KR20200011238A - 블루베리로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하는 방법 - Google Patents

블루베리로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종래 스틸벤계 기능성 물질인 비니페린 및 테로스틸벤을 쉽고 간단한 공정을 통해 대량으로 확보할 수 있는, 대량생성공정에 관한 것으로, 종래 스틸벤계 기능성물질을 생산하는 공정에서의 문제점을 해결하고, 원료 자원의 한계를 극복함으로써, 비니페린과 테로스틸벤을 약 18, 89 배 이상 생산할 수 있는 블루베리 유래 캘러스를 유도하고 증식시킬 수 있다. 또한, 원료 자원 내에서 비니페린과 테로스틸벤의 생성량을 증가시켜, 동량의 원료로부터 고함량의 비니페린과 테로스틸벤을 확보할 수 있으므로, 관련 산업에 매우 중요하게 활용될 수 있다.

Description

블루베리로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하는 방법{method of producing viniferin and pterostilbene from blueberry}
본 발명은 종래 스틸벤계 기능성 물질인 비니페린 및 테로스틸벤을 쉽고 간단한 공정을 통해 대량으로 확보할 수 있는, 대량생성공정에 관한 것이다.
최근 생활 습관병인 당뇨병, 고지혈증, 심혈관계 질환, 비만 등 대사증후군의 증가로 식이에 의한 1차 예방의 중요성이 점점 높아지면서 단순한 영양 섭취의 단계를 넘어 특정기능을 활성화시키기 위한 기능성 식품 및 관련 소재 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히 식문화의 흐름이 신선한 로컬 푸드에 초점이 맞춰지면서 건강기능식품 산업에서도 식물 자원에 다량 함유되어 있는 파이토케미컬(phytochemical)에 관한 연구가 주축을 이루고 있다.
스틸벤(stillbenes)은 주로 포도와 와인에서 발견되는 파이토케미컬의 일종으로, 자연발생적 페놀화합물이며, 단량체부터 고분자까지 다양한 형태로 존재한다. 이 중에서도 레스베라트롤(resveratrol)이 가장 널리 연구되어 왔다. 레스베라트롤은 강한 항산화성으로 심혈관 질환 및 대사증후군 등의 예방에 효과가 있고, 인지기능 장애, 암세포 성장 억제 및 암 예방 효능 등 인간의 건강 증진을 위한 다양한 약리 효과가 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 상에서 확인된 바 있다(Steiner, 2016). 또한 레스베라트롤은 곰팡이, 박테리아, UV 조사 등 외부 환경에 대한 물리학적, 화학적, 생물학적 스트레스로부터 자신을 보호하기 위해 생성되는 파이토알렉신(phytoalexin)에 해당하기 때문에 식물자원 자체에 UV 등의 외부 자극을 처리함으로써 향균성을 향상시키고 레스베라트롤의 함량을 증진시키는 연구들이 다양하게 시도되어 왔다.
그러나 레스베라트롤 이외의 스틸벤계 물질의 경우 주로 원료에 대한 고려없이 순수 불질로서의 생물활성효과를 탐색하거나, 단순히 추출물을 제조한 후 그 추출물의 생물활성 효과를 검토한 연구들이 전부이다.
일예로, 레스베라트롤의 모노머인 피세틴타놀(piceatannol), 테로스틸벤(pterostilbene) 또는 아스트리진(astringin), 피세이드(piceid)와 같은 글리코시드 이성질체(isoform)가 있으며, 2 내지 8 개의 레스베라트롤 서브유닛으로 구성된 레스베라트롤 올리고머들이 있다.
이중에서 테로스틸벤(pterostilbene)은 레스베라트롤과 유사한 효능을 나타내면서도 비교적 안정적인 분자구조로 생체이용성이 훨씬 크다는 연구가 진행된바 있으나, 이러한 효과에도 불구하고 생물산업적 소재로 활용되기 위한 생산공정의 산업화 연구는 미진한 실정이다. 나아가 천연 자원 내 함량 성분에 대한 기초 자료도 찾아보기 어렵다.
상기 레스베라트롤 올리고머 중에서 포도에 주로 존재한다고 알려져 있는 비니페린(viniferin)은 레스베라트롤 이량체(dimer)로, 포도주 내에서도 그 농도가 0.1 내지 4.3 ㎎/L로, 매우 소량 발견된다. 비니페린은 항산화제, 항염증제, 항암 효과 및 심장 보호 효과 등의 우수한 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.
허나 비니페린은 레스베라트롤 올리고머 중에서도 생체 이용률이 매우 낮을 뿐만 아니라, 원재료에서 그 농도가 매우 희소하고, 가공하거나 추출하더라도 이의 약리학적 특성을 위해 충분한 농도로 비니페린을 생성하기 어렵다는 문제가 있다.
게다가 종래기술은 스틸벤계 기능성 물질을 생산하는 포도 등 재배지에서 수집된 원료를 건조 및 분쇄한 후 유기용매를 사용하거나 초음파 추출법을 통해, 다량의 추출물을 생산한 예가 있으나, 이는 여전히 추출 효율(efficiency)와 생산성(yield)이 현저히 낮다. 게다가 대량의 추출물은 다량의 불순물을 포함하고 있어 후속 공정인 분리와 정제 공정에 과도한 부담이 걸리기 때문에, 스틸벤계 기능성 물질의 함량 및 품질에 있어서 저품질에 머물고 있다는 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하고자 상기 추출물의 순도와 균일성을 고려하여 고급의 분리 및 정제기술을 도입한 예가 있으나, 생산비용이 과도하게 증가하여 생산비 측면에서 경쟁력을 확보하기 어려울 뿐 아니라, 스틸벤계 기능성 물질의 함량이 증가한다 하더라도 비니페린은 여전히 그 농도가 매우 희소하다는 문제점이 있다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0130006호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 비니페린(viniferin) 및 테로스틸벤(pterostilbene)을 블루베리로부터 대량생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 블루베리 유래 캘러스로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하기 위한 배양 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여,
ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계로부터 회수된 블루베리 캘러스를 3~6주 간격으로 3~4회 계대배양하여 캘러스를 얻는 단계;
ⅲ) 상기 캘러스를 증식배지에서 현탁배양하는 단계; 및
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계의 캘러스 배양물을 추출하는 단계; 블루베리 유래 비니페린(viniferin) 및 테로스틸벤(pterostilbene)을 대량생산하는 방법을 제공한다.
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 블루베리 과피 또는 잎일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 분리한 것일 수 있다.
상기 캘러스는 상기 ⅱ) 단계의 계대배양 과정동안, 상기 ⅰ) 단계의 블루베리 캘러스로부터 변형된 것으로, 육안으로 확인하였을 때 적색을 띄는 적색 캘러스인 것일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도 배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신, 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌을 포함하는 고체배지일 수 있다.
상기 ⅲ) 단계의 증식배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신을 포함하는 액체배지일 수 있다.
상기 ⅰ), ⅱ) 및 ⅲ) 단계는 암배양일 수 있다.
상기 ⅳ) 단계는 초음파 추출, 용매 추출 및 분배추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 추출법으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 ⅳ) 단계를 통해 얻은 블루베리 유래 캘러스 추출물을 동결·건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 비니페린은 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린인 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 옥신, 사이토키닌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생장조절제를 유효성분으로 함유하는, 블루베리 유래 캘러스로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하는 캘러스의 변형을 유도하는 캘러스 유도 및 계대배양용 배지조성물을 제공한다.
상기 옥신은 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도로, 상기 사이토키닌은 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것일 수 있다.
본 발명은 종래 스틸벤계 기능성물질을 생산하는 공정에서의 문제점을 해결하고, 원료 자원의 한계를 극복함으로써, 비니페린과 테로스틸벤을 약 18, 89 배 이상 생산할 수 있는 블루베리 유래 캘러스를 유도하고 증식시킬 수 있다. 또한, 원료 자원 내에서 비니페린과 테로스틸벤의 생성량을 증가시켜, 동량의 원료로부터 고순도의 비니페린과 테로스틸벤을 확보할 수 있으므로, 관련 산업에 매우 중요하게 활용될 수 있다.
도 1은 고형분 중량 기준으로 블루베리 부위별 스틸벤 함량을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 무균상태에서 자란 블루베리 조직배양묘의 잎, 줄기 및 과피 조직을 일정 크기로 잘라, 조직체(절편)을 제조한 후, 캘러스 유도 배지에서 치상하여 유도된 캘러스를 촬영한 사진이다.
도 3은 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 잎 유래 조직체의 세포배양 결과이다.
도 4는 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 과피 유래 조직체의 세포배양 결과이다.
도 5는 1% sodium hypochlorite를 10분 이상 처리한 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 과피 유래 조직체의 세포배양 결과이다.
도 6은 제19군, 제20군 및 제21군으로부터 제조된 캘러스 배양물을 촬영한 사진이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 하기 단계를 포함하는 블루베리 유래의 비니페린(viniferin) 및 테로스틸벤(pterostilbene)을 대량생산하는 방법을 제공한다.
ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계로부터 회수된 블루베리 캘러스를 3~6주 간격으로 3~4회 계대배양하여 캘러스를 얻는 단계;
ⅲ) 상기 캘러스를 증식배지에서 현탁배양하는 단계; 및
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계의 캘러스 배양물에서 세포를 분리하고, 용매로 추출하는 단계.
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 블루베리 줄기, 잎 및 과피일 수 있고, 바람직하게는 블루베리 과피 또는 잎일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 블루베리 잎일 수 있다. 상기 잎은 블루베리의 조직배양묘로부터 얻은 잎일 수 있다. 후술하는 실험예에서 확인된 바와 같이 다양한 스틸벤이 존재하는 것은 블루베리 과피, 잎인 것을 알 수 있다(도 1 및 표 2). 나아가 표면처리한 후 손상 및 오염되지 않고 100%에 가까운 높은 생존률을 가지면서, 캘러스 유도에 필요한 배양시간이 가장 짧은 잎을 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
먼저, ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부일 수 있다. 그러나, 0.2-2% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 1-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-30 초 동안 처리하고, 0.5-1% NaOCl 0.5-5 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 사용하는 것이 생존률이 80~100% 이상으로 달성할 수 있어 바람직하다.
만약 상기 블루베리 조직체가 상기와 같은 표면살균과정을 거치지 않거나, 일부라도 상이한 조건으로 표면살균과정이 수행된 식물체를 이용하여 제조될 경우, 후술하는 실험예에서와 같이, 조직체가 손상되거나 오염되어 캘러스가 제대로 형성되지 않는 문제가 있다.
상술한 과정의 표면살균과정을 거쳐 제조된 블루베리 조직체는 생존율이 50% 이상에 달할 수 있고, 상기 바람직한 조건으로 수행하는 경우 80~100%에 달하는 것으로 확인되었다.
상기 ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도한다. 이때, 상기 ⅰ) 단계는 암배양인 것이 바람직하다.
이후, ⅱ) 상기 ⅰ) 단계로부터 회수된 블루베리 캘러스를 3~6주 간격으로 3~4회 계대배양하여 적색 캘러스를 얻을 수 있다. 구체적으로 상기 ⅱ) 단계는 상기 조직의 세포가 세포 분열을 하여 세포의 덩어리인 캘러스(callus)가 생기면 캘러스 유도 배지로부터 캘러스를 분리하여 동일조건의 배지에서 계대배양하여 증식시키는 단계로, 이때, 계대배양은 3~6주 간격으로 하되, 3회 이상 계대배양한 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 3~4회 계대배양하는 것일 수 있다.
상기 ⅱ) 단계에서 사용되는 배지는 상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도배지와 동일한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 상기 ⅱ) 단계에서 사용되는 배지와 ⅰ) 단계에서 사용되는 캘러스 유도 배지는 별도의 구별이 요구되거나, 별도의 언급이 없는 한, '캘러스 유도 배지'로 칭한다.
상기 캘러스는 상기 ⅱ) 단계의 계대배양 과정동안, 상기 ⅰ) 단계의 블루베리 캘러스로부터 변형된 것으로, 육안으로 확인하였을 때 적색을 띄는 것을 특징으로 한다.
적색 캘러스를 얻기 위해서, 캘러스 유도 배지 및 계대배양 조건이 모두 만족하여야 하며, 일 예로 상기 ⅰ, ⅱ 단계 모두 암배양인 것이 바람직하다. 상기 ⅰ, ⅱ 단계가 모두 암배양을 만족하는 경우 4 내지 6주 간격으로 배양하되 3~4회 계대배양하는 것이 바람직한데, 3회 미만, 4회를 초과하여 계대배양할 경우 적색의 캘러스로 변형이 일어나지 않고, 황색의 캘러스로 유지되기 때문에 적색 캘러스를 얻을 수 없다는 문제가 있다. 따라서 가장 바람직하게는 블루베리 캘러스는 암배양 조건으로 캘러스 유도 배양 및 계대배양이 이루어지되, 3~4회 계대배양을 수행한 것일 수 있다.
상기 계대배양 단계를 생략할 경우, 적색 캘러스를 얻을 수 없는 문제가 발생할 수 있다. 본 발명은 적색 캘러스를 현탁배양하고, 배양된 세포로부터 추출물을 얻음으로써, 비니페린과 테로스틸벤의 함량이 최대 89배까지 대량생산할 수 있다. 즉 ⅰ, ⅱ 단계중 어느 하나라도 생략하거나(특히, ⅱ 단계), 배양 조건을 달리할 경우 상술한 본 발명의 목적을 달성할 수 없게 되는 문제가 있다.
다음으로, ⅲ) 상기 캘러스를 증식배지에서 현탁배양한다.
상기 ⅲ) 단계는 앞서 ⅱ) 단계를 통해 얻은 캘러스 특히 적색 캘러스가 충분하게 성장 및 증식하도록 하는 현탁배양하는 단계일 수 있다. 예를 들어 상기 ⅱ) 단계로부터 얻은 캘러스를 액체배지로 옮겨 액체 현탁배양을 실시하며, 상기 액체배지에서 2 내지 15주, 바람직하게는 4 내지 8주간 배양하여 적색 캘러스로부터 증식된 적색 캘러스 배양물을 얻을 수 있다.
1차 현탁배양이 완료된 후, 필요에 따라 동일조건, 동일배지에 상기 캘러스 배양물을 다시 접종하여 계속적으로 배양하는 반복적인 계대배양을 수행할 수 있으며, 이는 특별히 제한되지 않는다. 다만, 배양기간에 따른 예상치 못한 부산물의 생성과 적색 캘러스의 유지기간 정도를 고려하였을 때, 비용과 효과적인 측면에서 1차 현탁배양만을 수행하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이 블루베리 조직체로부터 캘러스를 유도하고, 계대배양하며, 이로부터 현탁배양하여 세포를 제조하는 방법은, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 알려진 적절한 캘러스 유래 세포(특히 식물세포) 제조방법 모두 사용될 수 있으며 특별히 한정하지 않는다.
상기 ⅲ) 단계 역시 암배양인 것이 바람직한데, 만약 상기 과정 중에서 어느 하나라도 광배양으로 수행될 경우, 적색 캘러스가 형성되지 않거나, 원래 상태였던 황색 캘러스로 다시 변형될 수 있기 때문에, ⅲ) 단계뿐만 아니라, ⅰ, ⅱ 단계 모두 암배양으로 수행하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 상기 ⅲ) 단계는 현탁배양으로, 상기 현탁배양은 블루베리로부터 유래된 적색 캘러스가 액체 영양 배지인 증식배지 내에 분산되어 배양되는 것으로써, 충분하게 성장한 캘러스 배양으로부터 유도될 수 있다. 상기 ⅲ) 단계는 2 내지 15 주, 바람직하게는 4 내지 8 주간 배양되며, 상기 배양기간이 지난 후, 배양이 완료된 적색 캘러스 배양물을 회수할 수 있다. 필요에 따라 상기 배양이 완료된 적색 캘러스 배양물을 동일조건, 동일배지에 접종하여 반복적으로 계대배양을 추가 수행할 수 있다.
상기 현탁배양에서 사용되는 배지는 기본적인 필수구성성분은 캘러스 유도에 사용된 배지와 유사하나, 함유되는 생장조절제의 혼합량이 상이하며, 캘러스 유도배지와 달리 액체배지이므로, 고형화제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 캘러스 유도 배지와 증식배지는 캘러스 배양과 증식을 유도하는 생장조절제가 첨가되어 있는 배지로, 특별히 이에 제한되지 않으나, 통상의 고체배지 또는 액체배지를 포함할 수 있다. 예를 들면 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지와 B5(Gamborg et al., 1968) 배지, SH(Schenk and Hildebrandt, 1972) 배지, LS(Linsmaier and Skoog, 1965) 배지 및 WPM(Lloyd and McCown, 1980) 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
가장 널리 사용되는 배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지이며 담배의 조직배양을 위해 고안된 배지이다. MS 배지의 특징은 높은 농도의 ammonium, nitrate, potassium이다. LS(Linsmaier and Skoog, 1965) 배지의 경우는 MS 배지와 비슷하지만 일부 유기물의 조성에 차이가 난다. White 배지(White, 1963)는 낮은 농도의 염이 특징이고 토마토 뿌리를 배양하기 위해 고안되었다. B5 배지는(Gamborg et al., 1968) 대부분의 callus를 배양하기 위해 고안되었고, ammonium ion보다 nitrate ion의 함량 비율이 높은 것이 특징이다. SH 배지(Schenk and Hildebrandt, 1972) 쌍자엽과 단자엽 식물의 callus를 배양하기 위해 개발되었다. NN(Nitsch and Nitsch, 1969) 배지는 약배양을 위해 개발되었고, MS 배지보다 낮은 염농도를 지녔지만 White 배지보다는 높다.
새로운 종을 배양할 경우에는 이미 보고된 유연관계가 높은 식물종의 배양결과를 참고로 하여 배지를 선택하는 것이 유리하다. 식물조직으로부터 캘러스만을 유도하는 경우에는 특별한 배지 설정을 위해 각종의 배지를 테스트할 필요가 없다. 오히려 배지에 농도 및 조합을 달리한 생장조절제의 선택이 훨씬 효과적인 경우가 많다.
생장조절제는 줄기와 뿌리의 분화 및 세포의 생장에 관여하는 필수적인 요소이나, 식물 조직배양에 있어서 생장조절제의 종류, 농도 및 조합처리는 성공적인 배양을 위해서 가장 중요한 요건에 해당하므로, 이들의 종류나 농도 혹은 조합에 따라 전혀 다른 성질의 캘러스가 유도될 수 있다. 따라서 본원발명과 같이 비피페린 및 테로스틸벤을 동시에 대량생산하는 블루베리 유래 캘러스 또는 캘러스 추출물을 얻기 위해서는 후술하는 실험예를 통한 생장조절제의 최적화 조건으로 한정된 '캘러스 유도배지'와 '증식배지'가 사용되는 것이 가장 바람직하다.
특히, 본 발명에서는 블루베리 조직체로부터 일반적으로 얻을 수 있는 황색 캘러스가 아닌, 황색 캘러스로부터 변형된 적색의 캘러스를 유도해야하고, 또한, 앞선 단계를 통해 회수된 적색의 캘러스의 성질의 변화없이 우수한 효능을 그대로 유지하면서 증식과 성장을 촉진할 수 있어야 하는 것으로써, 이는 본 발명에서 제안하는 배양단계와 배양조건을 통해 달성할 수 있음을 후술하는 실험예를 통해 확인할 수 있다.
즉, 상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도 배지와 ⅲ) 단계의 증식배지에 포함되는 생장조절제의 함량이 서로 동일하거나, 서로 다를 수 있다. 구체적으로 상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도 배지에는 옥신(auxin)과 사이토키닌(cytokinin)이 모두 첨가된 것으로, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신, 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌을 포함하는 고체배지일 수 있다.
상기 ⅲ) 단계의 증식배지는 옥신(auxin) 또는 사이토키닌(cytokinin) 또는 이들 모두가 첨가된 것일 수 있고, 바람직하게는 생장조절제로 옥신만 첨가된 액체배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신만을 생장조절제로 하는 액체배지일 수 있다.
상기 옥신으로서는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA(naphthalatene acetic acid), IBA (indolebutric acid) 및 IAA(indole-acetic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 2,4-D일 수 있다. 상기 사이토키닌으로는 kinetin(6-furfuryl-amino purin), BA(banzyladenine), zeatin {6-(4-hydroxy-3-methyltrans-2-butenylamino) purine}으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 BA일 수 있다.
구체적으로 상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D 및 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 BA가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있고, 0.5 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D 및 0.2 ㎎/㎖ 농도의 BA가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지가 가장 바람직하다.
상기 ⅲ) 단계의 증식배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.2 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있다.
구체적으로 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 생육온도는 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 20 내지 30℃일 수 있으며, 바람직하게는 22 내지 27℃일 수 있다. 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 pH 범위는 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 바람직한 pH는 5 내지 7 일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 5 내지 pH 6 일 수 있다. 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 배양시간은 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 2 내지 15주, 바람직하게는 4 내지 8주일 수 있다. 상기 캘러스를 유도하기 위해서는 인공적인 광원을 통해 시간과 빛의 세기를 조절하는 명조건과 빛을 제공하지 않는 암조건에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 암조건에서 배양할 수 있다.
상기 방법으로 유도 및 증식된 블루베리 유래 적색 캘러스 배양물에는, 0.01 내지 15 건조중량%의 블루베리 유래 적색 캘러스를 포함하는 것으로 확인되었다.
최종적으로 ⅳ) 상기 ⅲ) 단계의 적색 캘러스 배양물을 추출하여, 캘러스 추출물을 제조한다.
상술한 과정을 모두 거치고 나면, 블루베리 조직체로부터 유래한 적색 캘러스가 생성되며, 이를 현탁배양하여 배양물을 회수하며, 추출공정을 통해 비니페린과 테로스틸벤의 생산성이 블루베리 잎 추출물에 비해 모두 현저히(각각 18배, 89배 이상) 우수한 캘러스 추출물을 제조 및 얻을 수 있다.
상기 적색 캘러스 배양물은 증식배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 분리한, 블루베리 유래 적색 캘러스로부터 증식 및 성장된 현탁배양세포(식물세포)(원심분리한 상등액을 제외한 펠렛)등을 포함한다.
상기 현탁배양세포를 분리하기 위하여, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 적절한 방법이라면 특별히 제한없이 사용할 수 있고, 예를 들어 원심분리를 통해 고형물을 분리하거나, 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 과정에 의해 분말화한 것일 수 있다.
상기 ⅳ) 단계는 상기 ⅲ) 단계로부터 회수된 적색 캘러스 배양물은 다양한 방법을 통해 추출될 수 있는데, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 적절한 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 초음파 추출, 용매 추출 및 분배추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 추출법을 사용할 수 있다.
구체적으로 초음파 추출은 상기 적색 캘러스 배양물을 추출용매 또는 산이 첨가된 추출용매에 침지하고 초음파로 처리하여 수득하는 것이고, 용매 추출은 상기 적색 캘러스 배양물을 추출용매에 침지하여 추출하는 것이며, 분배 추출은 상기 적색 캘러스 배양물에 물과 동량의 유기용매를 첨가한 후, 분배(partition) 시킨 다음 두개의 상으로 분리된 각 층을 분리하여 추출하는 것이다. 분배 추출은 상기 과정을 통해 얻은 분리된 층 중 어느 하나에 다시 물과 동량의 유기용매를 가하여 분배시키고 두 개의 상으로 분리시키는 일련의 과정을 필요에 따라 반복수행할 수 있다.
상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 유기용매는 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
구체적으로 상기 추출과정은 다음과 같다. 상기 ⅲ) 단계로부터 회수한 적색 캘러스 배양물에 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 추출용매를 첨가한 후 특정 조건 하에서 초음파를 처리함에 따라 상기 캘러스 내에 포함되어 있는 유효성분을 효과적으로 추출한 초음파 추출물일 수 있다. 이때, 상기 초음파 추출에 사용되는 추출용매는 산 용액을 더 포함하는 것일 수 있다.
또는, 상기 회수한 적색 캘러스 배양물에 추출용매를 첨가하여 얻은 용매추출물이거나, 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유기용매를 이용한 분배추출법으로 추출한 분배추출물일 수 있다.
가장 바람직하게는 상기 ⅳ) 추출단계는 ⅲ) 단계로부터 회수된 적색 캘러스 배양물에 추출용매와 산이 혼합된 용매를 첨가한 후 특정 조건 하에서 초음파를 처리함에 따라 적색 캘러스 내에 포함되어 있는 유효성분을 효과적으로 추출한 초음파 추출물일 수 있으며, 이러한 추출공정을 통해 추출된 초음파 추출물을 다시 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유기용매를 이용해 분배추출한 것 일 수 있다.
따라서 본 발명의 상기 방법을 통해 제조된 추출물의 경우 다양한 기능성을 가진 소재로서 의약품, 식품, 화장품 등 다양한 산업분야에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 블루베리는 천연 약용식물로서 식용이 가능하므로 이로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.
상술한 내용을 종합하면 본 발명의 블루베리 유래 비니페린(viniferin) 및 테로스틸벤(pterostilbene)을 대량생산하는 방법의 최종 형태는 아래와 같은 단계 및 조건들을 포함한 것일 수 있다.
우선 ⅰ) 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 분리하여 블루베리 조직체를 제조하고, 상기 제조된 블루베리 조직체를 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 옥신 및 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌이 첨가된 MS 배지(캘러스 유도 배지)에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도한다.
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계로부터 회수된 블루베리 캘러스를 상기 ⅰ) 단계와 동일한 배지에 3~6주 간격으로 3~4회 계대배양하여 적색 캘러스를 얻는다.
ⅲ) 상기 적색 캘러스를 증식배지에서 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 옥신이 첨가된 MS 배지(증식배지)에서 암배양조건으로, 2 내지 15주 바람직하게는 4 내지 8주 동안 현탁배양한다.
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계의 적색 캘러스 배양물에서 세포를 분리하고, 용매로 추출하여, 캘러스 추출물을 제조한다.
상술한 일련의 과정을 통해 얻어진 블루베리 유래 캘러스 추출물은 비니페린과 테로스틸벤 함량이, 자연산 블루베리 잎 추출물 대비 각각 18, 89 배 증가되어 함유되어 있으며, 제조공정이 단순 배양을 통해 적색 캘러스를 회수하고, 간편한 추출공정을 통해 충분히 회수할 수 있으므로, 우수한 기능을 나타내는 블루베리 유래 캘러스 추출물을 대량으로 얻을 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 대부분의 공정이 최소한의 용매를 사용하므로, 매우 환경친화적이므로, 본 발명에 따라 제조된 블루베리 유래 적색 캘러스와 이의 추출물은 간 독성 치료, 간 기능 보호 및 개선 효과를 가지는 치료제 또는 기능성 식품 소재로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 고농도의 산물을 회수하고자, 상기 추출물을 감압농축 등의 방법으로 농축하거나, 추가 정제방법을 사용하여 고순도로 정제할 수 있으나, 최소한의 추출공정만으로 블루베리 잎 추출물에 비해 18 배 이상의 비니페린과 89 배 이상의 테로스틸벤을 포함하는 블루베리 유래 캘러스 추출물을 생성할 수 있으므로, 종래 비니페린 혹은 테로스틸벤을 제조하는 공정에 비해 매우 비용효율적이라 할 수 있다.
또한 상기 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 옥신, 사이토키닌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생장조절제를 유효성분으로 함유하는, 블루베리 유래 캘러스로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하는 적색 캘러스의 변형을 유도하는 캘러스 유도 및 계대배양용 배지조성물에 관한 것이다. 상기 캘러스 유도 및 계대배양을 위한 배지조성물은 옥신(auxin)과 사이토키닌(cytokinin)이 모두 첨가된 것으로, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신, 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌을 포함하는 고체배지일 수 있다.
상기 옥신으로서는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA(naphthalatene acetic acid), IBA (indolebutric acid) 및 IAA(indole-acetic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 2,4-D일 수 있다. 상기 사이토키닌으로는 kinetin(6-furfuryl-amino purin), BA(banzyladenine), zeatin {6-(4-hydroxy-3-methyltrans-2-butenylamino) purine}으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 BA일 수 있다.
구체적으로 상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D 및 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 BA가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있고, 0.5 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D 및 0.2 ㎎/㎖ 농도의 BA가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지가 가장 바람직하다.
상술한 캘러스 유도 및 계대배양용 배지조성물을 통해, 블루베리로부터 분리된 조직체를 치상하고, 계대배양할 경우, 육안으로 확인하였을 때 적색을 띄는 적색 캘러스가 형성됨을 확인하였고, 상기 적색 캘러스는 비니페린과 테로스틸벤의 생산성이 매우 현저함을 후술하는 실험을 통해 확인하였다. 특히 상기 적색 캘러스를 현탁배양하고 추출하여 얻은 추출물의 경우, 블루베리 잎 추출물에 비해 모두 현저히(각각 18배, 89배 이상) 우수한 캘러스 추출물을 제조 및 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면 계대배양은 3~6주 간격으로 하되, 3회 이상 계대배양한 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 3~4회 계대배양하는 것일 수 있다.
상기 캘러스 추출물은 앞서 설명한 바와 같이, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 캘러스 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부외용 연고, 로션, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 캘러스 추출물을 0.00001 내지 50% 중량%, 바람직하게는, 0.0001 내지 20% 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10% 중량%으로 포함한다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
한편, 상기 '식품 조성물'에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미의 건강기능식품 또는 건강보조식품을 모두 포함한다.
본 발명 식품 조성물에서 상기 캘러스 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에서 캘러스 추출물의 첨가량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 상기 캘러스 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
음료를 제조하는 경우 상기 캘러스 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 약 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 12 중량%이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실험예 1. 블루베리 부위별 스틸렌 함량 분석
1) 실험재료 및 시약
국내에서 생산되고 있는 블루베리 중 2016년 6월 성남 지역에서 수확한 조생종인 오닐(O'Neal) 품종을 수집하였다. 수집한 블루베리를 과피, 잎, 줄기로 구분하였고, 부위별로 스틸벤 함량을 분석하기 위해 각각 동결건조하였다.
실험에 사용한 모든 시약은 HPLC grade를 사용하였고, JT Baker(Phillipsburg, NJ, USA)와 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 표준물질로 사용한 레스베라트롤(t-resveratrol, R5010), 테로스틸벤(t-pterostilbene, P1499), 피노실빈(pinosylvin, 56297)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), 비니페린(ε-viniferin, FV30429)은 Carbosynth (Berkshire, UK)에서 구입한 것을 사용하였다.
블루베리의 조직 부위별 스틸벤 함량을 분석하여, 조직배양에 사용할 조직체를 선발하고자 하였다.
2) 블루베리 부위별 스틸벤 함량 분석
상기 1) 단계에서 준비된 블루베리의 각 부위(과피, 잎, 줄기)에서 스틸벤 함량을 분석하기 위해 아래 방법으로 스틸벤을 추출한 후, HPLC법으로 스틸벤 함량을 분석하였다.
우선 상기 1) 단계에서 준비된 동결건조된 각 부위(과피, 잎, 줄기)를 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. 이때, 동결건조된 블루베리의 줄기는 분쇄기(Cyclotec 1093, Foss, Hoganas, Sweden)로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 3 g에 0.1% HCl이 혼합된 메탄올 용액 25 ㎖를 가하고, 현탁시킨 후, 27 ℃에서 30분동안 초음파로 처리하여 추출액을 제조하였다. 상기 추출액을 원심분리 장치(Centrikon T-324, Kontron, Milano, Italy)를 사용하여 10분간 12,000×g로 원심분리한 후 whatman filter paper No. 4로 여과하고, 잔여물을 수거하였다. 상기 잔여물을 상술한 추출과정으로 재추출하고, 여과하였다. 재추출액을 여과액과 혼합하고, 40 ℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELAN-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하여 용매를 제거한 후, 20 ㎖ 증류수와 동량의 에틸 아세테이트(ethylacetate)를 차례대로 첨가하여 4 ℃에서 10분간 방치하였다. 에틸아세테이트 분획물을 새로운 튜브로 옮기고, 잔여 증류수 층을 분리하였다. 상기 분리된 잔여 증류수 층을 대상으로 에틸아세테이트를 이용해 2차례 더 분획물을 분리하였다. 모든 에틸아세테이트 분획물을 혼합한 다음 40 ℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)을 통해 농축물을 제조하였다. 상기 농축물을 1 ml의 메탄올에 녹여 0.22 μm syringe filter로 여과 후 HPLC에 주입하여, 스틸벤 함량을 분석하였다.
3) HPLC 분석
블루베리의 스틸벤 함량 분석은 종래 HPLC 분석법(Lyons et al. 2003)을 일부 수정하여 사용하였다. 구체적으로 HPLC 시스템(Agilent 1100 series)은 펌프, 인젝트, UV/VIS 검출기, 적분기(Chemstation software), 컬럼(Agilent eclipse XDB-C18: 4.6 mm x 250 mm, 5 μm, ZORBAX) 등으로 구성되었으며, 분석 조건은 하기 표 1에 나타내었다 0.1% formic acid가 첨가된 water(A)와 0.1% formic acid가 첨가된 acetonitrile(B)를 용매로 하여 구배(gradient) 조건 하에서 1.0 ml/min의 유동속도로 45분간 작동시켰다. 이때 시료 주입량은 20 μl이었고, 용매의 구배(gradient) 조건은 초기 90:10의 A/B 비율로 시작하여 30분까지 20:80 비율로 유지한 후 35분까지 90:10으로 조정되었으며, 마지막으로 10분 동안 90:10으로 유지하였다. 검출파장은 300 nm에서 측정되었고, 분석 칼럼의 오븐 온도는 25 ℃로 일정하게 하였다. 한편, 표준물질로는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈을 구입하여 사용하였고, Carbosynth (Berkshire, UK)의 비니페린을 사용하였다. 각 실험값은 5번 반복 측정의 평균으로 표시하였다.
분석 결과, 스틸벤 표준용액이 레스베라트롤, 비니페린, 테로스틸벤의 순으로 모두 방해 peak 없이 분리되었으며 RT값은 각각 레스베라트롤은 14.02분, 피노실빈은 20.19분, 테로스틸벤은 24.69분대로 4종 모두 30분 이내에 분리된 것을 확인하였으며, 이를 검량곡선으로 사용하였다.
parameters 조건
Column Agilent eclipse XDB-C18 (4.6 x 250mm, 5m, ZORBAX)
Column 온도 25 ℃
flow rate 1.0 ml/min
주입양(injection volume) 20 ㎕
용매 A: 0.1% formic acid in water,
B: 0.1% formic acid in acetonitrile
구배(gradient) time(min) % A % B
0 90 10
30 20 80
35 90 10
45 90 10
wavelength 300 ㎚
4) 통계처리
스틸벤 함량의 경우 Window 용 SAS 9.2 version (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, p<0.05 수준에서 Duncan의 multiple range test로 유의성을 검정하였다.
5) 결론
도 1은 고형분 중량 기준으로 블루베리 부위별 스틸벤 함량을 분석하여 나타낸 그래프이다.
블루베리 부위 스틸베노이드 농도
(Stilbeoid content)(㎍/g dw)
레스베라트롤
(Resveratrol)		 -비니페린
(-Viniferin)		 피노실빈
(Pinosylvin)		 테로스틸벤
(Pterostilbene)
과피
(Skin)		 1.45±0.24 2.88±1.50 0.03±0.03 0.14±0.02
줄기
Stem		 1.38±0.16 7.19±1.43 0.00±0.00 0.03±0.01
잎
Leaf		 2.86±0.64 1.00±0.12 0.09±0.03 0.10±0.02
도 1 및 표 2를 살펴보면, 레스베라트롤의 경우 블루베리의 잎에서 2.86 ㎍/g dw 가장 많이 함유되어 있었고, 블루베리의 과피와 줄기에는 각각 1.45, 1.38 ㎍/g dw이 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 비니페린은 스틸벤 4 종 중 블루베리의 부위에 따라 함량 차이가 현저한 것을 확인하였다. 특히, 블루베리의 줄기와 과피에 가장 높게 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
그러나, 피노실빈의 경우 블루베리의 각 부위별로 유의적 차이를 나타내는 것으로 확인하였고, 전체적으로 가장 낮은 함량이 포함되어 있는 것으로 확인되었으나, 특히 블루베리의 줄기에서는 피노실빈이 거의 함유되지 않은 것으로 관찰되었다.
테로스틸벤의 함량은 과피에서 0.14 μg/g dw로 가장 높았고 잎과 줄기에서는 각각 0.10과 0.03 μg/g dw로 유의적인 차이를 보이고 있음을 확인하였다.
종합하면, 블루베리 과피, 줄기, 잎에는 종류에 따라 다양한 함량과 비율로 각기 다른 스틸베노이드가 포함되어 있어 어느 것을 사용하여도 무방하나, 다양한 스틸벤이 존재하는 것은 블루베리의 잎과 과피임을 확인하였는 바, 블루베리의 잎과 과피를 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
실험예 2. 블루베리 유래 캘러스 유도 가능성 확인
1) 식물체 준비
블루베리 성체의 조직체를 사용하기에 앞서, 무균 상태의 블루베리 조직배양 식물으로부터 오염되지 않은 블루베리 조직체를 얻은 후, 이를 사용하여 캘러스 형성이 가능한지 여부 먼저 확인하고자 하였다.
블루베리 조직배양묘의 잎과 줄기 조직을 일정 크기의 절편으로 만든 후 캘러스 유도 배지에 치상하였다. 치상한지 약 2-3주 후 캘러스가 발생되었고, 약 6-8주 정도 되면 계대배양에 사용할 수 있을 정도로 조직체 전체에 캘러스가 형성되었고, 이때 무균상태에서 블루베리 조직배양묘의 잎 유래 캘러스를 잘라내어 계대배양용 평판 배지에 옮겼다. 캘러스는 형태가 없이 탈분화하는 세포 덩어리이지만 결코 균일한 것이 아니기 때문에 분열중심(캘러스 덩어리의 외층)을 포함하는 부분, 즉 색이 엷고 윤기 있는 신선한 부분만을 핀셋과 메스로 잡아내어 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 수행함으로써 캘러스를 안정화시켰다. 계대배양을 할 수 있을 만큼 조직 전체에 캘러스가 형성되는 것을 확인하였고, 본 발명에서는 증식정도, 배양기간 및 비용을 고려하여, 약 4-6주 주기로 계속적으로 새로운 배지에 이식하여 블루베리 조직배양묘 잎 유래 캘러스 세포주를 획득하였다. 따라서 무균 상태의 적정 배양 조건에서 블루베리 조직체로부터 캘러스 형성이 가능하다는 것을 확인하였다.
이때 사용된 캘러스 유도용 배지는 식물호르몬(auxin 0.2 ㎎/㎖), sucrose 30 g/l, gelite 4 g/l(pH는 5.8)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 배지를 사용하였다. 배양조건은 온도 26℃, 습도 60%의 growth chamber에서 1500 Lux의 광배양(16/8 h day/night cycles) 및 암배양 조건으로 배양을 실시하였다.
2) 결론
도 2는 무균상태에서 자란 블루베리 조직배양묘의 잎, 줄기 및 과피 조직을 일정 크기로 잘라, 조직체(절편)을 제조한 후, 캘러스 유도 배지에서 치상하여 유도된 캘러스를 촬영한 사진이다.
구체적으로 치상한지 약 2-3주 후 캘러스가 발생되었고(도 2 좌측), 약 6-8주 정도 되면 계대배양에 사용할 수 있을 정도로 조직체 전체에 캘러스가 형성되었음을 확인하였다(도 2 우측). 이때 무균상태에서 캘러스를 잘라내어 계대배양용 평판배지에 옮긴다. 캘러스는 형태가 없이 탈분화하는 세포 덩어리이지만 결코 균일한 것이 아니기 때문에 분열중심(캘러스 덩어리의 외층)을 포함하는 부분, 즉 색이 엷고 윤기 있는 신선한 부분만을 핀셋과 메스로 잡아내어 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 수행함으로써 캘러스를 안정화시켰다.
도 2에서와 같이 잎, 줄기 모두에서 계대배양을 할 수 있을 만큼 조직 전체에 캘러스가 형성되는 것을 확인하였고, 잎 유래 캘러스는 약 4-6주 주기로 계속적으로 새로운 배지에 이식하여 블루베리 조직배양묘 잎 유래 캘러스 세포주를 획득하였다.
실험예 3. 블루베리 유래 캘러스 세포배양을 위한, 식물체의 표면살균법 최 적화
1) 식물체 준비
우선 블루베리 유래 캘러스의 세포배양을 위한 식물체의 표면소독법을 최적화하였다. 식물체는 국내에서 생산되고 있는 블루베리 중 성남 지역에서 2016년 6월에 수확한 조생종인 O'Neal(오닐) 품종의 과실과 잎을 사용하였다.
상기 식물체가 과실일 경우, 상기 과실을 먼저 전체적으로 소독하여 무균상태로 만든 다음, 과육을 제거한 과피 조직체를 사용하였다.
상기 식물체를 물로 여러차례 세척하여 오염물 및 오염균을 깨끗하게 제거한 후 세척 용액의 종류(세제, 차아염소산 등), 농도 및 처리 시간, 70% 에탄올의 처리 유무 등을 변수로 설정하여 수행하였고, 구체적인 세척순서와 조건은 표 3에 나타난 바와 같다(1->2->3->4 순서로 세척 진행됨). 세척용액을 변경할 경우에는 멸균수로 3회, 30초 이상 세척하고, 25 ℃, 100 rpm으로 shaking incubator에서 세척한 후, 변경할 세척용액을 적용하였다.
실험의 재현성 및 신뢰성을 위해 각각의 실험은 동일한 조건의 10 내지 11개의 시료를 만들어 온도 25 ± 1 ℃, 습도 60%의 growth chamber에서 암배양 조건으로 배양하면서 생존률 및 오염률을 분석하였다. 각 실험에서 교차오염 요인을 제거하기 위해, 각 시료당 1 개의 조직체를 치상하여 실험하였다.
세척순서 세척용액 농도(%) 세척시간
1 Detergent 0.2, 2 5분
2 Tap water - 1, 3, 6시간
3 Ethanol 70 0, 30초
4 NaOCl 0.5, 1 30초, 1, 5분
2) 결론
도 3은 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 잎(old leaf) 유래 조직체의 세포배양 결과이고, 도 4는 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 과실 유래 과피 조직체의 세포배양 결과이다.
오닐 품종의 잎의 경우, 2% detergent 5분 → tap water 1시간 → 70% EtOH 30초 → 1% NaOCl 5분으로 세척한 식물체로부터 조직체를 분리하여 배양하는 것이 손상 및 오염이 되지 않고, 생존률(100%)이 가장 높았다(도 3).
오닐 품종의 블루베리에서 과실의 경우 2% detergent 5분 → tap water 1 시간 → 70% EtOH 30초 → 0.5% NaOCl 30초로 세척하여 식물체를 준비하여, 이로부터 얻은 조직체를 사용하는 것이, 조직세포 표면의 손상을 최소화하여 캘러스 세포배양이 가능하게 하는 표면살균 조건임을 확인하였다(도 4)(생존률 80%).
특히 무균화된 과실로부터 과피 조직을 분리하여 캘러스를 유도하는 경우에는 블루베리의 품종에 따라 표면살균 최적 조건이 달랐는데, 구체적으로 오닐보다 과육이 크고 단단한 다로우의 경우, 마지막 4차 단계에서 1% NaOCl로 1-5분간 세척하는 것이 바람직함을 확인하였다.
또한, 락스(1% sodium hypochlorite)를 이용해 10 분 이상 처리한 경우에는 오염률은 낮지만, 순서에 상관없이 조직체가 손상되거나 탈색될 뿐만 아니라, 생존률도 저하되는 문제가 발생하였다(도 5).
실험예 4. 블루베리 잎 유래 캘러스 유도 배지조건 최적화
1) 실험재료
무균상태에서 자란 O'Neal(오닐) 품종의 조직배양묘의 잎을 사용하였고, 블루베리 성체의 경우 국내에서 생산되고 있는 블루베리 중 성남 지역에서 2016년 6월에 수확한 조생종인 O'Neal(오닐) 품종의 잎을 실험예 3의 조건으로 표면소독한 후 무균 재료로 사용하였다. 배지에 사용된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 배지, sucrose(S0809), gelite(G1101), 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid(2,4-D)(D0911), BA(6-Benzylaminopurine, 6-BAP)(B0904)는 Duchefa Biochemie(Haarlem, Netherland)에서 구입한 것을 사용하였다.
2) 블루베리 잎 유래 캘러스의 유도
본 발명에서는 대표적인 블루베리 품종인 오닐로부터 캘러스를 유도하였다. 오닐 품종의 블루베리 잎을 채취하여 흐르는 물로 세척한 다음 2% detergent 5분 → tap water 1시간 → 70% EtOH 30초 → 1% NaOCl 5분으로 세척하여 표면살균을 실시하였다. 표면살균이 완료된 블루베리 잎 조직체를 5 x 5 mm 크기로 절취한 다음 각각의 조직을 배양배지에 치상하였다. 이때 사용된 캘러스 유도용 배지는 식물호르몬(auxin 또는 cytokinin), sucrose 30 g/l, gelite 4 g/l(pH는 5.8)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 배지를 사용하였다. 배양조건은 온도 25 ± 1 ℃, 습도 60%의 growth chamber에서 1500 Lux의 광배양(16/8 h day/night cycles) 및 암배양 조건으로 배양을 실시하였다. 각 군당 10-11개의 dish를 만들어 조직체를 치상하였고, 이 실험 set을 4 반복 진행하였다.
1차 계대배양 시기는 증식배지 상의 증식속도를 관찰하여 최적화하였고, 증식속도는 캘러스 조직체를 치상(이식)한지 3주 후의 증가율(면적)을 분석하여 결정하였다.
이후, 2차 계대배양부터는 일률적으로 같은 주기로 진행하였고, 동일조성의 고체배지를 사용하여 계대배양을 실시하였다.
3) 1차 계대배양 시기 분석결과
식물체(블루베리)를 실험예 3의 최적 무균조건으로 처리하고, 다양한 배지조건으로 블루베리 잎 조직체를 배양하였을 때, 캘러스 형성이 유도되는지와 증식률을 분석하고자 하였다. 모든 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4는 다양한 조건의 배지에서 블루베리 잎 유래 캘러스의 유도 및 증식 결과를 나타낸 것이다.
구분 조직체 배지에 첨가된 호르몬 조건 캘러스 유도 및 증식 정도
Auxin(2, 4-D)a 농도(㎎/㎖) Cytokinina
농도(㎎/㎖)		 증식 정도
(score)b 		증식률(%)c
제1군 잎
(암배양)
young leaf		 0.2 0 - 15
제2군 0.5 0 - 25
제3군 1.0 0 - 42
제4군 0.2 0.05 + 64
제5군 0.5 0.05 + 78
제6군 1.0 0.05 + 74
제7군 0.2 0.1 + 69
제8군 0.5 0.1 + 61
제9군 1.0 0.1 + 72
제10군 0.2 0.2 ++ 67
제11군 0.5 0.2 +++ 66
제12군 1.0 0.2 ++ 66
제13군 잎
(광배양)
young leaf		 0.2 0.2 +++ 70
제14군 0.5 0.2 +++ 67
제15군 1.0 0.2 ++ 68
제16군 잎
(암배양)
old leaf		 0.2 0.2 ++ 65
제17군 0.5 0.2 ++ 63
제18군 1.0 0.2 ++ 52
a 2, 4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid), BA: 6-benzylaminopurine.
b Score for blueberry explants: - Weak callus initiation and poor growth, + Good induction of callus but poor growth, ++ Good initiation and moderate growth, +++ Best induction and vigorous growth of callus.
c Induction coefficient(%) = (total number of induced calli/number of cultured explants) x 100%.
표 4는 각 군에서, 3주 후 블루베리 잎 유래 캘러스의 증가율(면적) 변화를 이용해 캘러스 유도 및 증식을 평가한 것이다. 이를 통해 약 3-6주 후 캘러스가 유도되었고, 무균상태의 적정 배양조건에서 블루베리 조직체(잎)로부터 캘러스 유도가 가장 높은 배지조건은 배지에 auxin(2, 4-D)과 cytokinin(BA)가 동시에 첨가된 배지인 것이 바람직하다는 것을 확인하였다. (auxin 0.5 ㎎/㎖과 cytokinin 0.2 ㎎/㎖)
또한, 동일한 배지를 사용하더라도 광배양이 암배양보다 우수하고, 조직배양묘 잎(young leaf)이 블루베리 (성체) 잎(old leaf)을 이용했을 때보다 우수하였으며, 상술한 조건(배지조건, 광배양/암배양, young leaf)들을 모두 만족시킬 경우, 캘러스 유도에 걸리는 시간을 약 2-4주 단축할 수 있음을 확인하였다.
다시 말해 1차 계대배양 시기가 4 내지 6주인 것이 바람직함을 확인하였으며, 본 실험예에서는 캘러스 내 스틸벤 함량 및 관련 유전자 발현량을 고려하여 가장 바람직한 4주 간격으로 일률적으로 수행하였다.
또한, 과피를 사용할 경우에는 캘러스 유도가 2~4주 오히려 지연되므로, 잎을 사용하는 것이 바람직하였다.
상술한 바와 같이 1차적으로 배양 유도한 캘러스 중에서 제11군 및 제14군의 캘러스를 3~5차 계대배양하였다. 그 결과 배양조건과 계대배양 차수에 따라 증식률 뿐만 아니라 캘러스의 물리적 특성(경도, 색상 등)에도 차이를 보이고 있음을 육안으로 확인하였다. 구체적으로 캘러스의 색상에 있어서, 블루베리 (조직배양묘) 잎 유래 캘러스의 경우 광배양에서는 계대배양 4차까지 전반적으로 노란색을 띄는 황색 캘러스를 얻을 수 있었으나, 암배양에서는 계대배양 3회에서 일부 캘러스가 겉면에 붉은색을 띄는, 적색 캘러스가 유도됨을 확인하였다. 이는 육안으로 현저히 확인가능하며, 발생한 적색 캘러스만을 분리하여 사용하였다.
블루베리 과피 유래 캘러스 경우에는 암배양 조건에서만 계대배양 4차에서 붉은색을 띄는 적색 캘러스가 유도되어 얻을 수 있음을 확인하였다. 다만 과피 유래 캘러스의 경우 계대배양 시기가 잎 유래 캘러스보다 2~4 주 더 길기 때문에, 대량생산이 어렵다는 단점이 있다.
실험예 5. 블루베리 ( 조직배양묘 ) 잎 유래 캘러스 현탁배양조건 최적화
1) 블루베리 ( 조직배양묘 ) 잎 유래 캘러스의 현탁배양
본 실험에서는 실험예 4의 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(DY), 실험예 4의 제14군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(LY) 및 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 4차까지 계대배양하여 얻은 적색 캘러스(DR)을 이용하여 현탁배양을 수행하였다.
캘러스는 불균일한 세포의 집단이므로, 증식속도가 늦기 때문에, 액체배지에 옮겨 현탁 배양함으로써 균일한 세포의 증식과 대량생산을 유도할 수 있다. 따라서 상기 황색 캘러스(LY, DY)와 적색 캘러스(DR)를 다양한 조건으로 현탁배양하여 최적 조건을 확인하고자 하였다.
이때, 캘러스 덩어리가 균일하게 흩어져 세포군이 되도록 하는 것이 바람직하며, 이를 위해 본 발명의 실험예에서는 무균 상태에서 멸균된 메스를 이용하여 캘러스 덩어리를 곱게 다진 후, 배양함으로써 액체 배지 상에서 균질하게 풀어져 증식되도록 하였다(도 6의 '현탁배양 초기').
현탁배양은 식물호르몬(auxin(2,4-D) 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin(BA) 0.0, 0.2, 4 ㎎/㎖ 혼합)과 sucrose 30 g/l, CaCl2 30 mM(pH는 5.7)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 액체배지를 사용하였다. 액체배지는 고압 살균한 후 100 ㎖ 삼각플라스크에 40 ㎖씩 분주하여 사용하였다. 블루베리 유래 캘러스(황색 캘러스(LY, DY)와 적색 캘러스(DR)) 400 ㎎을 40 ㎖의 액체 배지에 넣고 shaking incubator를 사용하여 25 ℃, 100 rpm, 암배양 조건으로 7주 동안 현탁배양한 다음 캘러스 배양물을 수확하였다.
3종류의 현탁 배양배지에서 배양된 캘러스 배양물의 전후 생중량 및 건중량을 측정하여 세포 증식률을 분석하여, 도 6과 표 5에 나타내었다.
도 6은 제19군, 제20군 및 제21군으로부터 제조된 캘러스 배양물을 촬영한 사진이다.
구분 캘러스 현탁배양용 액체배지에 첨가된 호르몬 조건 증식 정도
Auxin(2, 4-D)a 농도(㎎/㎖) Cytokinina
농도(㎎/㎖)		 증식 정도
(score)b 		증식률(%)c
제19군 황색 캘러스(제11군)_DY 0.0 0.0 - -
(곰팡이 오염 또는 세포 괴사)
제20군 0.2 0.0~0.2 +++ 52
제21군 0.2 4 - -
(세포 괴사)
제22군 황색 캘러스(제14군)_LY 0.0 0.0 - -
(곰팡이 오염 또는 세포 괴사)
제23군 0.2 0.0~0.2 +++ 68
제24군 0.2 4 - -
(세포 괴사)
제25군 적색 캘러스(제11군_4차)_DR 0.0 0.0 - -
(곰팡이 오염 또는 세포 괴사)
제26군 0.2 0.0~0.2 ++ 54
제27군 0.2 4 - -
(세포 괴사)
도 6 및 표 5에 나타난 바와 같이 현탁배양 배지에 Cytokinin(BA)이 4 mg/mL 포함된 경우에는 약 3주 후 세포가 완전히 괴사하였음을 확인하였다(제21군).
또한 Auxin(2, 4-D)과 Cytokinin(BA)이 모두 포함되지 않은 현탁배양 배지를 사용한 제19군의 경우, 황색 캘러스가 서서히 노란빛을 잃다가 괴사하거나, 곰팡이 오염되어 사멸하는 것을 확인하였다.
이를 참고하면 현탁배지에 있어서 Cytokinin(BA)의 1 ㎎/㎖ 초과 함유되어 있는 경우, 캘러스에 독성으로 작용하여 괴사를 유도하는 문제가 발생할 수 있고, Auxin(2, 4-D) 및 Cytokinin(BA)가 모두 0 ㎎/㎖인 경우 캘러스의 현탁배양에 필수적인 성분의 부재로 증식이 충분히 일어나지 않으며, 곰팡이 오염에 취약해지게 되는 문제가 발생할 수 있다.
한편, Cytokinin(BA)만을 0.0, 0.1, 0.2 ㎎/㎖로 조절한 제20군의 경우에는 캘러스의 배양액의 증식률이 거의 유사하게 증식하였으며, 이를 통해 Auxin(2, 4-D) 0.2 ㎎/㎖, Cytokinin(BA)가 0.0~0.2 ㎎/㎖포함되어 있는 현탁배지를 이용하는 것이 바람직함을 확인하였다. 이 경우 6~7주 후에는 캘러스 배양물을 수확할만큼 충분히 증식되어 있음을 확인하였다. 필요에 따라 계대배양도 가능하다.
실험예 6. 블루베리 잎 유래 캘러스의 생산 비니페린과 테로스틸벤 분리 및 함량 분석( 테로스틸벤 최대 강화 배양)
1) 블루베리 잎 유래 캘러스 배양물 회수
본 실험에서는 실험예 4의 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(DY), 실험예 4의 제14군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(LY) 및 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 4차까지 계대배양하여 얻은 적색 캘러스(DR)을 이용하여 현탁배양을 수행하였다.
실험예 5에서 최적화한 현탁배양배지(auxin 0.2 ㎎/㎖ 및 cytokinin 0.0~0.2 ㎎/㎖ 혼합물, sucrose 30 g/l, CaCl2 30 mM(pH는 5.7)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231))를 사용하였고, 이의 조성은 하기 표 6에 나타내었다. 액체배지는 고압 살균한 후 100 ml 삼각플라스크에 40 ml씩 분주하여 사용하였다. 상기 선별된 캘러스(LY, DY, DR)를 각각 무균상태에서 멸균된 메스를 사용하여 캘러스 덩어리를 곱게 다진 후 캘러스 400 mg을 40 ml의 액체 배지에 넣고 shaking incubator를 사용하여 25 ℃, 100 rpm, 암배양 조건으로 7주동안 현탁배양한 후 수확하였다.
3종류의 현탁배양배지에서 배양된 캘러스 추출물의 건조중량을 측정하여 표 6에 나타내었다.
표 6에서 사용한 캘러스는 LY, DY, DR로 표시하였고, 그 뒤의 숫자는 현탁배양배지의 auxin(2,4-D), cytokinin(BA)의 함량을 나타낸 것이다. 구체적으로 0.2/0.0은 auxin 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin 0.0 ㎎/㎖이 혼합된 배지를 사용한 것이고, 0.2/0.1은 auxin 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin 0.1 ㎎/㎖ 혼합된 배지를 사용한 것이며, 0.2/0.2는 auxin 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin 0.2 ㎎/㎖ 혼합된 배지를 사용한 것이다.
2) 캘러스 추출물 제조
상기 3종류의 액체현탁 배양배지에서 배양된 캘러스 배양물에서의 테로스틸벤, 비니페린, 레스베라트롤의 함량을 분석하기 위하여, 추출물을 얻고자 하였다.
구체적으로 상기 3종류의 현탁 배양배지에서 배양된 캘러스 배양물로부터 현탁배양세포를 분리하여, 동결건조한 후 막자사발을 이용해 분쇄하여 사용하였다.
분말시료 3 g에 25 ml의 메탄올/HCl 0.1%용액을 가하여 현탁시킨 후 27℃에서 30분 초음파 추출하였다. 추출액을 원심분리장치(Centrikon T-324, Kontron, Milano, Italy)를 사용하여 10분간 12,000ㅧg로 원심분리한 후 whatman filter paper No. 4로 여과하였고, 잔여물을 수거하여 같은 방법으로 재추출하였다. 여과액을 혼합한 후 40℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하여 용매를 제거하였다. 20 ml 증류수와 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate)를 차례대로 첨가하여 4℃에서 10분간 방치하였다. 에틸아세테이트 층을 새로운 tube로 옮기고 잔여 증류수 층은 위와 같은 방법으로 2회 처리하였다. 모든 에틸아세테이트 층을 혼합한 후 40℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하였고, 농축물을 1 ml의 메탄올에 녹여 0.22 μm syringe filter로 여과 후 HPLC에 주입하였다.
구체적으로 블루베리 잎 대조구는 블루베리 조직배양묘의 잎을 사용한 것을 제외하고는 상기 추출과정과 모두 동일하게 수행하여 대조구를 얻었다.
3) HPLC 분석
레스베라트롤, 테로스틸벤, 비니페린에 대한 함량 분석은 종래 HPLC 분석법(Lyons et al. 2003)을 일부 수정하여 사용하였다. 구체적으로 HPLC 시스템(Agilent 1100 series)은 펌프, 인젝트, UV/VIS 검출기, 적분기(Chemstation software), 컬럼(Agilent eclipse XDB-C18: 4.6 mm x 250 mm, 5 μm, ZORBAX) 등으로 구성되었으며, 분석 조건은 하기 표 1에 나타내었다 0.1% formic acid가 첨가된 water(A)와 0.1% formic acid가 첨가된 acetonitrile(B)를 용매로 하여 구배(gradient) 조건 하에서 1.0 ml/min의 유동속도로 45분간 작동시켰다. 이때 시료 주입량은 20 μl이었고, 용매의 구배(gradient) 조건은 초기 90:10의 A/B 비율로 시작하여 30분까지 20:80 비율로 유지한 후 35분까지 90:10으로 조정되었으며, 마지막으로 10분 동안 90:10으로 유지하였다. 검출파장은 300 nm에서 측정되었고, 분석 칼럼의 오븐 온도는 25 ℃로 일정하게 하였다. 한편, 표준물질로는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈을 구입하여 사용하였고, Carbosynth (Berkshire, UK)의 비니페린을 사용하였다. 각 실험값은 5번 반복 측정의 평균으로 표시하였다.
5) 결론
캘러스의 최적 배양조건을 탐색하기 위해 블루베리 잎 추출물(대조구), 캘러스 추출물로부터 스틸벤을 추출하고 추출물 내 스틸벤 목표물질 4종(resveratrol, ε-viniferin, pinosylvin, pterostilbene)의 함량을 HPLC로 정량분석 하였고, 그 결과는 다음 표 6에 도시하였다.
구분 ε-비니페린 레스베라트롤 테로스틸벤 피노실빈
블루베리 잎
(대조구)		 1.00±0.12 2.86±0.64 0.10±0.02 0.09±0.03
실험군 1
(LY_0.2/0.0)		 4.40±0.05
[4.4]		 0.06±0.03
[0]		 0.56±0.02
[15.6]		 0.29±0.00
[3.2]
실험군 2
(DY_0.2/0.0)		 9.38±0.15
[9.4]		 0.33±0.01
[0]		 0.37±0.03
[13.7]		 0.57±0.01
[6.3]
실험군 3
(DR_0.2/0.0)		 17.98±2.89
[18]		 0.00±0.00
[0]		 8.91±1.30
[89.1]		 0.60±0.02
[6.7]
실험군 4
(LY_0.2/0.1)		 5.72±0.22
[5.7]		 0.07±0.01
[0]		 0.93±0.04
[9.3]		 0.36±0.05
[4]
실험군 5
(DY_0.2/0.1)		 4.72±0.31
[4.7]		 0.20±0.02
[0]		 0.16±0.04
[1.6]		 0.69±0.01
[7.7]
실험군 6
(DR_0.2/0.1)		 4.18±0.53
[4.2]		 0.10±0.04
[0]		 0.95±0.03
[9.5]		 1.14±0.07
[12.7]
실험군 7
(LY_0.2/0.2)		 9.95±0.12
[10]		 0.50±0.02
[0]		 0.50±0.13
[5]		 0.00±0.00
[0]
실험군 8
(DY_0.2/0.2)		 7.06±0.33
[7.6]		 0.17±0.02
[0]		 0.23±0.02
[2.3]		 0.84±0.03
[9.3]
실험군 9
(DR_0.2/0.2)		 1.58±0.39
[1.6]		 0.10±0.03
[0]		 0.72±0.06
[7.2]		 1.49±0.04
[16.6]
- 블루베리 잎(대조구) 추출물과 캘러스 추출물 내 레스베라트롤, ε-비니페린, 테로스틸벤 함량(μg/g DW) 및 대조구 대비 증폭률
표 6에 나타난 바와 같이, 캘러스 추출물에서 ε-비니페린, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈의 함량을 분석하였다. 그 결과, 실험군 3의 캘러스 추출물이 가장 높은 비니페린 및 테로스틸벤 함량을 보인 것을 확인하였다.
상술한 암배양공정을 통해 얻은 블루베리 유래 적색 캘러스를 현탁배양하고, 이를 추출한 추출물의 경우(실험군 3), 레스베라트롤의 함량은 거의 확인되지 않았으나, 테로스틸벤(pterostilbene)은 평균 89배, ε-비니페린(ε-viniferin)은 18배 더 많이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 이는 동일한 조건의 현탁배양배지로 배양한 황색 캘러스 배양액의 추출물보다 6 배 이상 높은 것이다. 또한 동일한 적색 캘러스를 이용하되, 다른 조건의 현탁배양배지로 배양한 배양액의 추출물보다 12 배 이상 높은 함량임을 알 수 있다. 게다가 ε-비니페린도 2 배 이상 높은 함량이 포함되어 있음을 확인하였다.

Claims (14)

1) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계로부터 회수된 블루베리 캘러스를 3~6주 간격으로 3~4회 계대배양하여 캘러스를 얻는 단계;를 포함하는 비니페린(viniferin) 및 테로스틸벤(pterostilbene)을 대량생산하는 블루베리 캘러스 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 캘러스는 상기 2) 단계의 계대배양 과정동안, 상기 1) 단계의 블루베리 캘러스로부터 변형된 것으로, 육안으로 확인하였을 때 적색을 띄는 적색 캘러스인 것을 특징으로 하는 방법.
ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계로부터 회수된 블루베리 캘러스를 3~6주 간격으로 3~4회 계대배양하여 캘러스를 얻는 단계;
ⅲ) 상기 캘러스를 증식배지에서 현탁배양하는 단계; 및
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계의 캘러스 배양물을 추출하는 단계; 블루베리 유래 비니페린(viniferin) 및 테로스틸벤(pterostilbene)을 대량생산하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 블루베리 과피 또는 잎인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 분리한 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 캘러스는 상기 ⅱ) 단계의 계대배양 과정동안, 상기 ⅰ) 단계의 블루베리 캘러스로부터 변형된 것으로, 육안으로 확인하였을 때 적색을 띄는 적색 캘러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도 배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신, 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌을 포함하는 고체배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅲ) 단계의 증식배지는 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도의 옥신을 포함하는 액체배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅰ), ⅱ) 및 ⅲ) 단계는 암배양인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅳ) 단계는 초음파 추출, 용매 추출 및 분배추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 추출법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ⅳ) 단계를 통해 얻은 블루베리 유래 캘러스 추출물을 동결??건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 비니페린은 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린인 것을 특징으로 하는 방법.
옥신, 사이토키닌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생장조절제를 유효성분으로 함유하는, 블루베리 유래 캘러스로부터 비니페린 및 테로스틸벤을 대량생산하는 캘러스의 변형을 유도하는 캘러스 유도 및 계대배양용 배지조성물.
제13항에 있어서,
상기 옥신은 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도로, 상기 사이토키닌은 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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