기닌 및 가바 함량을 갖는 것을 확인할 수 있다.

<신경성 산화질소 합성효소(nNOS) 감소 효과 확인>

신경성 산화질소 합성효소(nNOS) 측정실험은 Nitric Oxide Assay Kit (Colorimetric)(ab65328, Cambridge, UK)를 이용하였다. 신경성 산화질소 합성효소(nNOS) 측정실험을 위해 임신한 백서 20~21일 령(SD rat)의 태아에게서 cortex를 분리하여 초대배양을 실시하여 사용하였다. Nitric Oxide Assay Kit로 두 가지 단계를 거쳐 아질산염을 측정하였다. 먼저 질산 환원 효소를 이용하여 질산염을 아질산염으로 전환시키고, 이후 변환된 아질산염은 보라색으로 색 변환이 되는 Griess reagent를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 실험대조군으로써 글루탐산염(1mM)을 초대배양한 cortex 세포에 5분 동안 처리 후 세척하고, 다시 24시간 배양 후 kit를 통해 측정하였으며 농도는 standard curve를 이용하여 최종 확인하였다. 제조예1 및 2의 추출물과 아르기닌과 가바에서 신경성 산화질소 합성효소(nNOS)를 초대배양한 cortex 세포에서 글루탐산염의 유무에 따른 아질산염의 양을 도 2에 나타냈다. 도 2에서, Blank 시료는 미처리군을 의미하고, Glutamate 시료는 상기 실험대조군을 의미하고, Dp는 제조예1의 일반 황칠나무 추출물을 시료로 처리한 실험군이고, Hy-Dp는 제조예2의 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 시료로 처리한 실험군이고, Arg는 아르기닌을 시료로 처리한 실험군이고, GABA는 가바를 시료로 처리한 실험군을 의미하며, 각 실험군에서 숫자로 표기된 부분은 처리 농도(㎍/㎖)를 의미하고, +로 표기된 부분은 두 개 이상의 시료가 동시 처리된 실험군을 의미한다.

도 2를 보면, 본 발명의 가수분해 효소 처리 황칠나무 추출물이 우수한 신경세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 제조예 2의 본 발명에 따른 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 일반 황칠나무 추출물, 아르기닌 또는 가바와 비교하여, 신경성 산화질소 합성효소의 함량을 현저하게 감소시키는 것으로 나타나, 매우 우수한 신경세포 보호효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

<생존 세포수 측정을 통한 신경세포 보호 효과 확인>

4,5-디메틸디아졸-2-일-2,5-데페닐테르라졸리움 프로미드(MTT) 실험은 죽은 세포는 4,5-디메틸디아졸-2-일-2,5-데페닐테르라졸리움 프로미드를 4,5-디메틸디아졸-2-일-2,5-데페닐테르라졸리움 프로미드-포르마잔으로 환원시키지 못하여, 이 포르마잔의 생산량이 살아있는 세포수와 상관관계를 이룬다는 점에서 세포증식능 혹은 세포상해성 측정법으로 사용한다. 본 실험은 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(M2128, St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하여 수행하였다. 담황색물질의 4,5-디메틸디아졸-2-일-2,5-데페닐테르라졸리움 프로미드는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 효소로 테트라졸리움 고리가 암청색의 포르마잔으로 변화하는데, 이 변화량을 570nm의 흡광도를 측정함으로 정량화 하였다.

제조예 1 및 2의 추출물, 아르기닌 및 가바를 각각 신경성 산화질소 합성효소(nNOS)를 초대배양한 cortex 세포에서 글루탐산염과 함께 처리했을 때, 글루탐산염을 함께 처리하지 않고 각 시료를 처리 하였을 때의 포르마잔의 양으로 살아있는 세포의 수를 측정하여 각각 도 3 및 도 4에 나타냈다. 도 3 및 4에서, Dp는 제조예1의 일반 황칠나무 추출물을 시료로 처리한 실험군이고, Hy-Dp는 제조예2의 가수분해 처리된 황칠나무 추출물을 시료로 처리한 실험군이고, Arg는 아르기닌을 시료로 처리한 실험군이고, GABA는 가바를 시료로 처리한 실험군을 의미하며, 각 실험군에서 숫자로 표기된 부분은 처리 농도(㎍/㎖)를 의미한다. 도 3에서, Glu+로 표기된 것은 글루탐산염이 시료와 함께 처리된 것을 의미한다. 도 4에서, 아무 시료도 처리하지 않은 대조군을 함께 나타냈다.

도 3을 보면, 제조예 1 및 2의 추출물, 아르기닌 및 가바는 글루탐산염과 함께 처리된 경우 농도의존적으로 신경세포 세포생존율을 증가시키는 것으로 나타나, 세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 제조예 2의 본 발명에 따른 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 일반 황칠나무 추출물, 아르기닌 또는 가바와 비교하여, 신경성 산화질소 합성효소의 함량을 현저하게 감소시키는 것으로 나타나, 매우 우수한 신경세포 보호효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

도 4를 보면, 제조예 2의 본 발명에 따른 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 글루탐산염을 제외하고 처리하였을 때, 살아있는 세포의 수가 농도가 높아짐에 따라 무처리군과 비슷하거나 조금 증가하는 것으로 나타나, 본 발명에 따른 가수분해 처리된 황칠나무 추출물은 추출물 자체 독성이 아르기닌 또는 가바와 비교하여 좀 더 낮은 것을 확인할 수 있다. 따라서, 인체에 안전한 조성물로 사용할 수 있는 것을 확인할 수 있다.

Claims

단백질 분해효소로 1차 가수분해 처리되고 브로멜라인 및 파파인을 포함하는 분해효소로 2차 가수분해 처리된 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 포함하는, 신경세포 보호를 통한 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 있어서,
상기 뇌질환은 파킨슨, 치매, 알츠하이머 및 외상으로 인한 뇌신경 손상 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 단백질 분해효소는 프로테아제를 포함하는, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 프로테아제는 트립신을 포함하는, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 L-아르기닌 15 내지 20mg/g 함량으로 포함하는, 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
삭제
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 한의 조성물을 포함하는, 뇌신경세포 보호를 통한 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 제제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 한의 조성물을 포함하는, 뇌신경세포 보호용 기능성 식품.