KR101584513B1 - 뇌신경세포 보호 기능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌신경세포 보호 기능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마우스 해마 세포인 HT22 세포주에서 글루타메이트 (glutamate)에 의해 유도된 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 효능과, 마우스 미세아교세포인 BV2 세포주에서 LPS로 활성화되어 분비되는 염증매개물질을 억제하는 항염증 효능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차에 관한 것이다.

Description

뇌신경세포 보호 기능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차{A FERMENTED BOEHMERIA NIVEA FOR PROTECTING BRAIN NEURORAL CELLS AND A FERMENTED TEA USING THE FERMENTED BOEHMERIA NIVEA}

본 발명은 뇌신경세포 보호 기능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마우스 해마 세포인 HT22 세포주에서 글루타메이트 (glutamate)에 의해 유도된 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 효능 및 마우스 미세아교세포인 BV2 세포주에서 LPS로 활성화되어 분비되는 염증매개물질을 억제하는 항염증 효능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차에 관한 것이다.

'100세 시대'라는 말이 나올 정도로 현대 사회는 의학기술이 발전하여 평균 수명이 증가함에 따라 노인 인구의 비율이 급격하게 증가하고 있다.

이렇게 노령화 사회로 진입함에 따라, 나이가 들면서 나타나는 퇴행성 질환이 커다란 의료 및 사회적 문제로 대두되고 있으며, 특히 퇴행성 뇌질환의 경우 노인 질환의 발병 순위 1위를 차지할 정도로 높은 비율을 보이고 있다.

퇴행성 뇌질환이란 뇌신경세포가 손상되어 초래되는 질환으로, 발병이나 진행 기전에 관한 구체적인 이해가 부족하여 근본적인 치료법이 없는 상황이다.

현재까지 관련 연구에 의해 퇴행성 뇌질환의 원인으로 유전적인 요인, 산화적 스트레스, 과도한 염증반응, 비정상적인 펩타이드의 축적 등 다양한 요인이 알려지고 있다.

퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease) 및 루게릭병으로 잘 알려진 근위축성 측삭경화증 (ALS; Amyotrophic Lateral Sclerosis) 등이 대표적인 질환이다.

먼저, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)은 대뇌피질의 신경세포가 사멸하여 대뇌의 전두엽과 측두엽의 뇌회가 위축되거나 줄어드는 퇴행성 뇌질환으로, 노화의 과정 속에서 뇌조직이 기능을 잃으면서 나타나는 치매의 원인 중 하나이다. 처음에는 건망증으로 시작되어 말기에는 인격이 와해되며 정신병 증상 등이 나타난다. 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 유전, 신경계 구조적 변화, 염증성 매개물, 콜린성 신경계, 기타 신경전달물질의 이상으로 추측하고 있다.

파킨슨병 (Parkinson's disease)은 팔, 다리 또는 전신이 떨리고 뻣뻣해지며 중심을 잡지 못하는 퇴행성 신경질환이다. 이는 뇌신경세포의 문제로 신경전달물질인 도파민 분비에 이상이 생기면서, 뇌의 특정 신경세포가 점차 파괴되어 나타난다.

파킨슨병의 전형적인 증상은 떨림과 근육 경직 및 몸동작이 느려지는 운동장애이다. 이 병은 진행속도가 느리기 때문에 언제부터 시작되었는지 정확히 알기 어려우며, 증상이 발견되어 병을 의심할 때에는 이미 뇌의 흑질 부위의 신경세포가 상당히 변성된 경우가 많다. 이 밖에도 얼굴 표정이 굳어지고 걸음걸이의 보폭이 짧아지며, 우울증이나 대소변 장애가 나타날 수도 있다.

헌팅턴병 (Huntington's disease)은 뇌의 미상핵 (caudate nucleus)과 조가비핵 (putamen)에서 신경세포의 퇴행이 원인이다. 헌팅턴병은 제어할 수 없는 몸의 움직임을 동반하는데, 특히 팔, 다리가 경련하듯 움직이곤 한다. 이 병은 더욱 악화되어 인지장애, 감정장애까지 불러올 수 있으며, 결국에는 증상이 발현된 후 약 10~15년 이내에 사망한다.

헌팅턴병은 4번 염색체에 있는 우성 유전자에 의한 유전병으로, 이 유전자가 변형된 비정상 단백질을 생성하고, 이 단백질이 세포자살 (apoptosis)을 유도해 신경세포를 죽게 한다.

헌팅턴병은 발병 시기가 주로 30~40대로 다른 퇴행성 뇌질환에 비해 이르며, 20대 초반에 나타나는 경우도 있다.

루게릭병으로 더 잘 알려진 근위축성 측삭경화증 (ALS; Amyotrophic Lateral Sclerosis)은 운동신경세포만 선택적으로 사멸하는 질환으로, 대뇌 피질의 상위운동신경세포 (upper motor neuron)와 뇌간 및 척수의 아래운동신경세포 (lower motor neuron) 모두가 점차적으로 파괴되는 특징으로 보인다.

임상 증상은 서서히 진행되는 사지의 쇠약 및 위축으로 시작하고, 병이 진행되면서 결국 호흡근 마비로 수년 내에 사망에 이르게 된다.

이 병의 발병 원인은 아직 밝혀져 있지 않지만, 지금까지 여러 가지 가설들이 제기되고 있다. 전체 근위축성 측삭경화증 환자의 약 5~10%는 가족력에 의한 것으로 알려져 있고, 이 중 약 20%의 가족에서 21번 염색체에서 원인 유전자의 돌연변이가 확인되고 있다.

그 외에 유전성이 아닌 원인으로는 흥분세포독성 (excitotoxicity)에 의한 세포자살 (apoptosis)이 중요하게 작용하는 것으로 생각되고 있다.

위에서 설명한 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측삭경화증은 모두 뇌신경세포의 손상이 원인이며, 이러한 뇌신경세포의 손상은 라디칼 형성을 수반하는 산화적 스트레스가 주요한 원인으로 알려져 있다.

산화적 스트레스란 세포나 조직이 독성 자유 라디칼 (toxic free radical)에 의해 손상되는 것을 의미하는 것으로, 특히 뇌신경세포는 산화적 스트레스에 민감한데 그 이유는 다음과 같다.

뇌가 당을 산화시켜 에너지를 얻는 과정은 높은 호기성 대사과정 (aerobic metabolism)으로 다량의 산소를 소비한다. 뇌는 체중의 약 2% 밖에 되지않지만 전체 산소 소비량의 20%를 사용할 만큼 많은 산소를 소비한다. 따라서 소비와 함께 발생 되는 많은 활성산소에 의해 뇌신경세포가 손상을 받게 된다.

또한 뇌신경세포는 산화되기 쉬운 다가불포화지방산이 고농도로 존재하고, 라디칼 형성시 촉매로 사용되는 금속이온 (Fe²⁺, Cu²⁺) 등이 풍부하며, 다른 조직에 비해 catalase와 같은 항산화 효소가 부족하여 산화적 스트레스에 대한 방어 기작이 충분하지 못하기 때문에 더욱 산화적 스트레스에 취약하다.

그리고 뇌신경세포 손상의 또 다른 원인으로 염증반응에 의한 손상이 있다. 염증반응은 알츠하이머병, 파킨슨병 등 퇴행성 뇌질환 대부분에서 나타나는 병리현상 중 하나로, 면역세포에서 염증반응으로 생산되는 사이토카인 (cytokine)이나 산화물질 등 염증매개물질 때문에 신경세포 사멸이 촉진된다고 추측되고 있다.

퇴행성 뇌질환의 경우 일반적인 감염성 질환과 달리 여러 요소가 조금씩 기여해 병이 발생하고 진행되는 것으로 알려져 있다.

한편, 모시풀 (Boehmeria nivea (L.) GAUDICH.)은 쐐기풀과에 속하는 다년생 초본식물로, 모시 또는 저마 등으로 불린다.

모시풀속에는 열대에 약 100종이 있으며 우리 나라에는 약 8종이 분포되어 있는데, 왕모시풀, 왜모시풀, 섬모시풀, 모시풀 (남모시풀), 개모시풀 (좀모시풀), 긴잎모시풀, 좀깨잎나무 (새끼거북꼬리), 거북꼬리, 풀거북꼬리가 자라고 있으며 바위모시속에 바위모시 (비양목)이 있다.

모시풀은 다년초로 키는 1~2미터까지 자라며 근경은 목질로 땅 속에서 옆으로 뻗고 줄기는 둥근 모양이다. 잔털이 퍼져 있으며 잎은 어긋난다. 잎자루는 길고 넓은 난형이며 길이 10~15 cm이고 끝이 약간 길게 뾰족하며, 규칙적인 톱니가 있고 표면은 짙은 녹색이며 뒷면은 솜털이 밀생하여 흰색이며 맥 위에 퍼진 털이 있다. 꽃은 암수 한그루에 원추화서이며 잎겨드랑이에 달리고 화서가 잎자루보다 짧다. 수꽃화서는 줄기 밑부분에 달리고 암꽃화서는 줄기 윗부분에 달린다. 수꽃은 황백색이며 화피는 4장에 수술 4개이며 암꽃은 연녹색에 통 모양의 화피에 싸이고 여러개의 꽃이 모여 둥글게 되며 암술 1개에 열매는 타원형의 수과에 여러 개가 붙어 있다. 꽃은 7~8월에 핀다. 모시풀속의 모든 식물은 껍질을 섬유용으로 활용할 수 있다.

모시잎은 떡, 부각, 장아찌, 효소 및 차 등에 활용하여 식용으로 사용되며, 칼슘, 칼륨, 철, 마그네슘 등 무기질을 풍부하게 함유하고 있어 골다공증과 관절염 및 청소년 성장에 좋다.

또한 모시는 카페인이 전혀 함유되어 있지 않기 때문에 장복하여도 카페인 과다로 인한 불면증, 위산과다, 신경과민, 메스꺼움 등과 같은 부작용이 없다.

모시잎은 예로부터 토사나 지혈, 신경통, 감기, 식욕부진, 간염과 습진 등에 효과가 있다고 기록되었으며, 최근에는 항암성분이 있다고 하여 그 효용이 입증되고 있다.

그리고 모시는 체기를 가라앉히고 속을 편안하게 하는 효과가 있는데, 이는 신경을 편안하게 하는 작용이 있어 복통을 완화하고 근육을 이완하여 뭉친 소화관의 운동을 촉진하기 때문이다. 또 식이섬유가 풍부하여 장의 연동운동을 촉진하고 정장작용을 돕는다.

또한, 모시에는 다량의 플라보노이드 (flavonoid)와 루틴 (lutin), 폴리페놀 (polyphenol) 및 비타민C가 함유되어 있어, 활성산소 제거와 항산화 작용이 뛰어나다.

한편, 모시를 이용한 종래 기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1052191호에 '모시풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병, 암 또는 신경퇴행성질환의 예방 및 치료용 약학 조성물'이 개시되어 있다.

위 선행 기술은 모시풀의 뿌리 추출물, 잎 추출물 및 줄기 추출물을 추출하여, 각각을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 신경퇴행성질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, β-갈락토시다아제, 아세틸콜린에스테라아제 (AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제 (BChE)를 저해하는 효과를 보유하고 있다.

위 선행기술은 특정 효소에 대한 저해 효능을 나타내는데, 글리코시다아제는 소화, 당단백질의 생합성 및 글루코콘쥬게이트의 리소솜 이화 작용에 관련된 효소며, 콜린에스테라아제는 뇌 내의 콜린 작용에, 아세틸콜린에스테라아제는 아세틸콜린 작용에 관여하는 효소이다.

따라서 이들 효소의 저해 작용을 통해, 상기 효소와 관련된 당뇨병, 암 또는 신경퇴행성질환의 증상 완화제나 치료제로 사용될 수 있음이 기재되어 있다.

또한 위 선행기술에서는 산화적 스트레스에 관련된 실험이 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 및 총 페놀 함량 측정으로 기재되어 있다.

그러나 이는 항산화 작용이 있는 것으로 공지된 페놀의 함량을 측정하고, DPPH 용액의 색 변화를 통해 항산화 정도를 특정한 것으로, 뇌신경세포에서의 작용은 알 수 없으며, 실제로 뇌신경세포에 보호 효과가 있는지 알 수 없다.

또한 산화적 스트레스나 기타 여러 원인으로 인한 염증반응을 억제하는 효과도 알 수 없다는 문제점이 있다.

따라서, 모시잎이 항산화 작용과 항염 작용을 통해 실제로 뇌신경세포에서도 보호 효과가 있는지에 관한 연구가 필요하다.

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 항산화 작용 및 항염 작용을 통해 뇌신경세포의 사멸를 막는 모시잎 발효물을 제공하는 데 있다.

또한 본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는, 항산화 작용 및 항염 작용을 통해 뇌신경세포의 사멸를 막는 모시잎 발효차를 제공하는 데 있다.

본 발명인 뇌신경세포 보호 기능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 발효차는 모시잎을 선옥균으로 발효하여 제조되는 것을 특징으로 하는 모시잎 발효물과 그를 이용한 발효차를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명의 모시잎 발효물은, 마우스 해마 세포인 HT22 세포주에서 글루타메이트 (glutamate)에 의해 유도된 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 활성을 통해, 산화적 스트레스로 인한 뇌신경세포의 손상을 막을 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.

또한 본 발명의 모시잎 발효물은, 마우스 미세아교세포인 BV2 세포주에서 LPS로 활성화되어 분비되는 염증매개물질을 억제하는 항염 활성을 통해, 뇌신경세포의 과도한 염증반응을 억제하는 현저한 효과를 보유하고 있다.

도 1은 마우스 HT22 세포주에서 본 발명에 따른 모시잎 발효물을 농도별로 처리했을 시, 세포 생존능을 측정한 그래프이다.
도 2는 마우스 BV2 세포주에서 본 발명에 따른 모시잎 발효물을 농도별로 처리했을 시, 나이트리트 (nitrite)의 생성량을 측정한 그래프이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 제조예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 모시잎 발효물의 제조

1) 모시잎 채취

모시잎은 한국 약용자원은행 (Korea Collection of Herbal Extracts)에서 입수하여 사용하였다.

모시잎은 어떠한 전처리도 가하지 않은 것을 사용할 수 있으며, 건조, 절단 또는 분쇄 등의 전처리를 가한 것을 사용할 수도 있다. 건조, 절단 또는 분쇄 등의 전처리 방법 또한 여러 가지 방법 중에서 선택될 수 있다.

바람직하게는 깨끗이 세척하여 이물질을 제거한 후 어떠한 전처리도 가하지 않은 모시잎을 사용할 수 있다.

2) 모시잎 건조

모시잎을 고열수증기방식으로 찐 후 건조한다. 조건에 따라 모시잎을 열수에 데친 후 건조해도 무방하다.

건조 방법에는 자연 건조, 열풍 건조, 저온 건조, 동결 건조, 원적외선 건조, 일광 건조, 진공 건조, 폴리에틸렌 하우스 (polyethylene (PE) house)건조 등이 있다. 바람직하게는 자연 건조 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니고, 모시잎의 수분이 제거될 정도면 충분하다.

이때, 건조된 모시잎은 분말기 (powder machine)를 이용하여 분말화된 후, 사용될 수도 있다.

3) 모시잎 발효

모시잎의 발효를 위해 선옥균을 첨가하고 발효한다. 선옥균에 의해 발효된 모시잎은 약용성분의 추출률이 증가하며, 체내에서 흡수도 용이해진다.

선옥균이란 인체에 이로운 유익균을 일컫는 것으로, 사람의 장내에는 이러한 선옥균을 비롯하여 유해균인 악옥균, 특별한 작용을 하지 않는 해바라기균이 균형을 이루어 존재하고 있다.

선옥균은 장을 건강하게 하여 소화흡수를 도와주고 항균작용을 해 면역력을 높여준다. 비피더스균, 유산균, 효모, 바실러스, 광합성균이 선옥균의 주력균주이다.

반대로 악옥균은 단백질을 분해할 때 여러 유해물질을 만들어 장 속에 염증을 일으키거나 발암물질을 배출한다. 대장균, 포도구균, 웰시균이 대표적인 악옥균이다.

건강한 사람의 경우 선옥균이 많고 악옥균이 적은 상태로 이 균형을 잘 유지하고 있으나 노화, 비만 등에 의해 균형이 깨지면 소화불량, 설사, 변비, 면역력 약화 등의 증상이 나타난다.

장내에 선옥균이 적으면, 섭취한 음식물이 체내에서 흡수되기 어렵다. 따라서 본 발명에서는 모시잎의 유효성분이 체내에서 쉽게 흡수되도록 모시잎을 선옥균으로 발효하여 사용하고자 한다.

설계 조건에 따라 모시잎과 발효를 위한 선옥균액의 중량비가 다르게 설정될 수 있으며, 모시잎의 건조 무게를 기준으로 50~70%의 물과 2~10%의 선옥균액을 첨가하여 발효시킬 수 있다.

바람직하게는 모시잎의 건조 무게를 기준으로 60%의 물과 4%의 선옥균액을 첨가하여 발효시킬 수 있다. 예를 들어, 건조된 모시잎의 중량이 25 kg일 때, 물 15 L와 선옥균액 1 L를 혼합하여 모시잎을 발효시킬 수 있다.

4) 모시잎 발효물 제조

모시잎 발효물을 농축 및 건조하여 모시잎 발효물로 만들 수 있다.

농축 방법에는 증발농축법, 냉동농축법, 막농축법, 건조농축법, 감압농축법 등이 있으며, 다양한 방법이 사용될 수 있다.

바람직하게는 감압농축법을 사용할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 농축 진행시의 시간 및 온도 역시 설계 조건에 따라 달라질 수 있다.

농축된 모시잎 발효물을 건조한다. 건조 방법에는 자연 건조, 열풍 건조, 저온 건조, 동결 건조, 원적외선 건조, 일광 건조, 진공 건조, 폴리에틸렌 하우스 (polyethylene (PE) house)건조 등이 있다.

바람직하게는 동결 건조 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 동결 건조하여 얻은 모시잎 발효물을 사용 때까지 -70℃에 보관하였다.

설계 조건에 따라 상기 기재된 공정 외에도 여과, 농축, 추출 등의 공정이 반복 실행될 수 있으며, 각 공정 전후에 발효, 냉동 등의 기타 공정이 추가로 실행될 수도 있다.

모시잎 발효물은 약학적 조성물 및 식품 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질환의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 첨가제가 추가될 수 있음은 물론이다.

식품 조성물로 이용하는 경우에는, 식품학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 건강기능식품으로 제조하여 제공한다.

건강기능식품의 경우, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 모시잎 발효물은 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율의 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리통 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 일긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 채소 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

실험예 1. 모시잎 발효물의 항산화 활성

1-1. 실험 준비

여기에서, 실험예 1을 비롯한 이하 모든 실험예는 아래의 실험 준비 과정과 동일하게 수행되었음을 밝혀둔다.

1) 모시잎 발효물

실시예 1에 따른 모시잎 발효물을 4℃의 온도를 유지하여 실험에 이용하였다.

2) 약물 준비

글루타메이트 (Glutamate), LPS, TNF-γ 및 코르디페틴 (cordycepin)을 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였으며, 트로록스 (Trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 Santa Cruz Biotech에서 구입하여 사용하였다. 기타 구입 가능한 시약 및 용매를 구입하여 사용하였다.

3) 세포 배양

HT22 세포는 10% FBS와 항생제가 첨가된 DMEM containing high glucose 배지에서 배양되었으며, 온도 27℃, 5% CO₂ 조건 하에 습식배양기 (humidified incubator)에서 일분자층으로 계대 배양하였다.

1-2. 실험 과정

본 발명에 따른 모시잎 발효물이 글루타메이트 (glutamate)로 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 활성, 즉 생존능 (cell viability)이 존재하는지 측정하기 위하여 MTT 분석법으로 이를 조사하였다.

양성대조군으로는 트로록스 (Trolox)를 사용하였다. 트로록스는 비타민E 유사체로, 항산화 활성을 측정할 때 기준으로 사용되는 화합물이다.

실험 방법은 다음과 같다.

1) HT22 세포를 96-well 배양 접시에 분주하여 12시간 안정화시켰다.

2) 모시잎 발효물을 5, 20, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 2시간 전처리하였다. 이 때 양성대조군으로 트로록스 (Trolox) 50 uM 사용하였다.

3) 글루타메이트를 HT22 세포주에 5 mM의 농도로 처리하여 12시간 동안 반응시켰다.

4) 글루타메이트 약물처리 후에는 배양액과 동일한 양의 MTT (dimethythiaxol diphenytetrazolium bromide) 용액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다.

5) 이 후 메틸설폭사이드 (dimethy sulfoxide)를 첨가하여 포마잔 프로덕트 (formazan product)를 완전히 용해시켜 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 특정하였다 (Model 550, Bio-Rad, USA).

1-3. 실험 결과

도 1은 본 발명에 따른 모시잎 발효물을 농도별로 HT22 세포에 처리하였을 때, 글루타메이트에 의한 산화적 스트레스가 세포의 생존능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

실험 결과, 모시잎 발효물은 농도의존적으로 산화적 스트레스로 인한 HT22 세포의 사멸을 막고, 보호하는 효과가 있으며, 특히 모시잎 발효물을 50 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖를 처리하였을 때 항산화 효과가 더욱 뛰어남을 알 수 있다.

실험에 2. 모시잎 발효물의 항염 활성

2-1. 실험 준비

세포 배양을 제외하고 1-1.의 실험 준비와 동일하게 수행되었다.

1) 세포 배양

마우스 BV2 세포주는 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 보강한 DMEM 배양 배지를 이용하여 습식배양기 (humidified incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에 보관 유지되었으며 트립신 처리 (trysinization)하여 계대 배양하였다.

실험에 사용된 세포는 LPS (0.5 ㎍/㎖)를 첨가하기 전에 정해진 시간에 코르디세핀 (cordycepin)을 처리하였다.

2-2. 실험 과정

실험에 사용한 마우스 BV2 세포주는 미세아교세포 (microglia)로, 뇌에 존재하는 염증 세포이다.

활성화된 미세아교세포는 염증매개물질을 분비하여 신경세포의 사멸을 유도하므로, 염증반응을 억제하는 것이 신경세포의 손상을 막고 나아가 퇴행성 뇌질환의 발병과 진행을 막는 것이라 하겠다.

본 실험예에서는 모시잎의 항염 활성을 측정하기 위해 나이트리트 (nitrite)의 생성량을 측정하였다.

나이트리트는 염증매개물질 중 하나인 일산화질소 (NO)의 주요한 안정한 생성물로, Griess 시약을 이용하여 측정되었다.

1) 세포를 24-웰 플레이트 (well plate)에 5×10⁵ 세포/㎖로 배양하였다.

2) 다양한 농도의 모시잎 발효물 (5, 20, 50, 100 ㎍/㎖)을 처리한 후, LPS (0.5 ㎍/㎖) 존재 또는 부존재 하에서 24시간 동안 반응시켰다.

3) 이후 각 배양 배지 100 ㎖를 동일 부피의 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-maphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄) 과 혼합하였다.

4) 나이트리트의 수준은 540 nm에서 ELISA plate reader (Dynatech MR-700; Dynateck Laboratories)를 이용하여 측정하였고, 나이트리트 농도는 기지 농도의 소듐 나이트리트 (sodium nitrite)를 이용하여 생성한 표준곡선을 참조하여 계산하였다.

2-3. 실험 결과

도 2는 BV2 세포에 본 발명에 따른 모시잎 발효물을 농도별로 처리하였을 때, LPS 첨가로 유도된 염증매개물질에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 모시잎 발효물은 농도의존적으로 BV2 세포에서 염증반응으로 분비되는 나이트리트의 농도를 감소시키고, 특히 모시잎 발효물을 50 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖를 처리하였을 때 항염 효과가 더욱 뛰어남을 알 수 있다.

제조예 1. 모시잎 발효차의 제조

실시예 1의 모시잎 발효물 제조 과정과 동일한 과정을 통해 모시잎 발효차를 제조할 수 있으며, 모시잎 발효차는 분말, 환, 티백 등 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 모시잎 발효차는 증기 또는 열수에 데치고 선옥균에 의해 발효되는 과정을 통해, 모시잎 고유의 풋내가 나지 않으며, 미감이 향상되고, 유효성분의 추출률이 증대되며, 체내에서 흡수가 용이한 모시잎 발효차를 제공할 수 있다.

Claims (6)

1. 모시잎의 건조 무게를 기준으로 50~70 중량%의 물과 2~10 중량%의 선옥균액을 첨가하여 발효한 모시잎 발효물이되,
   상기 모시잎 발효물은 마우스 HT22 세포(hippocampal neuronal cell) 또는 마우스 BV2 세포(microglial cell) 기준 50~100 ㎍/㎖의 농도로 처리되며,
   마우스 해마 세포인 HT22 세포주에서 글루타메이트(glutamate)에 의해 유도된 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 효능 및 마우스 미세아교세포인 BV2 세포주에서 LPS(lipopolysaccharide)로 활성화되어 분비되는 염증매개물질을 억제하는 항염증 효능을 보유하여 뇌신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 모시잎 발효물.
   
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5. 청구항 1에 기재된 모시잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경세포 보호용 건강기능식품.
   
6. 청구항 1에 기재된 모시잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경세포 보호용 차(茶).
   

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