KR102655509B1 - 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물의 녹내장 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물의 녹내장 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 망막질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 호랑가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 산화스트레스로부터 유도한 망막신경세포의 퇴화를 막을 수 있어 노인성 황반 변성, 녹내장 등 망막질환 예방 및 치료용 조성물 또는 기능성 식품, 약제학적 의약품 소재로 유용한 효과가 있다.

Description

호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물의 녹내장 예방 및 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING GLAUCOMA USING MIXED EXTRACT OBTAIMED FROM ENZYME TREATING OF LEX CORNUTA AND STRYCHNOS NUX-VOMICA}
본 발명은 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물의 녹내장 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 호랑가시나무(Lex cornuta)를 포함하여 효소 처리한 혼합 추출물을 유효성분으로 하여 망막질환, 특히 녹내장의 예방 및 치료용 조성물, 또는 건강 식품에 관한 것이다.
많은 안질환들이 특정 세포의 세포 자살로 인해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 그 대표적인 안질환으로는 연령 관련 황반 변성 및 녹내장이 있다.
세포 자살은 세포괴사와 구별되는 세포 내 자발적이고 계획된 세포사로서, 유발하는 다양한 기전들이 제시되어 왔다. 대표적으로 산화 스트레스, 질소산화물 합성효소, 미토콘드리아를 매개로 하는 카스파제-의존적 또는 비의존적 기전 등이 있다.
이러한 안질환의 억제 및 치료를 위하여 세포 자살을 억제하거나 그 진행을 늦출 수 있는 약제에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.
눈의 각막, 수정체(렌즈) 및 유리체 등은 혈관이 없는 부위이기 때문에, 영양분을 공급하고 노폐물을 운반하기 위한 방수 기능의 물이 존재하고 있다. 그런데 방수는 정상으로 나오는데 반해 빠져나가는 부분이 망가진 경우, 방수는 계속 나오기 때문에 안압이 올라가게 된다. 안압이 올라가면 눈에 혈액이 들어오지 못할 뿐 아니라 시신경에 지속적인 압력을 가하게 되어 시신경이 치명적인 손상을 입게 되므로, 시력 및 시야의 결손을 초래하게 된다.
녹내장(glaucoma)은 이러한 안압의 상승으로 인해 시신경이 눌리거나 혈액 공급에 장애가 생겨 시신경의 기능에 이상을 초래하게 되는 질환으로, 말기에는 시력을 상실하게 되는 심각한 질환이다.
또한, 녹내장은 망막 신경 세포의 세포 사멸로 인한 시신경의 손상을 통해서 일어나게 되는데, 이러한 시신경의 손상은 특징적인 녹내장성 시야 손상을 동반한다. 녹내장에서 나타나는 망막 신경 세포의 세포 사멸은 세포 자살로 알려져 있다(Quigley HA et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 36, 774-786, 1995; Garcia-Valenzuela E et al., Exp Eye Res., 61, 33-44, 1995).
세포 내에 세포 사멸을 유도하는 기전과 억제하는 기전의 균형에 의하여 세포의 운명이 결정되는데, 녹내장에 있어서는 글루타메이트(glutamate), 사이토크롬 C(cytochrome c), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 및 Bad(BCL2-antagonist of cell death) 단백질의 증가 또는 발현이 망막 신경 세포를 세포 자살에 이르게 하는 것으로 알려져 있으며, 세포 내의 산화 스트레스(oxidative stress)도 녹내장의 중요한 원인으로 알려져 있다.
녹내장에서는 망막 신경 세포가 산화 스트레스를 받아 직접적으로 시신경을 손상에 이르게 할 뿐만 아니라, 방수 유출로를 구성하는 섬유주 세포(trabecular meshwork cell)가 산화 스트레스를 받음으로써, 그 결과 섬유주 세포의 기능저하가 일어나게 되고, 궁극에는 세포 자살이 일어나게 되어 안압이 상승하게 된다(Sacca' SC et al, Arch Ophthalmol., 123, 458-463, 2005; Zhou L et al., J Cell Physiol., 180, 182-189, 1999).
이처럼 망막 신경 세포와 섬유주 세포의 세포 자살을 억제하고 상기 세포의 산화 스트레스를 억제하는 것이 새로운 해결책으로 시도되고 있다.
한편, 호랑가시나무(Lex cornuta)는 구골목(Lleycornuta Lind)으로도 불리며, 맛이 달고 성질은 평한 것으로 알려져 있고, 사포닌, 타닌, 코미진, 지방유, 알카로이드 등이 함유되어 있으며, 주로 백반증, 폐결핵, 관절통, 요통, 신경통, 두통, 눈의 충혈, 치통 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 각종 뼈질환에 효력을 발휘하는 것으로 알려져 있기도 하나, 망막 신경 세포를 보호함으로써 망막질환을 예방 또는 치료하는 성능과 관련하여 호랑가시나무(Lex cornuta)에 대해 개시되거나 공개된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 망막 신경 세포를 보호하는 조성물에 대한 연구를 하던 중, 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 사용한 혼합물로부터 망막 신경 세포를 보호하는 효과와 더불어 산화 스트레스 억제 효과를 발현할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 호랑가시나무(Lex cornuta)를 포함하는 추출물을 유효성분으로 하는 효소처리액의 초음파 추출물을 이용한 망막 신경 세포 보호능과 더불어 산화 스트레스 억제능을 동시에 발현하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명된 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 이용한 고상의 건조물에 추출용매와 다당류 분해효소인 펙티넥스(Pectinex)와 비스코자임(Viscozyme)을 이용하여 얻어진 효소 처리액의 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)는 호랑가시나무(a) : 마전자나무(b)가 1:0.5~5 중량비를 만족할 수 있다.
상기 추출용매는 상기 고상의 건조물 중량 대비 5 내지 20 배의 중량, 그리고 상기 펙티넥스와 비스코자임은, 상기 고상의 건조물과 추출용매의 총 중량 대비 0.2 내지 0.7 배의 중량일 수 있다.
상기 펙티넥스 및 비스코자임은 1: 0.5~1.5의 중량비로 포함할 수 있다.
상기 효소 처리는 20 내지 70℃ 하에, 1 내지 5시간 동안 50 내지 500 rpm 교반하면서 수행할 수 있다.
상기 초음파 추출은 25 내지 75 kHz의 주파수에서 20 내지 70℃ 하에 10 내지 180분간 처리 후, 리플럭스 하에 60 내지 70℃ 에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, 그리고 산화스트레스 억제 효과 및 세포 사멸 효과를 동시에 발현하는 호랑가시나무 유래 효소처리액의 초음파 추출물을 유효성분으로 하여 산화스트레스로부터 유도한 망막신경세포의 퇴화를 막을 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
특히, 노인성 황반 변성, 녹내장 등 망막질환 예방 및 치료용 조성물 또는 기능성 식품, 약제학적 의약품 소재 등 다양한 관련 분야에 적용 가능하다.
도 1은 실시예 1에서 수득된 샘플(LS-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(LS-1 내지 LS-3)의 4종에 대해 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 측정결과를 대비한 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 샘플(LS-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(LS-1 내지 LS-3)의 4종에 대한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 대비한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 수득된 샘플(LS-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(LS-1 내지 LS-3)의 4종에 대한 LDH 세포사멸 효과를 대비한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 수득된 샘플(LS-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(LS-1 내지 LS-3)의 4종에 대한 카스파제 활성 효과를 대비한 그래프이다.
도 5는 실시예 1에서 수득된 샘플(LS-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(LS-1 내지 LS-3)의 4종에 대한 세포독성을 대비한 그래프이다.
이하 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 점을 감안하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 이용한 고상(solid phase)의 건조물을 제조하고 여기에 추출용매 및 효소를 이용하여 얻어진 효소처리액을 추출액을 초음파 처리하는 방식으로 추출물을 제조할 경우 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, 그리고 산화스트레스 억제 효과 및 세포 사멸 효과를 동시에 발현함으로써, 산화스트레스로부터 유도한 망막신경세포의 퇴화를 막을 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
에탄올 환류 추출물, 에탄올 단일효소 추출물, 혹은 에탄올 복합효소 추출물 등은 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, 그리고 산화스트레스 억제 효과 및 세포 사멸 효과를 동시에 나타내지 않았으며, 또한 아래의 실험예에서 제시되어 있지 않지만, 호랑가시나무(Lex cornuta)의 함량 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)의 합량이 1: 0.5~5의 중량비를 만족하지 못하는 경우에도 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, 그리고 산화스트레스 억제 효과 및 세포 사멸 효과를 동시에 나타내지 않거나 효과가 감소하였다.
본 발명의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, 그리고 산화스트레스 억제 효과 및 세포 사멸 효과를 동시에 구현하는 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 망막질환 예방 및 치료용 조성물은 호랑가시나무(Lex cornuta)에 마전자나무(Strychnos nux-vomica)의 1: 0.5~5의 중량비로 혼합한 다음 수득한 고상물(solid phase product)에 추출용매 및 효소를 이용하여 얻어진 효소처리액의 초음파 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 망막질환 예방 및 치료용 조성물은 바람직하게는 호랑가시나무(Lex cornuta)에 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 1: 0.5~5의 중량비로 혼합한 다음 수득한 고상물(solid phase product)에 추출용매 및 효소를 이용하여 얻어진 효소처리액의 초음파 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 기재에서 유효성분은 달리 특정하지 않는 한, 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 기재에서 추출물은 달리 특정하지 않는 한, 추출 대상인 그 고상물 자체를 추출용매를 이용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출, 초음파 추출, 효소처리 등의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합, 정치시켜 얻은 분획물, 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하며, 식물을 압착하여 얻어지는 진액 추출물, 오일 추출물, 식물을 유기용매, 또는 물로 추출하여 얻는 추출물, 식물을 연소시킬 때 기체를 냉각하여 얻는 추출물 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 기재에서, 상기 고상물의 형상은 특별히 제한하지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태 등일 수 있다.
상기 고상물은 호랑가시나무(Lex cornuta)와 마전자나무(Strychnos nux-vomica)을 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에 파쇄한 다음 효소처리에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 호랑가시나무 및 마전자나무는 달리 특정하지 않는 한, 다양한 기관 또는 부분(예 잎, 가지, 꽃, 뿌리, 줄기, 열매 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 각각의 잎 또는 열매로부터 얻은 추출물이고, 가장 바람직하게는 각각의 열매로부터 얻은 추출물을 의미한다.
마전자나무(Strychnos nux-vomica) 의 여문 씨를 말려 사용하는 마전자(Nux-Vomica)는 위경, 간경에 작용하는 것으로 알려져 있으며, 현재까지 마전자의 거담, 지해, 항암 작용 등의 효능 정도가 추가로 알려져 있다.
또한, 분쇄물 형태 그대로, 또는 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용될 수 있으며, 분쇄물 형태로 사용하는 경우 효소처리 후, 효소의 가수분해(효소분해) 시간을 단축하고 효소분해 수율을 향상시킬 수 있어 바람직하다.
상기 효소 처리는 다당류 분해효소를 사용하여 효소분해를 함으로써 기능성분을 더욱 증대시킬 수 있다.
상기 다당류 분해효소는 펙티넥스(Pectinex) 및 비스코자임(Viscozyme)의 상용 효소를 사용할 수 있다.
상기 펙티넥스(Pectinex)는 펙티나아제, 및 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 활성을 가지는 효소인데, 일례로 NOVOZYMES A/S 의 PECTINEX ULTRA SP-L 제품을 사용할 수 있다.
상기 비스코자임(Viscozyme)은 상용효소로서, 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus) 유래 아라바나아제, 셀룰라아제, β-글루카나아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제를 포함하는 복합 효소(Beta-Glucanase)인데, 일례로 NOVOZYMES A/S 의 VISCOZYME L 제품을 사용할 수 있다.
상기 펙티넥스와 비스코자임은, 상기 고상의 건조물과 추출용매의 총 중량 대비 0.2 내지 0.7 배의 중량, 또는 0.3 내지 0.5 배의 중량으로 사용될 수 있다. 상기 범위를 만족하면, 호랑가시나무와 마전자나무의 효소분해를 최적화할 수 있다.
구체적으로, 상기 펙티넥스 및 비스코자임은 1: 0.5~1.5의 중량비로 포함할 수 있다.
효소처리에 사용할 수 있는 추출용매는 일례로 물, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
상기 추출용매는 상기 고상 건조물 무게 대비 일례로 5 내지 20배, 구체적인 예로 8 내지 15배로 투입하고 효소 처리하는 것이 효소분해효율을 극대화할 수 있어 바람직하다.
효소 처리시 용매로 물을 사용하는 것이 효소 처리시 알코올을 사용한 다음 알코올을 추출하는 경우보다 개선된 성능을 제공할 수 있어 바람직하다.
즉, 상기 효소처리액은 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 이용한 고상의 건조물의 효소처리 추출물 수용액일 수 있다.
상기 효소 처리는 20 내지 70℃ 하에, 1 내지 5시간 동안 50 내지 500 rpm 교반하면서 수행할 수 있다. 이 경우에 유효물질 추출효율 증대를 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 효소 처리는 35 내지 60℃ 하에, 2 내지 4시간 동안 100 내지 300 rpm 하에 수행할 수 있다.
상기 효소처리액에 대해 초음파 추출을 수행한다.
상기 초음파 처리는 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 처리법으로, 초음파가 추출용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격 효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출 효율을 증가시킬 수 있다.
초음파 추출법에 사용하는 추출용매 관련하여, 본 발명의 경우에는 효소처리에 충분한 추출용매를 사용하였으며 별도로 사용하지 않아도 무방하다.
또한, 추출의 온도 및 압력 조건에 따라 유효성분의 성질 변화가 가능하다. 예를 들어 초음파 추출액을 고온조건으로 추출한 경우, 유효성분에 대한 용해력이 떨어져 추출물 중 당의 농도가 높아지게 된다.
원료의 유리지방산 함량은 원산지나 작황에 따라 차이가 발생하며 보통 낮은 산가의 원료는 높은 가격으로 형성되어 있기 때문에 원료 경쟁력에서 떨어지게 된다. 게다가 유리지방산이 없는 원료는 없기 때문에 추출물 농축 분획구간에는 유리지방산이 농축되어 낮은 산가의 원료를 사용하는 규격을 설정하고 제품을 만든다고 해도 어느 농도 이상의 유효성분 함량을 충족하면서 산가 규격을 충족시키는 것이 쉬운 일은 아니다. 이에 효소처리액을 이용하여 고농도 분획물을 만드는 공정이 산업적 안정성을 갖기 위해서는 초음파 추출 분획물에서 유리지방산을 제거하는 기술이 필요하다.
본 발명에 따르면, 유효성분 함량을 극대화하고 유리지방산의 함량을 낮춘 추출물을 제공하도록, 상기 초음파 추출은 일례로 25 내지 75 kHz의 주파수에서 20 내지 70℃ 하에 10 내지 180분간 추출을 수행하는 것이 바람직하다. 이 경우에 유효물질 추출효율 증대를 제공할 수 있다. 상기 초음파 추출은 35 내지 60 kHz의 주파수에서 35 내지 50℃ 하에 30 내지 90분간 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 초음파 추출 후 리플럭스 하에 환류 추출을 수행할 수 있다.
환류 추출에 사용할 수 있는 추출용매는 일례로 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 알코올류를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 알코올로는 50 내지 90%(v/v) 에탄올을 사용하는 것이, 높은 항균력과 극성을 제공할 수 있어 바람직하며, 특히 70%(v/v) 에탄올의 경우에 농도가 더 높은 에탄올을 사용하는 것보다 살균력이 개선될 수 있다.
상기 알코올은 초음파 추출물의 무게 대비 5 내지 20배, 구체적으로 7 내지 12배의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 환류 추출은 20 내지 70℃ 하에 12시간 이하, 또는 40 내지 70℃ 하에 1 내지 6시간 동안 반복하여 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.
전술한 유리지방산은 제거하되 유효성분 손실은 없으며 효능에 영향을 주지 않는 정제 공정이 필요하며, 이를 위하여 미세 여과막을 사용하여 여과한 다음 감압 농축하여 유리지방산을 제거하는 방법이 바람직하고, 보다 우수한 효능효과를 제공하도록 미세 여과막은 1.0 ㎛ 이하, 바람직하게는 0.45 ㎛ 이하의 여과막을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
전술한 정제 공정을 거쳐 유효 추출물을 수득할 수 있다.
본 기재에서 유효 추출물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압농축 등의 방식으로 환류 추출에 앞서 투입된 추출용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고상의 추출물이 포함된다.
본 기재에서, 결과 추출물의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태를 비롯한 분말 또는 기타 추출물 형태일 수 있다.
본 기재에 따른 추출물 제조방법은, 일례로 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 깨끗이 세정한 다음 수득된 고상물 또는 그 건조물로부터 효소처리하는 단계; 및 효소처리액을 초음파 추출하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 기재에서 상기 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)은 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에(고상물의 수분 함량이 10%(w/w) 이하가 되도록 분쇄물 형태로) 10 내지 50 메쉬, 구체적으로는 30 내지 50 메쉬로 파쇄하여 표면적을 높인 다음 초음파 전처리에 사용될 수 있다.
필요에 따라서는 95℃ 이하, 또는 50 내지 90℃에서 36시간 이상, 또는 48시간 이상 건조한 다음 분쇄할 수 있다.
상기 고상물은 초음파 추출하기에 앞서 사전추출 단계를 수행할 수 있다.
본 기재에서 사용되는 고상물에는 특별한 제한이 없으며, 해당 사전추출 단계는 고상물 또는 그 건조물(고상의 건조물이라고도 함)의 표면에서 미생물, 잔류농약, 보존제 등의 유해물질을 제거하기 위한 처리, 초음파의 접촉 면적을 증가시키기 위한 처리 등을 포함할 수 있다.
상기 사전추출 방법은 특별히 제한되지 않으나, 효소 처리, 자외선 조사, 열처리, 박피, 분쇄, 배전 중 1 이상을 사용할 수 있으며, 추가 부산물의 생성을 방지하면서 고순도로 분쇄할 수 있고 효소로 유효성분을 충분히 분해할 수 있는 효소 처리가 가장 바람직하다.
효소 처리할 경우, 고상의 건조물에 추출용매를 공급하여 처리 효율을 높이는 것이 바람직하며, 이때 사용가능한 추출용매는 물, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 이때 추출용매를 상기 고상의 건조물의 무게 대비 5 내지 20배로 포함할 수 있다.
상기 효소는 다당류 분해 효소인 펙티넥스(Pectinex) 및 비스코자임(Viscozime)을 1:0.5 내지 1.5의 중량비로 병용 사용한다.
상기 효소 처리는 일례로 20 내지 70℃ 하에, 1 내지 5시간 동안 50 내지 500 rpm 교반하면서 수행하는 것이 유효물질 추출효율 증대를 제공할 수 있다.
이어서,효소처리액을 초음파 처리한다.
상기 초음파 처리 조건은 25 내지 75 kHz의 주파수에서 20 내지 70℃ 하에서 수행할 수 있다. 상기 범위 내에서 초음파 처리효율을 최적화할 수 있다.
상기 초음파 추출은 일례로 10 내지 180분간, 또는 5 내지 30분간 수행될 수 있다.
초음파 추출한 다음 리플럭스 하에 후추출을 수행할 수 있다. 이때 20 내지 70℃ 하에 12시간 이하, 또는 40 내지 70℃ 하에 1 내지 6시간 동안 반복하여 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.
상기 초음파 추출물은 앞서 설명한 70% 에탄올을 초음파 추출물의 무게 대 비 5 내지 20배의 중량으로 투입하고 반복 환류추출 및 감압 농축하여 추출용매를 제거하고 유효 추출물을 분리해낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분 이외에 눈 건강을 유지하고 안질환을 예방하기 위하여 당업계에 공지된 눈 관련 기능성 성분, 자외선 보호 성분 등을 포함하여 제조될 수 있다.
상기 기능성 성분으로 루테인, 오메가3, 감마리놀렌산, 제아잔틴, 아연, 아스타잔틴, 안토시아닌, 징코빌로바, 비타민 A, 비타민 C 등을 들 수 있다.
상기 자외선 보호 성분으로서는 드로메트리졸, 드로메트리졸트리실록산, 디갈로일트리올리에이트, 디메치코디에칠벤잘말로네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 소나무 껍질 추출물 등의 복합물, 포스파티딜세린, 핑거루트 추출 분말, 홍삼과 산수유 등의 복합 추출물 등을 들 수 있다.
기타 기능성 성분, 자외선 보호 성분들에 대해서는 건강기능식품에 관한 법률의 건강기능식품공전(식약처고시 "건강기능식품 기준 및 규격)을 참조할 수 있다. 이러한 성분들은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분을 제품 유형, 제품의 제형 등에 따라 항산화 효과, 미백 효과, 각질 박리 효과 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 함량 (유효량)으로 포함할 수 있는데, 해당 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 15 wt% 범위 내에서 결정될 수 있다.
본 발명에서 유효량은, 달리 특정하지 않는 한 그 적용 대상인 포유동물, 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 항산화 효과, 미백 효과, 각질 박리 효과 등 의도한 의료적/화장품학적 효과 등을 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 기능상의 구분에 있어서 제조/유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에 관한 법률에 따른 건강기능 식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 두유류, 발효음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해되는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있다.
이들 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다.
합성 풍미제도 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
산미료로는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 약제학적 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 약제학적으로 허용이란, 달리 특정하지 않는 한 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 적합한 담체로는, 일례로 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다.
주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다.
비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001 mg/kg 내지 10 g/kg 범위, 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 식품 조성물, 약제학적 조성물은 해당 분야에 공지된 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에서 통상적으로 행하여지는 해당 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
본 기재의 망막질환 예방 및 치료용 조성물을 설명함에 있어서, 명시적으로 기재하지 않은 다른 조건이나 장비 등은 당업계에서 통상적으로 실시되는 범위 내에서 적절히 선택할 수 있고, 특별히 제한되지 않음을 명시한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정하는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1> 초음파효소가수분해 호랑가시나무 추출물의 제조
(1) 호랑가시나무(Lex cornuta) 열매 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica) 열매를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(2) 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 증류수, 및 고상 건조물과 증류수 총 무게의 0.4배의 다당류 분해효소, 펙티넥스(Pectinex)와 비스코자임(Viscozyme)을 1:1 중량비로 첨가하고 50 ℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 교반하였다.
(3) 그런 다음 효소처리액을 초음파 추출기에 넣고 50 ℃ 하에 2시간 동안 주파수 50 kHz 로 처리하였다.
(4) 상기 초음파 처리물 무게의 10배의 70% 에탄올을 투입하고 60 ℃에서 3시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 초음파효소가수분해 호랑가시나무 추출물(샘플 LS-4)을 제조하였다.
<비교예>
<비교예 1> 환류 호랑가시나무 추출물의 제조
(1) 호랑가시나무(Lex cornuta) 열매 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica) 열매를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(4') 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 70% 에탄올을 투입하고 60 ℃에서 3시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 환류 호랑가시나무 추출물(샘플 LS-1)을 제조하였다.
<비교예 2> 단일효소가수분해 호랑가시나무 추출물의 제조
(1) 호랑가시나무(Lex cornuta) 열매 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica) 열매를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(2') 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 증류수, 및 고상 건조물과 증류수 총 무게의 0.4배의 다당류 분해효소, 펙티넥스(Pectinex)를 첨가하고 50 ℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 교반하였다.
(4”) 상기 초음파 처리물 무게의 10배의 70% 에탄올을 투입하고 60 ℃에서 3시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 단일효소가수분해 호랑가시나무 추출물(샘플 LS-2)을 제조하였다.
<비교예 3> 복합효소가수분해 호랑가시나무 추출물의 제조
(1) 호랑가시나무(Lex cornuta) 열매 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica) 열매를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(2) 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 증류수, 및 고상 건조물과 증류수 총 무게의 0.4배의 다당류 분해효소, 펙티넥스(Pectinex)와 비스코자임(Viscozyme)을 1:1 중량비로 첨가하고 50 ℃에서 3시간 동안 200 rpm으로 교반하였다.
(4”') 상기 효소처리액 무게의 10배의 70% 에탄올을 투입하고 60 ℃에서 3시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 복합효소가수분해 호랑가시나무 추출물(샘플 LS-3)을 제조하였다.
<실험예>
<실험예 1> 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량실험
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 실험을 수행하였다.
(1-1) 총 폴리페놀 함량
샘플들(LS-1 내지 LS-4)을 각각 100 mg씩 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 희석하여 검액으로 한다. 따로 갈릭산(gallic acid) 100 mg을 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 한다. 이 액을 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 mL을 취하여 5 mL로 희석한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 e-tube에 100 ㎕와 10 % sodium carbonate 100 ㎕를 가한 뒤 Folin-Ciocalteu 시약 100 ㎕를 넣고 30초간 vortex를 이용하여 섞어준 뒤 30분간 암소에 방치한 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 측정된 흡광도를 표준액의 검량선을 그려 총 폴리페놀 함량을 mg GAE/g으로 하기 도 1에 나타내었다.
(1-2) 총 플라보노이드 함량
샘플들(LS-1 내지 LS-4)을 각각 100 mg씩 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 희석하여 검액으로 한다. 따로 quercetin 100 mg을 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 한다. 이액을 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 mL을 취하여 5 mL로 희석한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 e-tube에 500 ㎕와 10 % aluminum nitrate 100 ㎕와 1 M potassium acetate 100 ㎕를 넣어 혼합한다. 혼합 40분 후 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 415 nm 흡광도를 측정하여 흡광도를 측정한다. 측정된 흡광도를 표준액의 검량선을 그려 총 플라보노이드 함량을 mg QE/g 으로 하기 도 1에 함께 나타내었다.
하기 도 1에서 보듯이, 실시예 1에 따른 샘플(LS-4)의 경우 폴리페놀 함량 분석 결과 4.48 mgGAE/g으로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(LS-3)의 경우 3.79 mgGAE/g, 비교예 2에 따른 샘플(LS-2)의 경우 3.19 mgGAE/g, 비교예 1에 따른 샘플(LS-1)의 경우 2.62 mgGAE/g의 폴리페놀 함량을 각각 나타내었다.
또한, 실시예 1에 따른 샘플(LS-4)의 경우 플라보노이드 함량 분석 결과 3.21 mgGAE/g으로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(LS-3)의 경우 2.99 mgGAE/g, 비교예 2에 따른 샘플(LS-2)의 경우 2.65 mgGAE/g, 비교예 1에 따른 샘플(LS-1)의 경우 2.14 mgGAE/g의 플라보노이드 함량을 각각 나타내었다.
따라서 초음파효소가수분해 처리를 하였을 때, 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량 모두 증가하는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 2> 항산화활성 시험
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 항산화 시험으로 시료의 라디칼 소거능을 평가할 수 있는 ABTS법 및 DPPH법 radical 소거능 실험을 수행하였다.
(2-1) ABTS 라디칼 소거활성
샘플들(LS-1 내지 LS-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 암실에서 12시간동안 상온에서 반응시켜 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 에탄올을 넣어 조절하였다.
96 웰 플레이트에 검액 100 ㎕와 조제한 ABTS 용액 100 ㎕를 가하여 7 분간 실온에서 반응하여 734 nm에서 측정한다. 공시험액과 비교하여 ABTS 소거율을 다음과 같이 백분율(%)로 구하고 하기 도 2에 나타내었다.
ABTS radical 소거능 (%) = [Control - (Sample - Blank)]/Control Х 100
(단, Control : ABTS reagent의 흡광도, Sample : Sample + ABTS reagent의 흡광도, Blank : Sample + Blank의 흡광도)
(2-2) DPPH 라디칼 소거활성
샘플들(LS-1 내지 LS-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 96 웰 플레이트에 검액 100 ㎕와 0.2 mM DPPH 100 ㎕를 넣고 30분 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 공시험액과 비교하여 DPPH radical 소거율을 다음과 같이 백분율(%)로 구하고 하기 도 2에 나타내었다.
DPPH radical 소거능 (%) = [Control - (Sample - Blank)]/Control Х 100
(Control : DPPH reagent의 흡광도, Sample : Sample + DPPH reagent의 흡광도, Blank : Sample + Blank의 흡광도)
하기 도 2에서 보듯이, ABTS radical 분석 결과 대조군인 아스코르브산이 500 ㎍/mL에서 98.3%로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 실시예 1에 따른 샘플(LS-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 78.6%로 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(LS-3), 비교예 2에 따른 샘플(LS-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(LS-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 각각 71.4%, 63.6%, 52.6%를 나타내었다.
또한, DPPH radical 분석 결과, 전술한 ABTS 분석결과와 같은 경향을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 1에 따른 샘플(LS-4), 비교예 3에 따른 샘플(LS-3), 비교예 2에 따른 샘플(LS-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(LS-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 각각 87.8%, 86.5%, 70.4%, 65.7%를 나타내었다. 이때 대조군인 아스코르브산은 500 ㎍/mL에서 99.6%로 분석되었다.
<실험예 3> 망막신경세포 보호효과
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1 내지 LS-4)에 대한 망막신경세포 보호실험으로 산화스트레스 유도 망막신경절세포를 배양하여 산화 스트레스 억제 여부를 확인하도록 LDH(Lactate dehydrogenase) 세포사멸 실험과 카스파제(Caspase-3) 활성 평가 실험을 수행하였다.
산화스트레스 유도 망막신경절세포 배양
망막신경절세포(Retinal ganglion cell, RGC-5, ATCC)는 망막의 가장 안쪽에서 위치하며, 망막에 형성된 시각정보를 뇌 시상의 외측슬상핵으로 전달하는 역할을 한다. 노화 및 알츠하이며, 파킨슨 질환같은 퇴행성 신경질환의 증상으로 산화적 스트레스가 있으며, 이는 망막신경절세포의 손상으로 시신경의 퇴행이 발생하여 시약감소 및 녹내장을 유발하게 된다. 망막신경절세포에 산화적스트레스의 보호를 확인하기 위하여 세포실험 모델로 진행하였다.
망막신경절세포는 1% Penicillin streptomycin과 10% Fetal bovine serum(FBS)가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 사용하여 1.0x104 cell/well의 RGC-5를 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 12시간동안 배양하였다. 이후 1μM의 staurosporine을 6시간 동안 처리하여 분화를 유도하였다. 분화된 배지에 실험물질(LS-1~4)을 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL로 30분간 처리하고 0.5 mM L-buthionine-(S,R)-sulfoximine(BSO)와 5 mM glutamate를 24시간 동안 배양하여 산화스트레스를 유도하였다.
(3-1) LDH 세포사멸
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1 내지 LS-4)에 대한 LDH 세포사멸은 망막신경절세포를 staurosporine로 분화시킨 후, BSO와 glutamate로 산화스트레스를 유도한 배지를 사용하여 실험물질의 농도가 100~500 μg/mL에서 세포사멸 보호를 확인하였다. LDH(Lactate dehydrogenase)는 apoptosis 혹은 necrosis등에 의하여 죽거나 손상된 세포에서 세포질 밖으로 방출되어 세포사멸을 측정할 수 있다.
구체적으로, Lactate dehydrogenase(LDH)는 산화스트레스유도 망막신경절세포 배양방법에 따라 상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1 내지 LS-4)을 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 처리 후, BSO와 glutamate로 산화스트레스를 유도하여 24시간 배양한 배지를 25 ㎕씩 취하여 96 well plate에 옮긴다. NADH 용액(0.03% β-NAD in phosphate buffer) 100 ㎕와 pyruvate 용액(22.7 mM pyruvic acid in phosphate buffer) 25 ㎕를 첨가하여 NADH 소모량을 340 nm에서 2분간 측정하였다. 흡광도는 분당 평균흡광도를 구하여 대조군의 흡광도 변화에 백분율로 평가하고, 하기 도 3에 나타내었다.
하기 도 3에서 보듯이, LDH 세포 사멸 분석결과, 대조군의 PDH 농도가 정상군 대비 270 %로 가장 높게 확인되었고 이로부터 산화스트레스로 인해 세포의 LDH 가 세포질 밖으로 방출된 것을 알 수 있다.
실시예 1에 따른 샘플(LS-4)의 경우 정상군 대비 148.7 %로 가장 낮게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(LS-3), 비교예 2에 따른 샘플(LS-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(LS-1) 순서로 정상군 대비 154.5 %, 161.6 %, 178.5 %로 산화 스트레스 억제 효과를 확인할 수 있었다.
(3-2) 카스파제 활성
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1~4)의 Caspase-3 활성은 망막신경절세포를 staurosporine로 분화시킨 후, BSO와 glutamate로 산화스트레스를 유도한 배지를 사용하여 실험물질의 농도가 100~500 μg/mL에서 caspase-3 활성을 평가하였다. Caspase-3은 불활성형 effector caspase로, initiator caspase(caspase-8, 9 등)에 의해 활성화 되어 apoptosis 과정을 증폭하는 역할을 하여 caspase-3 활성을 분석하는 것으로 세포보호 영향을 비교할 수 있다.
구체적으로, Caspase-3 활성 평가는 전술한 (3-1)산화스트레스 유도 망막신경절세포 배양방법에 따라 상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1~4)을 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 처리 후, BSO와 glutamate로 산화스트레스를 유도하여 24시간 배양한 배지를 사용한다. 이후 lysis buffer(10 mM Tris/HCl, 0.32 M sucrose, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100, 1 ㎍/mL aprotinin, 10 ㎍/mL leupeptin, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 8.0)로 용해한다. 이후 4 ℃ 10,000 rpm으로 5분간 원심분리한다. 추출한 200 ㎍의 단백질을 200 μM Ac-DEVD-p-NA와 배양 후, 효소에 의해 분해되어 생성된 p-NA 양을 microplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 하기 도 4에 나타내었다.
하기 도 4에서 보듯이, Caspase-3 활성 분석결과, 대조군의 PDH 농도가 정상군 대비 199 %로 가장 높게 확인되었고 이로부터 산화스트레스로 인해 Caspase-3가 활성화된 것을 알 수 있다.
실시예 1에 따른 샘플(LS-4)의 경우 정상군 대비 112.6 %로 가장 낮게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(LS-3), 비교예 2에 따른 샘플(LS-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(LS-1) 순서로 정상군 대비 115.2 %, 131.7 %, 138.3 %로 산화 스트레스 억제 효과를 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 안전성 시험
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1~4) 에 대한 안전성 평가(세포독성 확인)를 위해 MTS 분석을 진행하였다. 상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(LS-1~4)의 농도는 100 내지 500 ㎍/mL로 설정하였으며, 망막신경절세포를 staurosporine로 분화시킨 배지를 사용하여 시험물질의 세포독성을 확인하였다.
구체적으로는, 1 μM의 staurosporine을 이용하여 분화시킨 망막신경절세포(Retinal ganglion cell, RGC-5)를 1Х104 cell/ml 씩 분주하여 24시간 배양 후 실험물질(LS-1~4)을 100~500 μg/ml의 농도로 희석후 첨가하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTS 시약 20 μL를 넣고 2시간 동안 배양 후, microplate reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율(cell viability)은 아래의 식으로 계산하고, 하기 도 5에 결과를 나타내었다.
[식 1]
세포 생존율(%) = [(Exp. - Blank)/Control] Х 100
(상기 식 1에서, Exp: 세포를 포함한 추출물의 흡광도, Blank: 세포를 포함하지 않은 추출물의 흡광도, Control: 세포를 포함한 증류수의 흡광도이다.)
하기 도 5에서 보듯이, 분화된 망막신경절세포에서 실험물질의 세포독성 결과, 모든 농도에서 세포생존율이 95 % 이상임을 확인하였다. 따라서, 실험물질(LS-1~4)은 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
결론적으로, 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 이용한 고상의 건조물에 추출용매 및 효소를 이용하여 얻어진 효소처리액의 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 경우, 수득된 조성물은 ABTS, DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 탁월하며, 산화스트레스 억제 효과를 발휘하여 효소처리액의 초음파 추출물을 이용한 망막 신경 세포 보호 효과와 산화스트레스로부터 유도한 망막신경세포의 퇴화를 막을 수 있는 조성물에 적합함을 확인할 수 있다.

Claims (6)

  1. 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)를 이용한 고상의 건조물에 추출용매와 다당류 분해효소인 펙틴 가수분해 효소와 탄수화물 가수분해 효소를 이용하여 얻어진 효소 처리액의 초음파 추출물로서,
    상기 펙틴 가수분해 효소는 펙티넥스(Pectinex)를 사용하고,
    상기 탄수화물 가수분해 효소는 비스코자임(Viscozyme)를 사용하며,
    상기 초음파 추출은 25 내지 75 kHz의 주파수에서 20 내지 70℃하에 10 내지 180분간 처리 후, 리플럭스 하에 60 내지 70℃에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것을 특징으로 하는 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 호랑가시나무(Lex cornuta) 및 마전자나무(Strychnos nux-vomica)는 호랑가시나무(a) : 마전자나무(b)가 1:0.5~5 중량비를 만족하는 것인 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출용매는 상기 고상의 건조물 중량 대비 5 내지 20 배의 중량, 그리고 상기 펙티넥스와 비스코자임은, 상기 고상의 건조물과 추출용매의 총 중량 대비 0.2 내지 0.7 배의 중량인 것인 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 펙티넥스 및 비스코자임은 1: 0.5~1.5의 중량비로 포함하는 것인 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 효소 처리는 20 내지 70℃ 하에, 1 내지 5시간 동안 50 내지 500 rpm 교반하는 것인 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물.
  6. 제1항의 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹내장 예방 및 치료용 조성물.
KR1020210119609A 2021-09-08 2021-09-08 호랑가시나무 및 마전자나무를 효소 처리한 혼합 추출물의 녹내장 예방 및 치료용 조성물 KR102655509B1 (ko)

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