KR102504487B1

KR102504487B1 - 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102504487B1
Application number: KR1020200186241A
Authority: KR
Inventors: 오철현
Original assignee: 오철현
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2023-02-27
Also published as: KR20220094724A

Abstract

본 발명은 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 금전초의 피부장벽 보호 기능을 확인하고, 피부장벽 보호 기능의 손상을 최소화하며 추출효율을 높이는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 알코올을 이용하여 파우더 형태의 금전초 시료를 실온에서 추출하는 추출단계; 추출된 추출물을 여과시키는 여과단계; 여과된 상기 추출물을 농축시키는 감압농축단계; 및 농축된 상기 추출물을 건조시키는 동결건조단계;를 포함하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 및 이의 제조방법{Glechoma hederacea var extract with skin barrier protection function and its manufacturing method}

본 발명은 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 금전초의 피부장벽 보호 기능을 확인하고, 피부장벽 보호 기능의 손상을 최소화하며 추출효율을 높이는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 크게 바깥쪽의 표피, 안쪽의 진피와 피하 조직으로 구분되며, 체내기관을 기온 및 습도 변화, 자외선, 기타 물리적, 화학적 외부 자극으로부터 보호해주는 기능이 있으며, 바깥쪽의 표피는 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 피부장벽 기능은 피부의 바깥층인 표피에서 생성 및 유지되고 있다.

표피의 바깥층인 각질층은 각질형성세포(keratino-cyte)로 이루어져 있으며, 이러한 각질형성세포는 분열 후 위쪽으로 이동하면서 분화가 시작되어 표피의 각질화 과정이 일어나며, 각질형성세포의 분화는 유전자발현 변화의 결과로서 분열 및 분화를 통해 피부장벽을 만드는 역할을 한다.

피부장벽의 가장 중요한 역할은 건조한 외부환경으로부터 약 80%의 물로 구성된 몸을 안전하게 보호하는 것이며, 또한, 피부장벽은 독성물질이나 미생물, 기계적 자극, 자외선에 대해 가장 중요한 일차방어선으로, 피부를 통한 전해질이나 수분 손실을 억제하여 피부가 정상적인 기능을 수행할 수 있는 환경을 제공한다.

또한, 최근 연구 결과에 따르면, 각질층은 피부장벽 기능뿐만 아니라 내부의 살아있는 세포층, 즉 표피층이나 진피층의 기능 및 역할, 구조에도 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있어, 그 중요성이 지속적으로 증가하고 있다.

이러한 피부장벽 기능이 훼손되는 경우, 각질층 내에 수분이 감소하고 각질세포의 유연성이 감소하여 각질의 탈락을 매개하는 각질교소체 분해 효소들이 정상적으로 활동할 수 없음에 따라, 각질층 최상부에 각질이 축적되고 부분적으로 덩어리째 탈락되는 현상이 발생하여 피부가 거칠어지고 투명성을 잃은 건조피부가 나타나게 되는 문제점이 있다.

이를 해결하기 위하여, 한국등록특허 제10-2157970호는 발아 새싹 추출물의 유산균 발효물을 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물에 관한 기술을 공지한 바 있으며, 또한, 한국등록특허 제10-1780111호는 회향 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 조성물에 관한 기술을 공지한 바 있다.

한편, 금전초(Lysimachia christinae Hance)는 긴병꽃풀이라 불리는 꿀풀과의 Glechoma longituba Kupr와 과로황이라 불리는 앵초과의 L. christinae Hance 두 가지 종이 있으며, 다양한 약리작용이 있어 전통적으로 담석증, 요로 결석 제거, 담낭염, 황달 등의 질환의 한방치료 및 민간치료에 이용되는 생약소재이며, 현재까지도 음료, 차 및 한약조성물 등의 재료로 사용되고 있다. 또한, Gao etal.(2013)의 연구에 따르면, 금전초는 플라보네(flavone), 아미노산(amino acid), 타닌(tannin), 콜린(choline) 등을 함유하고 있으며, 미리세틴(myricetin), 캠퍼롤(kaempferol) 및 케르세틴(quercetin)의 배당체가 풍부하며, 이러한 금전초는 항염증, 항균효과 및 담석증 감소 등에 효과적이라고 알려져 있다.

이에 본 출원인은 외부 자극으로부터 피부장벽 보호 기능이 있는 천연소재에 대해 연구한 결과, 금전초 추출물이 피부장벽 완화 유전자인 필라그린(filaggrin)의 발현을 증가시키고, 피부보습인자인 HAS 생성에 도움을 주는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-2157970호 (2020.09.14.) 대한민국 등록특허공보 제10-1780111호 (2017.09.13.)

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 금전초의 피부장벽 보호 기능을 확인하며, 피부장벽 보호 기능의 손상을 최소화하며 추출효율을 높이는 금전초 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 피부장벽 보호 기능을 가진 금전초 추출물에 대하여 안전성 및 항염증 활성을 확인하며, 보습 및 피부장벽 완화 효과를 확인하고 이를 화장료 조성물에 적용하는 것이다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위해서, 알코올을 이용하여 파우더 형태의 금전초(Lysimachia christinae Hance) 시료를 실온에서 추출하는 추출단계; 추출된 추출물을 여과시키는 여과단계; 여과된 상기 추출물을 농축시키는 감압농축단계; 및 농축된 상기 추출물을 건조시키는 동결건조단계;를 포함하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법을 제공할 수 있다.

여기서, 상기 금전초 시료는 건조 후 마쇄시켜 파우더 형태로 만드는 마쇄단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 추출단계는 상기 금전초 시료의 10 내지 12배의 양의 에탄올을 이용하여 24시간마다 2 내지 3회 추출되며, 상기 여과단계는 기공크기가 5 내지 8μm인 거름종이를 이용하여 여과되며, 상기 감압농축단계는 35 내지 45℃의 수온에서 회전진공증발기를 사용하여 감압농축하는 것을 특징으로 한다.

한편, 동결건조된 상기 추출물은 분말형태로 3 내지 5℃의 온도로 보관하여 사용되는 것을 특징으로 한다.

상기 동결건조단계 이후, 상기 추출물의 안정성, 항염증 활성, 보습 및 피부장벽 완화효과를 검증하는 효능검증단계;를 추가로 구비하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 효능검증단계의 상기 피부장벽 완화효과 검증은 상기 추출물의 필라그린(filaggrin) 발현이 농도 의존적인지 여부를 판단하여 확인하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위해서, 상술한 제조방법에 의해 제조된 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물을 제공할 수 있다.

본 발명은 일반적으로 항산화 및 항염 효과를 발휘하기 위하여 사용되는 금전초의 피부장벽 보호 기능을 확인하여, 피부장벽 보호 기능 화장료 조성물에 금전초를 사용하여 피부장벽을 보호할 수 있는 이점이 있다.

또한, 본 발명은 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물의 피부장벽 보호 기능의 손상을 최소화하며 추출효율을 높일 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 금전초 추출물과 비교예의 세포생존률(안전성) 검증 평가에 따른 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 금전초 추출물과 비교예의 항염증 활성 검증 평가에 따른 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 금전초 추출물과 비교예의 보습 및 피부장벽완화 검증 평가에 따른 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 금전초 추출물의 세포독성 검증 평가에 따른 그래프이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “피부장벽”이란 피부 가장 바깥층인 표피의 상부층으로 각질형성세포로 이루어진 각질층을 의미한다. 또한, 피부장벽은 독성물질이나 미생물, 기계적 자극, 자외선에 대해 가장 중요한 일차방어선이며, 피부를 통한 전해질이나 수분손실을 억제하여 피부가 정상적인 기능을 수행할 수 있는 환경을 제공하는 기능을 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “피부장벽 보호 기능”이란 피부의 가장 외각에 위치하는 각질층의 장벽 기능을 강화하는 것으로, 피부장벽 펩타이드인 필라그린(filaggrin)의 발현을 증가시킴으로써 피부장벽의 기능을 강화하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분으로 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질을 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 제조방법을 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물의 제조방법을 나타낸 순서도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물의 제조방법은 추출단계(S20), 여과단계(S30), 감압농축단계(S40), 동결건조단계(S50)를 포함하며, 마쇄단계(S10) 및 효능검증단계(S60)를 추가로 포함한다.

먼저, 상기 마쇄단계(S10)는 금전초(Lysimachia christinae Hance) 시료를 건조 후 마쇄시켜 파우더 형태로 만든다.

상기 금전초 시료는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으나, 깨끗이 세척하여 건조시킨 후 사용하는 것이 적절하며 마쇄기를 이용하여 균일한 입자크기를 가진 파우더 형태로 마쇄한다.

바람직한 실시예에 따른, 상기 마쇄단계(S10)는 상기 금전초 시료를 세척하여 24시간 동안 실온에서 건조시킨 후 마쇄기를 이용하여 마쇄하여 파우더 형태가 되도록 마쇄한다.

다음으로, 상기 추출단계(S20)는 파우더 형태의 상기 금전초 시료를 알코올을 이용하여 실온에서 추출시킨다.

상기 추출단계(S20)는 상기 마쇄단계(S10) 이후, 마쇄된 상기 금전초 시료를 추출물로 제조하는 단계로, 상기 금전초 시료의 피부장벽 보호 기능 손상을 최소화시키는 것이 중요함에 따라, 상기 금전초 시료의 피부장벽 보호 기능 손상을 최소화시키기 위하여, 상기 추출단계(S20)는 상기 금전초 시료의 10 내지 12배 양의 에탄올을 이용하여 실온에서 24시간마다 2 내지 3회 추출되는 것이 적절하다.

상기 추출단계(S20)에서 사용되는 추출용매는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하나, 저급 알코올 계열인 탄소수 1 내지 4의 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 추출단계(S20)에서 사용되는 추출방법은 알코올 추출방법을 사용하는 것이 바람직하며, 금전초 시료를 열수, 에틸아세테이트 및 디에틸에테르 등의 용매로 추출하는 경우 상기 금전초 시료의 추출효율이 낮다.

아울러, 상기 금전초 시료를 물을 이용하여 추출하는 경우 친수성 성분이 주로 용출되며, 에탄올을 이용하는 경우 추출하는 경우 지용성 성분이 주로 용출됨에 따라, 상기 추출단계(S20)는 70% 에탄올을 이용하여 실온에서 추출함에 따라 금전초 시료의 수용성 및 지용성 성분을 모두 용출할 수 있다.

바람직한 실시예에 따르면, 상기 추출단계(S20)는 상기 금전초 시료의 10배 양의 70% 에탄올을 이용하여 실온에서 24시간마다 2회 추출되는 것이 적절하다.

이때, 상기 추출단계(S20)는 24시간마다 2회 추출함에 따라 금전초 시료의 활성성분을 많이 추출할 수 있다.

다음으로, 상기 금전초 시료가 추출된 상기 추출물은 여과시키는 여과단계(S30)를 거친다.

상기 여과단계(S30)는 상기 추출단계(S20) 이후, 상기 추출물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로 상기 여과단계(S30)를 거치는 것이 바람직하며, 상기 여과단계(S30)는 기공크기(pore size)가 5 내지 8μm인 거름종이를 이용하여 여과되는 것이 바람직하다.

바람직한 실시예에 따른, 상기 여과단계(S30)는 상기 추출물을 기공크기가 8μm인 거름종이(Whatman No. 2, GE healthcare, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 여과한다.

다음으로, 여과된 상기 추출물은 농축시키는 감압농축단계(S40)를 거쳐 용매가 제거된다.

상기 감압농축단계(S40)는 상기 여과단계(S30) 이후, 여과된 상기 추출물을 용기에 넣어 35 내지 45℃의 수온에서 공지된 회전진공증발기를 사용하여 감압농축하여 용매를 제거한다.

이때, 상기 감압농축단계(S40)는 동결건조단계(S50)를 진행하기에 앞서 에탄올을 감압농축하여 모두 제거하며, 이는 에탄올이 추출물에 포함되어있는 경우, 동결건조 시 건조가 잘 되지 않기 때문에 에탄올을 모두 제거함으로써 이후 진행하는 동결건조단계(S50)에 소요되는 시간을 줄일 수 있으며,

구체적으로, 상기 감압농축단계(S40)는 진공상태가 비교적 낮은 온도에서 기화가 일어남에 따라 농축이 빠르게 진행됨에 따라 상기 회전진공증발기를 이용하는 것이 바람직하며, 실온보다 온도를 높이는 경우 농축에 도움이 되나, 온도를 많이 높이면 상기 추출물이 끓음이 발생하여 손상되기 때문에 35 내지 45℃의 수온에서 농축시키는 것이 바람직하다.

바람직한 실시예에 따른, 상기 감압농축단계(S40)는 여과된 상기 추출물을 용기에 넣어 40℃의 수온에서 회전진공증발기(rotary vacuμm evaporator)(HS-10SP; Hahnshin S&T, Korea)를 사용하여 감압농축한다.

다음으로, 상기 감압농축단계(S40)로 농축된 상기 추출물은 건조시키는 동결건조단계(S50)을 진행한다.

여기서, 추출물은 건조 방법에 따라 함량, 비타민 C 및 정유성분 등 원료의 성분에 차이가 발생할 수 있어 추출하여 얻고자 하는 특정 성분 및 효과에 따라 건조 방법을 달리 적용해야하며, 상기 금전초 추출물의 경우, 동결건조를 시킴으로써 피부장벽 보호 기능의 손상을 최소화시키며, 추출효율을 높일 수 있다.

상기 동결건조단계(S50)는 상기 감압농축단계(S40)로 농축된 상기 추출물을 건조시키는 과정이다.

여기서, 상기 추출물은 빠르게 건조하기 위해서 높은 온도에서 진행하나, 높은 온도에서는 활성성분의 손상이 발생되기 때문에 다른 건조방법 대비 활성성분의 손상 및 화학적 변이가 적은 동결건조방법을 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 추출물은 급속 냉동하여 저기압 상태에서 원료 중의 얼음 결정을 승화시키는 상기 동결건조단계(S50)를 거침으로써 상기 금전초 추출물은 장기간 보관이 가능하며, 부피와 중량이 감소하여 저장과 유통이 편리해진다.

바람직한 실시예에 따른, 상기 동결건조단계(S50)는 상기 금전초 추출물을 동결기(FD5525; Ilshin BioBase, Korea)를 이용하여 건조시킨다.

또한, 동결건조된 상기 추출물은 분말 형태로 3 내지 5℃의 온도로 보관하여 사용하는 것이 바람직하며, 상기 추출물은 3 내지 5℃의 온도 범위를 벗어나는 온도에서 보관하는 경우, 추출물이 변색되거나, 안전성 및 기능성 저하 등의 손상이 발생한다.

바람직한 실시예에 따른, 동결건조된 상기 추출물은 분말 형태로 4℃의 온도로 보관하여 사용하며, 저온에서 보관함에 따라 건조된 분말의 물리적 변형과 활성성분의 손상 및 화학적 변화 가능성을 낮출 수 있다.

다음으로, 동결건조되어 분말 형태로 보관되어진 상기 추출물은 70% 에탄올로 추출하여 효능검증단계(S60)를 진행하여 상기 추출물의 효능을 검증한다.

상기 효능검증단계(S60)는 상기 동결건조단계(S50) 이후, 상기 추출물의 안정성, 항염증 활성, 보습 및 피부장벽 완화효과를 검증하여 상기 추출물의 효능을 검증한다.

바람직한 실시예에 따르면, 상기 효능검증단계(S60)는 상기 추출물의 안정성은 세포생존률 및 세포독성 평가로 검증하며, 항염활성은 NO(Nitric Oxide)저해능 평가로 검증한다.

또한. 상기 효능검증단계의 상기 피부장벽 완화효과 검증은 상기 추출물의 필라그린(filaggrin) 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하는 것이 바람직하다.

상기 효능검증단계(S60)를 포함함으로써, 상기 금전초 추출물은 추출물의 피부장벽 보호 기능의 손상을 최소화시키면서, 추출물의 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니리, 피부장벽 보호 기능을 검증한 금전초 추출물을 제공할 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 금전초 추출물은 화장료로 제조되는 것이 바람직하며, 상기 화장료는 본 발명에 따른 금전초 추출물뿐만 아니라, 화장료에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명 상기 화장료를 첨가할 수 있는 제품으로는 인체 보습용 화장품이 바람직하며, 그 예로 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩 등이 있으며, 파운데이션, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클렌저, 세안제, 비누 등과 같은 화장품류도 가능하다.

본 발명의 상기 화장료의 구체적인 제형으로는, 인체 보습용 화장품인 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩 등의 제형이 바람직하며, 샴푸, 바디로션, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클렌저, 세안제, 비누 등의 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료는 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 상기 화장료의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 본 발명을 후술하는 실시예를 참조하여 설명하는 바, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아님이 자명하다.

실시예 1

금전초(Glechoma hederacea var) 시료 5g를 세척하여 24시간 건조한 후, 마쇄기를 이용하여 마쇄시켜 파우더 형태로 만들고, 70% 에탄올 50L를 이용하여 실온에서 24시간마다 2회 추출하며, 기공크기가 8μm인 거름종이를 사용하여 여과시키고, 여과된 상기 추출물을 40℃의 수온에서 회전진공증발기를 이용하여 감압농축시킨 후, 동결기를 이용하여 동결건조 시킨 후, 상기 추출물을 분말 형태로 4℃의 온도에서 보관하였다. 또한, 보관한 상기 추출물에 70% 에탄올 50L를 첨가하여 금전초 추출물을 제조하였다.

비교예 1

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 메탄올 50L를 이용하여 금전초 시료를 추출하여 금전초 추출물을 제조하였다.

비교예 2

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 에틸아세테이트 50L를 이용하여 금전초 시료를 추출하여 금전초 추출물을 제조하였다.

비교예 3

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 50℃의 수온에서 회전진공증발기를 이용하여 감압농축시켜 금전초 추출물을 제조하였다.

비교예 4

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 30℃의 수온에서 회전진공증발기를 이용하여 감압농축시켜 금전초 추출물을 제조하였다.

실험예 1

본 실험예 1은 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4에 의해 제조된 추출물의 추출수율을 평가한 것으로, 추출수율을 고형분의 함량으로 측정하였다.

상기 실험예 1은 추출용매 및 여과시 수온에 따른 추출물의 추출수율을 조사하기 위해, 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4는 동결기를 이용하여 동결건조 후 분말 형태로 4℃의 온도에서 보관된 상태의 추출수율을 고형분의 함량으로 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

구분	추출용매	수온(℃)	고형분(%)
실시예 1	에탄올	40	1.88
비교예 1	메탄올	40	1.79
비교예 2	에틸아세테이트	40	1.58
비교예 3	에탄올	50	1.65
비교예 4	에탄올	30	1.71

표 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 고형분의 함량이 가장 높게 나왔으며, 저급 알코올인 메탄올을 추출용매로 사용한 경우 고형분의 함량이 다소 감소하였으며, 에틸아세테이트를 추출용매로 사용한 경우 고형분의 함량이 낮은 것으로 확인되었으며, 추출물의 감압농축시 온도가 50℃ 및 30℃인 경우, 고형분의 함량이 낮아 추출수율이 다소 낮은 것으로 확인되었다.

비교예 5

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 인삼열매(Panax ginseng C. A. Meyer)를 이용하여 인삼열매 추출물을 제조하였다.

비교예 6

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 우절(Nelμmbo nucifera Gaertner)을 이용하여 우절 추출물을 제조하였다.

비교예 7

상기 실시예 1과 동일하게 진행하되, 정향(Syzygiμm aromaticμm)을 이용하여 정향 추출물을 제조하였다.

본 발명에 따라 제조된 금전초 추출물의 피부장벽보호 기능을 확인하기 위하여, 주지된 바와 같이 항염증 및 항산화 효능을 지닌 천연물 소재인 인삼열매, 우절 및 정향을 이용하여 비교예 5, 6 및 7의 추출물을 제조하였으며, 본 발명에 따라 제조된 금전초 추출물과 안전성, 항염증 활성, 보습 및 피부장벽 완화 효과를 비교하였다.

실험예 2 - 안전성 평가

본 실험예 2는 실시예 1 및 비교예 5 내지 7의 소재 안정성을 평가하기 위한 것으로 MTT assay kit를 이용하여 세포생존율을 측정하였다.

상기 실험예 2는 RAW 264.7 cell(마우스 대식세포)을 96 well plate에 4×10⁴cells/mL의 농도로 180 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며, 배양한 후, 저농도에서 고농도로 각각 20 ㎕씩 첨가한 뒤 24시간을 추가로 배양하였다.

대조군은 시료와 동량의 1% penicillin/streptomycin(Hyclone^TM, GE Healthcare Life Sciences, UK)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle mediμm(DMEM; Hyclone^TM, GE Healthcare Life Sciences, UK) 배지를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였으며, 배양한 후, 각 well에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT (Sigma-Aldrich) 용액을 증류수에 희석하여 20 ㎕씩 분주하여 4시간 배양한 후, 배양액을 제거하고 Dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma- Aldrich)와 ethanol을 1:1로 섞은 용액을 각 well당 200 ㎕를 가하여 실온에서 30분 반응시킨 후, ELISA 판독기(reader)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

측정값은 대조군의 흡광도 값과 비교하여 상대적인 세포 생존율을 계산하였으며, 실험의 정확도를 위하여 3반복을 원칙으로 동일한 실험을 3회 반복하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 도시된 바와 같이, 세포생존률은 실시예 1 및 비교예 5는 75~100μg/mL 농도에서 정상세포군(con) 대비 독성에 유의성을 나타내어 50μg/mL 농도 이하에서 추가실험을 진행하였으며, 비교예 6 및 비교예 7은 50~100μg/mL 농도에서 정상세포군(con) 대비 독성에 유의성을 나타내어 25μg/mL 농도 이하에서 항염증 추가실험을 진행하였다.

세포독성을 측정한 결과, 비교예 7의 경우 세포독성이 다소 확인되며, 비교예 6의 경우 세포독성에 유의성을 확인하였으며, 세포생존률은 실시예 1 및 비교예 5가 상대적으로 우수한 것으로 확인되었다.

실험예 3 - 항염증 활성 평가

본 실험예 3은 실시예 1 및 비교예 5 내지 7의 항염증 활성을 평가하기 위한 것으로, Nitric Oxide assay kit를 이용하여 Nitric Oxide(NO) 저해능을 측정하였다.

상기 실험예 3는 RAW 264.7 cell(마우스 대식세포)을 6 well plate에 4×10⁵cells/mL의 농도로 2700㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며, 배양한 다음날, 무혈청 배지를 사용하여 18시간 배양한 후 시료를 농도별로 처리하고, 2시간 후, LPS 1㎍/mL를 normal(정상세포)군을 제외한 모든 well에 넣어 자극시켰으며, 24시간 후 상층액 100㎕와 griess reagent 100㎕를 15분 동안 반응시킨 후, ELISA 판독기(reader)로 540nm에서 흡광도를 측정하여 Nitric Oxide(NO) 생성량을 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 도시하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 항염증 활성은 정상세포군(normal)에 LPS를 유도 후 각 시료를 처리하였을 때, 실시예 1, 비교예 6 및 비교예 7은 Nitric Oxide(NO)가 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였으며, 또한, 동일한 25μg/mL 농도군에서 비교한 경우, 비교예 7, 비교예 5, 비교예 6, 실시예 1의 순서로 항염활성이 높은 것을 확인하였다.

실험예 4 - 보습 및 피부장벽완화 효과 평가

본 실험예 4는 실시예 1 및 비교예 5 내지 7의 보습 및 피부장벽완화 효과를 평가하기 위한 것으로, Filaggrin production assay kit를 이용하여 피부장벽완화 유전자인 Filaggrin mRNA expression을 측정하였다.

상기 실험예 4는 HaCaT Cell(각질형성세포)을 24 well plate에 4×10⁵cells/well 씩 분주하고 24시간 후 각 시료를 농도별로 첨가하여 4시간 동안 배양하였으며, 배양 후, HacaT cell에 200㎕ TRI-Solution (Bio science technology)를 이용하여 RNA를 추출하고 PrimeScript™ RT Master Mix (Takara, RR036A)를 이용해 역전사하여 cDNA를 합성하였다. Filaggrin 유전자 발현을 비교하기 위해 TB Green　 Premix Ex Taq™II (Takara, RR280A)를 이용하여 증폭하였으며, Real-time PCR (Takara, TP940) 은 94℃, 30초 (denaturation), 55℃, 30초 (annealing), 72℃, 30초(extension)을 40회 반복하였으며, 사용한 primer는 표 2에 도시하였으며, 그 결과를 도 4에 도시하였다.

Gene	Primer	Sequence (5’to 3’)
Filaggrin	Forward	AAGCTTCATGGTGATGCGAC
Filaggrin	Reverse	TCAAGCAGAAGAGGAAGGCA
β-actin	Forward	AGAGCTACGAGCTGCCTGAC
β-actin	Reverse	AGCACTGTGTTGGCGTACAG

도 4에 도시된 바와 같이, 보습 및 피부장벽 완화 효과는 고농도에서 실시예 1 및 비교예 6이 Filaggrin mRNA expression이 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 피부장벽완화 유전자인 Filaggrin이 농도 의존적으로 증가함에 따라, 실시예 1 및 비교예 6의 보습 및 피부장벽완화 효과를 확인하였다.

실험예 5 - 세포독성 평가

본 실험예 5는 실시예 1의 세포독성을 평가하기 위한 것으로, LDH assay kit를 이용하여 세포독성을 측정하였다.

상기 실험예 5는 HaCaT Cell(각질형성세포)을 24 well plate에 3×10⁵cells/well 씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며, 배양 후, 저농도에서 고농도로 각각 처치한 뒤 4시간을 배양하하였으며, 상층액 50㎕를 반응액(LDH cytotoxicit assay kit, Cayman, USA) 50㎕와 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 도시하였다.

도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 세포독성 측정 결과는 시료의 농도 증가에 따라 LDH의 방출이 감소함에 따라, 실시예 1인 금전초 추출물이 세포 보호 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

상기 결과를 통해 금전초 추출물은 피부장벽완화 유전자인 Filaggrin 생성을 증가시켜 염증으로 인한 피부장벽 파괴에 대한 억제 효과가 있음은 물론, 피부보습인자인 HAS의 생성에 도움을 주며 보습 효과를 지니며, 안전성 및 항염증 활성을 확인함에 따라, 본 발명에 따라 제조된 금전초 추출물의 피부장벽 보호 기능을 확인할 수 있다.

이상과 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

S10 : 마쇄단계
S20 : 추출단계
S30 : 여과단계
S40 : 감압농축단계
S50 : 동결건조단계
S60 : 효능검증단계

Claims

알코올을 이용하여 파우더 형태의 금전초(Lysimachia christinae Hance) 시료를 실온에서 추출하는 추출단계;
추출된 추출물을 여과시키는 여과단계;
여과된 상기 추출물을 농축시키는 감압농축단계; 및
농축된 상기 추출물을 건조시키는 동결건조단계;를 포함하되,
동결건조된 상기 추출물은 분말형태로 3 내지 5℃의 온도로 보관하여 사용되는 것을 특징으로 하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 금전초 시료는 건조 후 마쇄시켜 파우더 형태로 만드는 마쇄단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 추출단계는 상기 금전초 시료의 10 내지 12배 양의 에탄올을 이용하여 24시간마다 2 내지 3회 추출되며,
상기 여과단계는 기공크기가 5 내지 8μm인 거름종이를 이용하여 여과되며,
상기 감압농축단계는 35 내지 45℃의 수온에서 회전진공증발기를 사용하여 감압농축하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 동결건조단계 이후, 상기 추출물의 안정성, 항염증 활성, 보습 및 피부장벽 완화효과를 검증하는 효능검증단계;를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 효능검증단계의 상기 피부장벽 완화효과 검증은 상기 추출물의 필라그린(filaggrin) 발현이 농도 의존적인지 여부를 판단하여 확인하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물 제조방법.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 피부장벽 보호 기능이 있는 금전초 추출물.