KR20090129963A

KR20090129963A - 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물

Info

Publication number: KR20090129963A
Application number: KR1020090052340A
Authority: KR
Inventors: 장미옥; 임민정; 오일석; 이대희; 이은경; 진영우
Original assignee: 주식회사 운화
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2009-12-17
Also published as: US20130302287A1; US20110097310A1; JP5572786B2; CA2732058C; RU2500386C2; CA2732058A1; BRPI0909876A2; AU2009258386A1; WO2009151302A9; JP2011522884A; AU2009258386B2; KR101126315B1; RU2011100824A; WO2009151302A3; WO2009151302A2; EP2308462A2; US9095532B2; CN102159182B; CN102159182A

Abstract

본 발명은 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 기존 항노화제와 항산화제의 부작용을 최소화하여 피부에 안전하면서도, 피부노화의 주요 원인인 자외선 노출에 의한 활성산소를 억제하는 항산화 작용을 나타내며, 노화와 관련된 인자들을 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있으므로, 노화 예방 및 억제에 유용하다.

인삼류, 산삼, 인삼, 형성층, 노화방지, 항산화

Description

산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물{Anti-Aging or Anti-oxidative Composition Comprising Plant Stem Cell Line Derived from Cambium of Panax Ginseng Including Wild Ginseng or Ginseng}

본 발명은 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

현재 전 세계적으로 약 30만 종의 식물이 알려져 있으며, 다양한 생리활성을 나타내는 유용성분들이 식물에 함유되어 있음이 밝혀지고 있다. 상기 유용성분들은세포의 정상적인 대사과정에서 부차적으로 생산되어 세포 내 특수한 장소에 축적되는 2차 대사산물로서, 생화학적, 생태학적 관점에서 볼 때 미생물이나 외부 동물들로부터 식물체 자신을 방어하거나 생리 활성 면에서 유리한 물질이라는 점에서 관심이 커지고 있다. 식물이 생산하는 2차 대사산물로는 알칼로이드(alkaloids), 플 라보노이드(flavonoids), 카로티노이드(carotenoids), 글리코사이드 (glycosides), 테르페노이드(terpenoids) 등이 있다.

이러한 2차 대사산물에는 보습, 피부진정 및 수렴, 자외선 차단, 미백, 각질제거, 피부노화 방지, 항산화, 피부주름 개선, 항균, 항염, 항암 등의 효과를 나타내는 것들이 많다. 따라서, 식물 유래의 유용성분을 함유하는 다양한 화장품들이 개발되고 있다. 이에 '상지로부터 분리된 멀베린(mulberrin)을 함유하는 미백 화장료' (대한민국 등록특허 제25582호), '초두구 추출물을 함유하는 화장료' (대한민국 등록특허 제295875호), '인삼 추출물을 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물' (대한민국 등록특허 제361433호), 및 '감태 추출물을 함유하는 주름 개선 화장료 조성물' (대한민국 특허출원 제2001-25580호) 등이 개시되어 있다. 이외에도 율피, 홍경천, 창이자(도꼬마리), 박, 소목(Caesapinia sappan L.), 호장근, 맬로우(mallow), 페퍼민트(peppermint), 오리나무, 허브, 자작나무, 치자, 복령, 석류, 버드나무, 녹두, 장미 등 다양한 식물의 추출물을 함유하는 여러 가지 화장품들이 개발되어 있다. 이와 같이 식물 유래의 유용성분들은 2차 대사산물로서 생합성 경로가 복잡하여 식물로부터 직접 추출하여 이용되고 있다.

한편, 피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 제 기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 탄력손실, 각질화, 주름생성 등의 피부 노화현상을 촉진시키게 되는데, 이러한 현상 을 방지하고 보다 건강하고 탄력있는 피부를 유지하기 위하여 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리활성물질들이 강화된 화장품을 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시켜 피부노화를 효과적으로 억제하기 위한 노력이 있어 왔다. 그러나 이러한 기존의 화장품 원료들은 대부분 그 효능이 미진하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.

이에 본 발명자들은 기존 항노화제 및 항산화제의 부작용을 최소화하고, 노화 방지 효과 및 항산화 효과가 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물이 노화 및 산화에 대하여 뛰어난 억제 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 기존 항노화제 및 항산화제의 부작용을 최소화한 노화방지 및 항산화 활성을 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물을 제공한다:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항노화능 또는 항산화능을 가지는 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배 양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 기존 항노화제와 항산화제의 부작용을 최소화하여 피부에 안전하면서도, 피부노화의 주요 원인인 자외선 노출에 의한 활성산소를 억제하는 항산화 작용을 나타내며, 노화와 관련된 인자들을 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있으므로, 노화 예방 및 억제에 유용하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 "형성층(cambium)"이란 부름켜라고도 하는 것으로 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다 (대한민국 등록특허 제0533120).

본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로,증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 또한, 세포주 "배양액"이란 세포를 배양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다. 추가적으로 본원에서 "배양물"이란 배양액 및/또는 배양된 세포주를 포함하는 물질로서, 이때 배양된 세포주는 배양조건에 의하여 분화되거나 유용물질의 생산능 및/또는 분비능이 향상된 세포주를 모두 포함하는 개념이다.

본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.

본 발명은 일 관점에서, 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 인삼류(Panax ginseng)는 산삼 또는 인삼을 포함한다 (Lian M.L. et al ., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al ., J. Plant Biology , 49:26, 2006; Teng W.L. et al ., Tissue and Organ Culture , 68:233, 2002). 이때, 본 발명에서 상기 산삼 또는 인삼은 노지삼 또는 조직배양삼류(부정근 및 부정근 유래 세포주)를 포함한다.

본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주는 (a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; (b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및 (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한, 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; (b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스 (shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및 (c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다:

(a) 인삼류의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가한 다음, IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.

이때, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 삼투 스트레스 공정은 형성층 특이적으로 세포주를 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게는 상기 IAA 또는 IBA를 포함하는 배지에서 배양하기 전에 수행하여 형성층 이외의 일반 조직, 즉, 피층(cortex), 사부(phloem), 목부(xylem), 수(pith)에서는 분열능을 잃어 추후 IAA 또는 IBA와 같이 형성층분열 특이적인 호르몬을 처리하여 배양하는 경우 괴사되도록 한다. 이때 삼투제는 0.5~2M의 함량으로 처리하고, 냉장 또는 상온에서 16시간 내지 24시간 동안 삼투 스트레스를 가한 후, 처리한 삼투 스트레스를 제거하는 것이 바람직하나, 삼투제의 농도, 처리 시간 및 온도는 식물체별, 조직별 상태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 IAA 또는 IBA는 0.1~5㎎/ℓ의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (c) 단계는 바람직하게는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 2,4-D, 피클로람 및 IBA 중 어느 하나는 바람직하게는 1~5mg/L, 더욱 바람직하게는 2mg/L의 함량으로 사용한다.

본 발명에서 상기 배양물은, 상기 세포주를 엘리시터로서 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 키토산, 페닐알라닌(phenylalanin), 벤조익산, ABA, 살리실산(salicylic acid) 및 아세트산 나트륨(sodium acetate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하는 단계를 추가로 수행하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 배지는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 아세트산 나트륨 (sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 또한, 상기 세포주에 엘리시터로서 자외선, 열, 에틸렌, 항진균제, 항생제, 중금속 염 및 높은 염농도 등을 처리하여 물리적 화학적 스트레스를 가하여 수득된 배양물을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용한 배지는 통상의 식물 조직 배양을 위한 배지로써, 일례로 N6배지, SH배지, MS 배지, AA 배지, LS 배지, B5배지, WPM 배지, LP배지, White배지, GD배지, DKW배지, DCR 배지 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 알코올로는 메탄올, 에탄올 등 탄소수가 1 내지 5인 알코올을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 추출물은 상기 세포주에 증류수, 메탄올 및 아세톤으로 순차적으로 용매분획하여 획득된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 세포주 추출물 및 배양액을 피부 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포에 처리하여 섬유아세포의 증식효능이 우수함을 확인하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액이 피부탄력을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 또한, 다른 실시예에서는 피부콜라겐을 분해하여 피부주름을 형성시키는 MMP-1의 발현을 억제하는 효과를 확인하여, 주름 방지 및 개선 효과가 있음을 보였다. 아울러, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 UV에 의해 유 도되는 활성산소 억제 효능이 있음을 확인하여 항산화 효과가 있음을 확인하였는데, 항산화 활성을 가지는 조성물은 노화를 예방하는 효과가 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에게 널리 알려진 사실인 바, 본 발명에 따른 조성물이 노화방지 효과를 가짐은 자명하다.

추가적으로 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 객관성을 담보하기 위하여 외부 분석기관에 의뢰하여 항노화능 및 항산화 실험을 의뢰하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액은 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 RA 및 산삼 추출물에 비하여 노화방지 효과가 매우 우수한 것을 확인하였으며, 또한 본 발명에 따른 세포주 및 배양액의 경우 노지산삼 추출물에 비하여 훨씬 강력한 항산화 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에서는 상기 세포주를 함유하는 조성물이 노화방지 효과 및 항산화 활성을 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 세포주 추출물이 노화방지 효과 및 항산화 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주 자체 또는 그 파쇄물을 함유한 조성물의 경우에도 노화방지 효과 및 항산화 활성을 나타낼 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.

본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나를 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물은 이들을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 세포주 또는 세포주의 파쇄물, 추출물 또는 배양액은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본원에서 '기능성 화장품'이란, 일반 화장품에 본 발명에 따른 세포주 또는 그 추출물 또는 배양액을 첨가함으로써 일반 화장품의 기능성을 향상시킨 화장품을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 세포주 또는 그 파쇄물, 추출물 또는 배양액을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 이용하여 기능성 화장품을 제공할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 세포주 또는 그 파쇄물, 추출물 또는 배양액 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 용매, 안정화제, 용해화제, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프, 린스로 구성된 군에서 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

이러한 화장료 조성물의 제형 예에 상관없이 본 발명의 세포주, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하여 항산화 효과를 가지며, 이에 피부에 발생한 자유라디칼을 소거하고 세포내 항산화계 보호효과가 있어 자유라디칼 등의 작용에 의한 산화에 의하여 발생하는 피부 노화의 예방 및 지연 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항노화능 또는 항산화능을 가지는 기능성 식품에 관한 것이다.

본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 세포주, 그 세포주의 파쇄물, 추출물 또는 배양액을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 산삼의 형성층 유래 세포주의 추출물 또는 그 배양액의 피부 노화 방지효과를 확인하였으나, 그 세포주 또는 그 파쇄물 자체를 사용해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1: 산삼의 형성층 유래 세포주의 제조

1-1: 식물재료의 준비

도 1의 (a)의 A는 본 발명에서 사용한 산삼의 전형적인 모습을 보여준다. 산삼을 준비한 다음, 산삼의 주근부를 사용하기 위해 흐르는 물로 겉표면에 묻어 있는 흙이나 그 외의 오염물질을 제거하고 액체 세제를 이용하여 주근의 표면을 씻어 준 다음, 흐르는 물에 방치를 하였다. 깨끗하게 씻은 조직은 클린벤치 내에 준비된 멸균된 플라스크에 넣고 70% 에탄올로 30초 내지 1분 정도 살균하였다. 그 후 멸균수로 헹궈 주고 1% 내지 1.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite, Junsei, Japan)을 이용하여 5분 내지 15분 정도로 소독액을 처리하였다. 이때, 소독액이 효과적으로 조직 내로 침투하게 하기 위해 TWEEN 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Junsei, Japan)을 몇 방울 정도 떨어뜨려 처리하였다. 이 과정이 마쳐지면 멸균수로 3회 내지 5회 정도로 헹궈 주었다. 이 후에 살균 처리한 조직의 갈변화를 방지하기 위해 항산화제가 포함된 BIM(browning inhibition medium)에 살균된 주근을 넣고 30분 내지 1시간 정도 진탕배양하고 멸균된 여과지에 놓고 물기를 제거하였다.

사용된 BIM의 조성 및 사용농도는 표 1과 같다.

<표 1> BIM 조성 및 사용 농도

구성성분	사용농도
McCown WPM salt	1/4 strength
Sucrose	1%(w/v)
PVP(polyvinyl pyrrolidone)	0.5%(w/v)
Ascorbic acid	100㎎/ℓ
Citric acid	150㎎/ℓ
pH 5.8로 보정

여기서, 염농도는 전체의 1/4에 해당하는 양만 첨가한다.

상기에서 수행한 재료를 갈변이 되는 것을 방지하기 위해 항산화제가 포함된 CS solution (cutting sloution, 표 2)이 담긴 멸균 접시에 놓고, 겉껍질을 얇게 벗겨 내고 반으로 갈라 각 부분에서 분열능이 왕성한 형성층 부분이 포함되게 해서 가로×세로×높이=0.5~0.7cm×0.5~0.7cm×0.2~0.5mm의 크기로 절단을 하였다. 도 1의 (a)의 B는 산삼의 주근부에서 형성층이 포함되도록 상기 크기로 절단을 하여 절편체를 제조한 모습이다.

<표 2> CS(cutting solution)

구성성분	사용농도
PVP(Polyvinyl pyrrolidone)	0.5%(w/v)
Ascorbic acid	100㎎/ℓ
Citric acid	150㎎/ℓ

1-2: 산삼 주근부 형성층 포함 절편체에의 삼투제의 처리

상기 실시예 1-1에서 제조된 절편체에서 분화된 조직 즉, 사부, 목부, 수 등은 괴사시키고 분열조직인 형성층만을 생존시키기 위해 삼투 스트레스를 처리하였다. 상기 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1, 표 3)에 블로팅(blotting)을 하여 1M 수크로오즈(Duchefa, Netherland) 용액이 담긴 플라스크에 넣어 냉장상태에서 16~24시간 동안 삼투스트레스를 처리한 후 0.05M 수크로오즈 용액(sucrose solution)에서 5분간, 0.1M sucrose 용액에서 5분간 처리하여 고농도의 sucrose에 의한 스트레스를 해제하였다. 그 후 상기 삼투 스트레스가 해제된 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1)에 올려서 물기를 제거하였다.

<표 3> 전치상 배지(배지 1) 조성

조성		mM	㎎/ℓ
Macroelements	Ca(NO₃)₂	2.35	471.26
	NH₄NO₃	5	400
	MgSO₄·7H₂O	1.5	180.54
	K₂SO₄	5.68	990
	CaCl₂·2H₂O	0.65	72.5
	KH₂PO₄	1.25	170
조성		μM	㎎/ℓ
Microelements	MnSO₄·4H₂O	131.94	22.3
	ZnSO₄·7H₂O	29.91	8.6
	Na₂MoO₄·2H₂O	1.03	0.25
	H₃BO₃	100.27	6.2
	CuSO₄·5H₂O	1.0	0.25
	FeNa-EDTA	100	36.7
Vitamin	Glycine	26.64	2.0
	myo-Inositol	554.94	100
	Nicotinic acid	4.06	0.5
	Pyridoxine-HCl	2.43	0.5
	Thiamine-HCl	2.96	1.0

1-3: 산삼의 형성층 포함 절편체에서 형성층 기원의 동질적 세포주 유도

형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적 세포주를 유도하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 삼투 스트레스를 처리한 절편체를 세포주 유도 배지 (배지 2, 표 4)에 치상하였다. 치상에 사용된 배지는 하기 <표 4>에 수록된 바와 같다. 치상된 절편체는 22±1℃ 암조건에서 배양하였다.

<표 4> 형성층 기원의 동질성 세포주 유도를 위한 배지 조성(배지 2)

조성 및 조건	사용농도 및 조건
Salt	Full strength WPM
Sucrose	3%(w/v)
IAA(Indole-3-acetic acid)	2㎎/ℓ
pH	5.8
Gelrite	0.3%(w/v)
Ascorbic acid	100㎎/ℓ
Citric acid	150㎎/ℓ

이때, 삼투 처리를 하지 않고 바로 동질성 세포주 유도배지에 치상한 절편체에서는 <표 5>에 수록된 바와 같이 치상 초기(2~3일 내)에 빠르게 형성층 중심으로 노랗게 반응을 보이다가 시간이 지나면서 절편체 전체가 노랗게 변하는 양상을 보였다. 형성층 중심의 노란 반응을 보인 절편체를 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주 분리 및 증식 최적 배지(배지 3)에 계대를 하여 계속적인 동질성 세포주 유도 및 증식을 시도하였으나 갈변 양상이 심화되었고, 시간이 경과해도 갈변 반응외에 어떤 반응도 보이지 않았다.

반면, 삼투 처리를 하고 해제를 한 후 동질성 세포주 유도배지에 치상한 절편체는 <표 5>에 기재된 바와 같이, 다른 조직에서는 세포가 유도되지 않고 형성층에서만 특이적으로 동질성 세포가 유도됨이 관찰되었다. 즉, 삼투 처리를 한 후, 해제를 하여 치상한 절편체에서는 배양 3~7일 사이에 절편체의 형성층 부위가 연노랑색으로 변하기 시작하였다. 이로부터 약 7~14일 후 연노랑색으로 변한 부위에서 동글동글한 세포주가 유도됨을 관찰하였다. 도 1의 (a)의 C는 산삼의 형성층 포함 절편체 중 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질성 세포주가 유도된 모습을 나타낸다.

한편, 삼투 처리를 한 절편체를 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질성 세포주 유도배지가 아닌 통상적인 인삼, 산삼 등 인삼류 배양에서 사용하는 2,4-D를 포함하는 배지를 사용하였을 때는 배양 7~10일 사이에 절편체의 전체 부분이 노랑색으로 변하기 시작해서 이로부터 약 7~14일 후 전체 절단면에서 세포가 유도됨이 관찰되었다.

<표 5> 삼투 처리 한 절편체와 처리하지 않은 절편체의 반응 비교

처리별	무처리	16시간 처리	20시간 처리	24시간 처리
양상	치상 초기에 형성층 중심으로 노란 반응이 진행되면서 이런 반응이 절편체 전체로 퍼지는 경향을 보였음. 그 후 형성층을 포함한 절편체 전체적으로 갈변 반응이 심하게 진행되어 더 이상 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질성 세포주 유도는 나타나지 않았음	형성층에서만 특이적으로 세포가 유도됨이 관찰됨. 삼투 스트레스 처리 시간을 달리하여 처리한 결과, 서로 유사한 결과를 보였음. 즉, 상기 처리 시간별 반응물간 큰 차이는 보이지 않음.

1-4: 분리된 산삼 형성층 유래 동질성 세포주의 증식

상기 실시예 1-3에서 유도된 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주를 이용하여 증식에 사용하였다. 배지는 하기 <표 6>에 제시된 기본 염(salt) 조성을 바탕으로 <표 7>에 제시된 대로 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주의 증식 최적 배지를 사용하였다.

<표 6> 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주 분리 및 증식 최적 배지의 기본 salt 조성

조성		mM	mg/L
Macroelements	CaCl₂ㆍ2H₂O	2.99	332.02
	KH₂PO₄	1.25	170
	KNO₃	18.79	1900
	MgSO₄	1.5	180.54
	NH₄NO₃	20.61	1650
조성		uM	mg/L
Microelements	CoCl₂·6H₂O	0.11	0.025
	CuSO₄·5H₂O	0.1	0.025
	FeNa-EDTA	100	36.7
	H₃BO₃	100.27	6.2
	KI	5.0	0.83
	MnSO₄·4H₂O	100	16.9
	Na₂MoO₄·2H₂O	1.03	0.25
	ZnSO₄·7H₂O	29.91	8.6
Vitamins	Glycine	26.64	2.0
	myo-Inositol	554.94	100
	Nicotinic acid	4.06	0.5
	Pyridoxine-HCl	2.43	0.5
	Thiamine-HCl	0.3	0.1

<표 7> 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주 분리 및 증식 최적 배지 조성(배지 3)

조성 및 조건	사용농도 및 조건
Salt	Full strength MS
Sucrose	3%(w/v)
2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)	2mg/L
pH	5.8
Gelrite	0.3%(w/v)
Ascorbic acid	100mg/L
Citric acid	150mg/L

도 1의 (a)의 C에 나타난 바와 같이 삼투 스트레스 처리와 배지 2를 사용하여 형성층에서만 특이적으로 동질성 세포가 유도된 후, <표 7>에 제시된 배지 3으로 계대한 결과, 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포가 계속적으로 분열·증식하여 배양 약 10~20일 후에 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주를 분리할 수 있었다. 이렇게 분리된 산삼 형성층 유래 동질성 세포주를 동일 배지에서 배양하여 분열능을 갖는 동질성 세포주를 다시 증식시켰다. 도 1의 (a)의 D는 분리된 형성층 특이적 동질성 세포주를 <표 6>에 제시된 배지 3에서 증식시킨 모습이다.

1-5: 분리된 세포주의 특성관찰

상기 산삼 형성층 유래 동질성 세포주를 하기 <표 8>의 액상 배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다. 한편, 인삼의 자엽 유래 캘러스(callus)도 <표 8>의 배지 4에서 배양하여 본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 동질성 세포주와 비교하였다.

<표 8> Suspension medium in Panax ginseng . (배지 4)

조성 및 조건	사용농도 및 조건
Salt	Full strength MS
Sucrose	3%(w/v)
2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)	2mg/L
pH	5.8

먼저 세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 9>와 같이 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 95%이상의 단세포 상태로 존재함을 확인할 수 있었으며, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이, 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다.

<표 9> The type of cell aggregates of Panax ginseng long-term cultures

Large cell aggregates	Moderate cell aggregates	Small cell aggregates	Single cell population	Explant source
90%	7%	2%	1%	cotyledon
0	0	5%	95%	cambium
Large cell aggregates, size higher than 1.5×10³㎛; Moderate cell aggregates 1×10³㎛; Small cell aggregates 4×10²㎛＜size＜ 1×10³㎛

한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 캘러스와 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 동질성 세포를 배양하였다. 배지는 <표 8>의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다.

그 결과, <표 10>에 나타난 바와 같이, 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 21일인데 반해 반응기(reactor)에서 는 28일로 길어졌다. 즉, 플라스크에서 배양 시 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도에서도 3~5배 정도의 높은 증식율을 보임을 확인하였으며, 대량 반응기에서는 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 5~9배의 높은 증식율을 보임을 확인하였다. 이는 이질적인 세포주는 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단(shear)에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다.

한편, 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 세포 배양물의 배가시간은 3~4일로 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다. 형성층 유래 동질성 세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않았다. 즉, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 교반작용에 따른 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 5~9배의 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.

<표 10> 액체 현탁배양 및 생물 반응기에서의 산삼 형성층 유래 동질성 세포주와 자엽 세포의 배가 시간

Explant source	Doubling time (day)
Explant source	flask	bioreactor
cotyledon	21	28
cambium	5	3~4

1-6: 엘리시터의 처리

상기 실시예 1-5와 같이 14일간 현탁배양한 세포주를 이용하여 3가지의 처리구로 나누어 실험을 수행하였다.

즉, (1) 상기 14일간 현탁배양한 세포주 (Growth stage), (2) 상기 14일간 현탁배양한 세포주를 멸균수에 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM를 첨가한 배지에서 14일간 암배양한 세포주 (Elicitation 1) 및 (3) 상기 14일간 현탁배양한 세포주에 메틸 자스모네이트 100uM를 첨가한 배지에서 14일간 암배양한 세포주 (Elicitaion 2)를 각각 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.

실시예 2 : 산삼의 형성층 유래 세포주의 추출물 제조

실시예 1에서 제조된 3가지 처리구의 세포주로부터 다음과 같이 유효물질을 추출하였다.

(1) DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 추출물의 제조

(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 동결건조세포주 500g에 500ml의 DMSO를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.

(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.

(ⅲ) 상기에서 얻은 DMSO 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.

(ⅳ) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 DMSO 추출물을 얻었다.

(2) 증류수 추출물, 메탄올 추출물 및 아세톤 추출물의 제조

(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 동결건조 세포주 500g에 500ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.

(ⅲ) 상기 증류수 가용성 물질을 얻은 후, 남은 증류수 불용성물질에 500ml의 메탄올(methanol)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.

(ⅳ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.

(ⅴ) 상기 메탄올 가용성물질을 얻은 후, 남은 메탄올 불용성물질에 500ml의 아세톤(acetone)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.

(ⅵ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 아세톤 가용성물질을 얻었다.

(ⅶ) 상기에서 얻은 증류수, methanol, acetone 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.

(ⅷ) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 세포배양액, 메탄올, 아 세톤에 녹여 증류수 추출물, 메탄올 추출물, 아세톤 추출물을 얻었다.

(3) 대조군의 제조

(ⅰ) 동결건조한 산삼뿌리 500g에 500ml의 DMSO를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.

(ⅳ) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 산삼 대조군의 DMSO 추출물을 얻었다.

실시예 3: 세포 독성 확인

시험에 사용될 시료의 사용 농도 범위를 결정하기 위해, 다음과 같이 세포독성을 확인하였다.

시험에 사용된 NHF(normal human fibroblast) 세포는 태아의 음경포피로부터 분리 배양하였다. 세포 배양액은 DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, 페니실린(penicillin) (100unit/㎖)과 스트렙토마이신(streptomycin) (100㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하여 조제하였 다. 세포는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대배양을 하였다. 이와 같이 배양한 NHF 세포는 본 실시예와 하기 실시예 4 및 5의 실험에 사용하였다.

상기 NHF(p5) 세포(normal human fibroblast cell)를 96 웰 플레이트(well plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하고, 24시간 후 실시예 2에서 제조한 산삼 형성층 세포주 DMSO 추출물 및 그 배양액을 농도별 (세포주 DMSO 추출물 (Wet) 및 건조세포주 추출물 (Dry)은 ppm, 배양액 (Media)는 %)로 처리하고, 48시간 동안 증식시켰다. 대조군은 추출물 및 배양액을 처리하지 않은 무처리구로 하였다. 그 후, WST-1 용액을 1/100 희석하여 분주 후 2시간 후 흡광도를 측정하였다.

그 결과, <표 11> 및 도 2에 나타난 바와 같이, 실험한 사용 농도 범위에서 독성을 보이지 않음을 확인할 수 있었다. 80%의 이상의 생존율을 보이는 경우를 독성이 없는 세포로 확인하였다. Elicitation 1은 실시예 1-6의 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM을 처리한 세포주의 DMSO 추출물을, Elicitation 2는 실시예 1-6의 메틸 자스모네이트 100uM를 처리한 세포주의 DMSO 추출물을, Growth는 실시예 1-6의 14일간 현탁배양한 세포주 (Growth stage)의 DMSO 추출물을 나타내며, Media는 상기 세포주 추출물 제조 시 제거한 배양액을 나타낸다.

<표 11> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 이용한 세포 독성 확인

시료상태	단계	농도(ppm or %)	% of control
Control			100
Wet(ppm)	Elicitation 1	100	102
		10	95
		1	98
	Elicitation2	100	110
		10	100
		1	98
	Growth	100	108
		10	106
		1	105
Dry(ppm)	Elicitation 1	50	115
		10	105
		1	95
	Elicitation2	50	105
		10	105
		1	100
	Growth	50	110
		10	115
		1	100
Media(%)	Elicitation 1	10	110
		5	125
		1	135
	Elicitation2	10	110
		5	115
		1	115
	Growth	10	98
		5	100
		1	98

실시예 4 : 섬유아세포( Fibroblast )의 증식효능 측정 - 항노화 효과의 확인

3.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Doubecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 인체 섬유아세포(NHF cell)를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하고, 24시간 starvation한 후, 실시예 2에서 제조한 산삼의 형성층 유래 동질성 세포주 DMSO 추출물 및 그의 배양 배지를 농도별 (세포주 DMSO 추출물 (Wet) 및 건조세포주 추출물 (Dry)은 ppm, 배양액 (Media)는 %)로 48시간 동안 0.5% FBS 최소 영양배지 상태에서 처리하였다.

배양 후, WST-1 용액을 1/100 희석하여 분주 후, 2시간이 지나서 0.2% MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 각 well당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 온도에서 4시간 동안 배양한 후, 생성된 포르마잔(formazane)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도는 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 산삼의 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그의 배양 배지를 처리한 실험군과 이를 함유하지 않은 대조군의 흡광도를 각각 비교한 후, 그 결과를 표 12에 나타내었다. 10% FBS는 동물 세포 배양 시 최대증식을 위한 영양배지 농도인 FBS 10%에서 배양한 것이다. Control은 음성대조군으로서, 세포주 추출물 또는 배양액의 첨가 없이 0.5% FBS 최소영양배지에서 배양한 것이다.

<표 12> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 이용한 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능

시료상태	단계	농도(ppm or %)	% of control
Control			100
10% FBS			145
Wet(ppm)	Elicitation 1	100	110
		10	105
		1	98
	Elicitation 2	100	115
		10	110
		1	113
	Growth	100	125
		10	115
		1	110
Dry(ppm)	Elicitation 1	50	130
		10	118
		1	110
	Elicitation 2	50	120
		10	115
		1	112
	Growth	50	122
		10	118
		1	110
Media(%)	Elicitation 1	10	108
		5	105
		1	105
	Elicitation 2	10	108
		5	103
		1	105
	Growth	10	102
		5	98
		1	102

<표 12> 및 도 3에 나타난 바와 같이, 음성대조군 (Control)과 대비하여 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액은 섬유아세포 증식효능이 있음을 확인할 수 있었으며, 특히 동결건조한 세포주 추출물(Dry)에서 섬유아세포 증식효능이 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 동결건조한 세포주 추출물(Dry)을 배양단계에 따라 비교한 결과, Elicitation 1에서 섬유아세포 증식 효능이 가장 좋은 것으로 확인되었으며, Elicitation 2와 Growth stage는 비슷하게 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 상기 섬유아세포는 피부 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는바, 본 발명에 따른 세포주 추출물은 피부 탄력을 증가시키는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: UV 에 의한 MMP -1 발현 억제 효능 확인 - 항노화 효과의 확인

자외선 노출에 의하여 MMP가 증가되는 경우, 증가된 MMPs는 피부의 콜라겐을 분해하여 피부주름을 형성시키는바, 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현이 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

NHF(p6)를 12 웰 플레이트에 75,000 세포/well가 되도록 분주하고 24시간 starvation한 후 40 mJ의 UVB를 조사하고, 각 시료를 농도별로 48시간 처리하여 키트(Amersham, RPN 2610)를 이용하여 실험을 수행하였다. 양성 대조군으로는 10uM의 레티노인산(retinoic acid)을 사용하였다.

<표 13> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 이용하여 UV에 의한 MMP-1 발현 억제 효능

시료	단계	농도(ppm or %)	% of control
No UV			100
Control UV			230
Retinoic acid		10uM	85
Wet(ppm)	Elicitation 1	100	125
	Elicitation 1	10	130
	Elicitation2	100	125
	Elicitation2	10	135
	Growth	100	140
	Growth	10	160
Dry(ppm)	Elicitation 1	50	120
	Elicitation 1	10	140
	Elicitation2	50	135
	Elicitation2	10	180
	Growth	50	100
	Growth	10	165
Media(%)	Elicitation 1	1/10	60
	Elicitation 1	1/20	130
	Elicitation2	1/10	60
	Elicitation2	1/20	200
	Growth	1/10	230
	Growth	1/20	250

그 결과, <표 13> 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액은 음성대조군 (Control UV)과 비교하여 유효하게 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타나 주름방지 및 개선효과가 있는 것으로 나타났다. 특히, 원당 및 메틸 자스모네이트를 처리한 Elicitation 1과 메틸 자스모네이트만을 처리한 Elicitation 2의 세포주 배양액 모두 0.1%를 시료로서 처리한 경우 주름개선 효과가 강한 것으로 알려진 레티노인산에 비하여도 매우 우수한 효과를 가지는 것으로 나타났다.

실시예 6: UV 에 의한 활성 산소 억제 효능 측정 - 항산화 효과의 확인

자외선에 의한 증가된 활성 산소가 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여, 96well black plate에 HaCaT cell(German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)을 30,000 세포/웰이 되게 분주하고 각 시료를 농도별로 3시간 동안 처리 하였다. 3시간 후 HBSS로 1번 세척하고 DCF 50uM을 각 웰에 처리하고 37도에서 20분간 반응을 시켰다. HBSS로 2번 세척한 후 Luminator를 이용하여 초기 흡광도를 측정하였다. 여기에 UVB 30mJ을 조사한 후 37도에서 2시간 배양 후 흡광도를 측정하였다. Control은 시료 및 UVB를 첨가하지 않은 것이고, UVB는 시료의 첨가 없이 UVB만 처리한 것을 나타낸다.

<표 14> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 이용한 UV에 의한 활성산소 억제 효능

시료	단계	농도(ppm or %)	% of control
Control			100
UVB			140
Wet(ppm)	Elicitation 1	100	80
	Elicitation 1	10	170
	Elicitation2	100	140
	Elicitation2	10	135
	Growth	100	150
	Growth	10	170
Dry(ppm)	Elicitation 1	50	50
	Elicitation 1	10	135
	Elicitation2	50	140
	Elicitation2	10	135
	Growth	50	105
	Growth	10	145
Media(%)	Elicitation 1	10	100
	Elicitation 1	1	130
	Elicitation2	10	130
	Elicitation2	1	105
	Growth	10	110
	Growth	1	120

그 결과, 상기 표 14 및 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 배양액을 제거한 세포주를 이용한 경우(Wet)과 동결건조 세포주를 이용한 경우(Dry) 모두 Elicitation 1의 세포주 추출물에서 우수한 항산화 효과를 보임을 확인하였다. 그 다음으로는 Elicitation 2 단계와 Growth 단계가 비슷하게 나타남을 확인하였다. 또한 Elicitation 1 단계의 동결건조 세포주 추출물 (Dry) 50ppm 처리군에서 항산화 효능이 가장 우수하게 나타남이 확인되었다.

실시예 7: 진세노사이드 ( ginsenoside ) 성분의 확인

산삼추출물의 진세노사이드 성분이 피부노화방지 및 항산화에 효과가 있는 것으로 알려져 있는바, 이에 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액의 피부노화방지 및 항산화 효과가 이러한 진세노사이드 성분의 효과에 의한 것인지 살펴보 기 위하여 진세노사이드 함량을 측정하였다. 즉, 실시예 2에서 제조한 단계별 산삼의 형성층 유래 동질성 세포주와 산삼은 동결건조 시킨 후 동결건조된 세포주 20mg를 메탄올 600ul에 1시간 추출하여 원심분리 후 상층액을 분리한다. 분리된 추출물에 진세노사이드 함량은 UPLC를 이용하여 측정하였으며 함량은 standard Re, Rb1, Rb2, Rd와 비교하여 나타내었다. 또한 배양액은 Elicitation 1 단계의 배양액을 0.2um Syringe 필터를 이용하여 filter한 후 UPLC를 이용하여 측정하였으며 함량은 standard Re, Rb1, Rb2, Rd와 비교하여 나타내었다.

<표 15> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 및 그 배양액과 산삼의 진세노사이드 함량 비교

	산삼의 형성층 유래 세포주			산삼의 형성층 유래 세포주 배양액	산삼
	Growth	Elicitation1	Elicitation2
진세노사이드 (Rb1, Rb2, Rd, Re)	0%	0.003%	0.018%	0%	3%

그 결과, 상기 표 15에서 볼 수 있는 바와 같이, Elicitation 2의 단계에서 가장 높게 진세노사이드가 나타나기는 하나, 이는 대조군인 산삼 추출물과 대비하여 약 167 배의 차이를 나타내고 성장단계의 산삼 형성층 유래 세포주에서나 세포주 배양액에서는 전혀 진세노사이드가 검출되지 않는바, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액의 피부노화방지 및 항산화 효과는 진세노사이드에 의한 효과가 아니며, 본 발명의 방법으로 분리된 세포주는 통상의 산삼세포와 활성성분이 상이함을 알 수 있었다.

실시예 8: 자외선 조사에 의하여 유도되는 콜라겐분해효소 ( MMP -1) 생성 억제효과 확인 (2)

본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 세포주의 노화방지 활성과 노지 산삼의 노화방지 활성을 비교하기 위하여, 경희대학교 피부생명공학센터에 의뢰하여 다음과 같이 상기 센터 표준업무지침서에 따라 실험을 수행하였다.

먼저, 섬유아세포(MCTT사, 한국)를 2×10⁴/(24 well)로 접종하고 12시간 배양하여 부착 후 FBS 무첨가 DMEM 배지에서 12시간 starvation하였다. DPBS 버퍼로 세척하고 365 nm 100 mJ/cm²를 조사하였다. 그리고, 시료로 실시예 2의 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM을 처리한 동결건조세포주의 DMSO 추출물(Elicitation 1)을 1, 10 및 50ppm의 농도로, 그리고 실시예 2의 배양액을 0.05, 0.1 및 1부피%의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에서 농도별로 24시간 처리하였다. 이때, 양성대조군으로서 RA(Retinoic acid)을 1μM 처리하였으며, 추가 대조군으로서 실시예 2의 산삼뿌리 동결건조물의 DMSO 추출물을 1, 10 및 50ppm의 농도로 처리하였다. 그 후, 배지를 회수하여 원심분리하고 상징액 중의 MMP-1의 양을 ELISA (Amersham) 방법으로 정량하였다. WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 약 55% (1ppm), 약 67% (10ppm), 약 83%의 MMP-1 억제능을 보였으며, 세포주 배양액의 경우에도 약 49%(0.05 부피%), 약 63%(0.1 부피%), 약 70%(1 부피%)의 MMP-1 억제능을 보여 보였으며, 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 양성대조군 RA와 대비하여서도 세포주 추출물 10ppm 및 50ppm 사용군 및 배양액 0.1 부피% 및 1 부피% 사용군에서 노화방지 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.

특히, 노지 산삼 뿌리의 동결건조 DMSO 추출물인 대조군과 대비하여서도, 세포주 추출물과 세포주 배양액 모두 훨씬 현저하게 MMP-1 발현을 저해하는 것으로 나타났는데, 상세하게는 노지 산삼 대비 세포주 추출물의 경우 27~51%의 억제능을 보였으며, 세포주 배양액의 경우 16~27%의 향상된 억제능을 보이는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액은 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 RA 및 산삼 추출물에 비하여 노화방지 효과가 매우 우수한 것으로 나타나, 노화방지용 조성물로서 특히 유용한 것으로 나타났다.

실시예 9: 자외선 조사에 의하여 발생하는 활성산소종 제거 효과 확인 (2)

본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 세포주의 항산화 활성과 노지 산삼의 항산화 활성을 비교하기 위하여, 경희대학교 피부생명공학센터에 의뢰하여 다음과 같이 상기 센터 표준업무지침서에 따라 실험을 수행하였다.

먼저 인간 각질형성세포주(HaCaT: German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 3×10⁴/(96 well)를 접종하고 12시간 배양하여 부착하고, 실시예 2의 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM을 처리한 동결건조세포주의 DMSO 추출물(Elicitation 1) 을 1, 10 및 50ppm의 농도로, 그리고 실시예 2의 배양액을 1, 5 및 10부피%의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에 첨가하여 3시간 처리하였다. 이때, 양성대조군으로서 NAC (N-acetyl-cysteine)을 10mM 처리하였으며, 추가 대조군으로서 실시예 2의 산삼뿌리 동결건조물의 DMSO 추출물을 1, 10 및 50ppm의 농도로 처리하였다.

그 다음, HBSS 버퍼로 세척하고 DCF-DA 50 uM (HBSS)을 37℃에서 20분간 배양하였다. 다시 HBSS 버퍼로 2회 세척하고 HBSS 30 ul를 첨가하여 365 nm 200 mJ/cm²를 조사하였다. 37℃에서 2시간 배양 후 형광도 (excitation, 485 nm;emission, 535nm, Infinite M-200, Tecan)를 측정하고, WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정하였다. 시료의 활성산소종 제거 효과는 자외선 조사를 하지 않는 군의 형광도를 100으로 하여 자외선 조사군과 비교하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 음성대조군 (UV 처리구) 대비 활성산소종 제거 효과를 확인한 결과, 대조군인 산삼 추출물의 경우 17~26%의 억제능을 나타냄에 반하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 경우 각각 28~36% 및 35~58%와 같이 더 현저한 감소값을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 세포주 및 배양액의 경우 노지산삼 추출물에 비하여 훨씬 강력한 항산화 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 10: 약학제제 제조예

제제예 1. 정제의 제조

실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.

제제예 2. 캡슐제의 제조

실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 3. 시럽제의 제조

실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

실시예 11: 화장품 제제 제조예

제형예 1. 유연 화장수(스킨로션)의 제조

배합성분	중량%
산삼 세포주 추출액 또는 그 배양액	0.1
글리세린	3
부틸렌글리콜	2
프로필렌글리콜	2
카르복시비닐폴리머	0.1
PEG 12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제형예 2. 영양 화장수(밀크로션)의 제조

배합성분	중량%
산삼 세포주 추출물 및 그 배양액	0.5
스쿠알란	5
밀납	4
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5
글리세린	3
부틸렌글리콜	3
프로필렌글리콜	3
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제형예 3. 영양크림의 제조

배합성분	중량 %
산삼 세포주 추출물 또는 그 배양액	2
밀납	10
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10
스쿠알란	5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5
글리세린	5
부틸렌글리콜	3
프로필렌글리콜	3
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제형예 4. 마사지크림의 제조

배합성분	중량 %
산삼 세포주 추출물 또는 그 배양액	5
밀납	10
폴리솔베이트 60	1.5
PEG 60 경화피마자유	2
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40
스쿠알란	5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4
글리세린	5
부틸렌글리콜	3
프로필렌글리콜	3
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제형예 5. 팩의 제조

배합성분	중량 %
산삼 세포주 추출물 또는 그 배양액	5
폴리비닐알콜	13
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5
알란토인	0.1
에탄올	6
PEG 12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

실시예 12: 기능성 식품의 제조 : 기능성 음료의 제조

제조예 1.

실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.

제조예 2.

실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 세포주의 유도과정 및 산삼의 형성층 유래 세포주를 나타내는 사진이다.

도 2는 정상 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 본 발명의 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 농도별로 처리하여 피부 섬유아세포에 세포 독성을 나타내는지 확인한 그래프이다 (ginseng wet cell, ginseng dry cell, ginseng cell-cultured medium, E1: elicitation 1 stage, E2: elicitation 2 stage, G: growth stage).

도 3은 정상 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 농도별로 처리하고 0.5% FBS의 최소 영양 상태에서 배양하여 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의한 섬유아세포의 세포 증식 효능을 확인한 그래프이다 (ginseng wet cell, ginseng dry cell, ginseng cell-cultured medium, E1: elicitation 1 stage, E2: elicitation 2 stage, G: growth stage).

도 4는 정상 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 농도별로 처리하고 자외선인 UVB를 처리하여 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 자외선 조사로 증가된 MMP-1 발현이 억제되는지를 확인한 그래프이다 (ginseng wet cell, ginseng dry cell, ginseng cell-cultured medium, E1: elicitation 1 stage, E2: elicitation 2 stage, G: growth stage, RA: retinoic acid).

도 5는 정상 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 농도별로 처리하고 자외선인 UVB를 처리하여 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 자외선 조사로 증가된 활성산소가 억제되는지를 확인한 그래프이다 (ginseng wet cell, ginseng dry cell, ginseng cell-cultured medium, E1: elicitation 1 stage, E2: elicitation 2 stage, G: growth stage).

도 6은 자외선 조사하여 MMP-1를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 MMP-1 생성억제효과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 자외선 조사에 의해 발생되는 활성산소종 제거 효과를 나타내는 그래프이다.

Claims

인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제 1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물:

(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물:

(a) 인삼류의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가한 다음, IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 배양물은 상기 세포주를 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate) 및 아세트산 나트륨 (sodium acteate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하여 수득된 것임을 특징으로 하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인삼류는 산삼 또는 인삼인 것을 특징으로 하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 상기 세포주에 증류수, 메탄올 및 아세톤으로 순차적으로 용매분획하여 획득된 것임을 특징으로 하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물.
인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제 8항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 노화 방지용 화장료 조성물:

(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제8항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 노화 방지용 화장료 조성물:

(a) 인삼류의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가한 다음, IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 배양물은 상기 세포주를 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate) 및 아세트산 나트륨 (sodium acteate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하여 수득된 것임을 특징으로 하는 노화 방지용 화장료 조성물.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 노화 방지용 화장료 조성물.
인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나를 함유하는 항노화능 또는 항산화능을 가지는 기능성 식품:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제 13항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 항노화능 또는 항산화능을 가지는 기능성 식품:

(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제13항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 항노화능 또는 항산화능을 가지는 기능성 식품:

(a) 인삼류의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가한 다음, IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
제13항에 있어서, 상기 배양물은 상기 세포주를 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate) 및 아세트산 나트륨 (sodium acteate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하여 수득된 것임을 특징으로 하는 항노화능 또는 항산화능을 가지는 기능성 식품.