KR20210094312A - 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화 및 항노화 효과가 있는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
항노화 및 항산화 효과가 있는 화장료 조성물에 있어서, 쐐기풀(Urtica thunbergiana), 피뿌리풀(Stellera chamaejasme), 및 바위돌꽃(Rhodiola sachalinensis) 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic composition for enhancing skin barrier function and manufacturing method thereof}

본 발명은 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법으로서, 더욱 상세하게는 항산화 및 항노화 효과가 있는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부장벽은 독성물질이나 미생물, 기계적 자극, 자외선에 대해 가장 중요한 일차방어선이며, 피부를 통한 전해질이나 수분손실을 억제하여 피부가 정상적인 기능을 수행할 수 있는 환경을 제공한다.

피부장벽은 표피의 상부층으로 각질형성세포로 이루어진 각질층 즉, 벽돌을 쌓아놓은 형태이며, 포스포리피드, 세라마이드, 및 콜레스테롤 등으로 구성된 이중막의 지질이 피부장벽의 구조를 지지하는 역할을 한다.

건강한 피부의 각질층에는 약 30% 정도의 수분이 함유되어있으며, 각질층 내에 적절한 수분을 유지하기 위해서 표피 분화과정의 산물인 자연보습인자, 피지, 각질세포간 지질, 각질층의 탈락이 중요한 요소로 작용한다.

피부장벽 기능이 훼손되면, 각질층 내에 수분이 감소하고 각질세포의 유연성이 감소하여 각질의 탈락을 매개하는 각질교소체 분해효소들이 정상적으로 활동하지 못하며, 각질층 최상부에 각질이 축적되고 부분적으로 덩어리째 탈락되는 현상이 발생하여 거칠고 투명성을 잃은 건조피부가 나타나게 된다.

이러한 피부장벽 기능 이상은 경피수분소실도(TEWL)의 증가 및 수분도의 소실로 측정할 수 있으며, 이는 여러 가지 피부장벽의 기능 중 가장 중요한 수분 유지의 기능이 손상되었다고 볼 수 있다. 대표적인 질환으로는 아토피 피부염, 건선, 어린선, 그 외의 다양한 습진성 질환과 노화피부가 있다.

이를 해결하기 위하여, 한국등록특허공보 제10-1584742호는 피부노화요인을 복합적으로 개선하며 동시에 피부 보습에 효과적인 피부노화개선용 화장료 조성물에 관한 기술을 공지한 바 있으나, 주지한 바와 같이 노화된 피부에 초점을 둔 피부노화개선용 화장료로써 피부장벽 기능을 강화하는 데는 한계가 있다.

또한, 한국등록특허공보 제10-1780111호는 회향 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 조성물에 관한 기술을 공지한 바 있으나, 피부장벽 보호 및 기능 강화와 피부 보습에 초점을 둔 화장료로써, 항산화 및 항노화 관련된 성분과 그에 따른 효과가 없으므로 이미 노화된 피부에는 한계가 있다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 화학물질에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 재료를 사용한 화장품이 많이 개발되고 있으며, 천연 재료를 사용하는 경우, 피부에 부작용이 적어 화장품 원료로서 개발가치가 높아지고 있다.

따라서 부작용이 적은 천연재료를 화장품 원료로 사용한, 피부장벽 기능을 강화하며 항산화 및 항노화에도 효과적인 피부장벽 강화용 화장료의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1584742호 (2016.01.06.) 대한민국 등록특허 제10-1780111호 (2017.09.13.)

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃 복합추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부장벽 기능 강화 효과가 있는 고기능성 천연자원의 복합추출물을 이용하여 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항노화 및 항산화에 효과가 있는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 지닌 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른, 항노화 및 항산화 효과가 있는 화장료 조성물은 쐐기풀(Urtica thunbergiana), 피뿌리풀(Stellera chamaejasme), 및 바위돌꽃(Rhodiola sachalinensis) 복합추출물을 유효성분으로 포함한다.

이상에서 서술한 바와 같이, 본 발명에 따른 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물은 피부장벽 기능과 피부보습을 강화함으로써 피부장벽 손상에 의한 아토피피부염, 건선, 및 접촉성 피부염 등과 같은 만성피부질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃 복합추출물로 폴리페놀을 함유하여 항산화 효과를 가지므로 항노화에 도움이 되는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃 복합추출물로 세포내 지질 합성할 수 있으므로 피부장벽 기능 강화 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃 복합추출물로 세포 회복력이 있으므로 피부 개선 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃 복합추출물로 면역 활성 제어 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실험예에 따라 보습 효능을 평가하기 위한 세포 생존율 평가 결과와 Transglutaminase-1(보습물질 생성 바이오마커) RT-PCR 평가 결과이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실험예에 따라 보습 효능을 평가하기 위한 세포내 지질 합성 측정 결과와 filaggrin(피부장벽 강화 바이오마커) RT-PCR 평가 결과이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실험예에 따른 세포 회복력 평가 결과이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실험예에 따라 면역 활성을 평가하기 위한 iNOS와 COX-2(염증 관련 바이오마커) RT-PCR 평가 결과이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 실험예에 따른 HPLC 분석 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

바위돌꽃추출물(Rhodiola Rosea Extract)은 바위돌꽃(Rhodiola rosea)의 전초에서 추출한 것으로 바위돌꽃은 약 200여종이 있으며, 그 중 바위돌꽃종(Rhodiola sachlinensis A. Bor.)은 고산지역에 주로 자생하는 돌나무과(Crassulaceae), 돌꽃(Rhodiola) 속에 속하는 다년생 초본식물로서 고산지역에 주로 자생하며, 진정제, 해열제, 수렴제 및 고산병 치료를 위한 생약재로 민간에서 널리 이용되어 왔다.

바위돌꽃의 대표적인 생리활성 성분으로는 대부분의 돌꽃속식물에 함유되어 있는 살리드로사이드(salidroside)와 이의 비배당체인 p-티로졸(tyrosol) 등이 있으며, 산소 결핍증을 개선시키고 항피로와 노화억제 효능이 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 또한 바위돌꽃은 다양한 플라보노이드 성분을 포함한 페놀성 화합물을 함유함에 따라 지방과 DNA 산화를 억제하고, 강한 항산화 활성을 나타낸다.

바위돌꽃 종에는 아르기닌(arginine)과 같은 필수 아미노산과, 리놀렌산(linolenic acid)와 같은 불포화지방산과, 칼슘, 칼륨, 마그네슘같은 무기성분 등이 비교적 다량 함유되어있다.

본 발명에서 바위돌꽃추출물은 피부 유연화제, 피부 보호제 등 일반적인 효과를 넘어 항산화 효과와 세포 재생 효과, 항노화 효과를 갖는다.

쐐기풀추출물(Urtica Dioica Extract)은 쐐기풀(Urtica dioica)의 전초에서 추출한 것으로 쐐기풀(Urtica laetevirens Maxim.)은 높이 0.5 내지 1.5m의 여러해살이풀이며, 줄기는 네모나고 너비 2.5내지 5cm의 달걀 모양 잎이 마주 붙으며 줄기와 잎에 쐐기털이 있다.

쐐기털의 성분으로는 약간의 개미산, 초산, 버터산으로 이루어진 자극성의 산성 물질이 포함되어있으며, 잎에는 비타민 K(잎 1그램에 400단위), 배당체인 우르티신, 탄닌질, 개미산,아스코르부산(0.1~0.6%), 비타민 B2, 판토텐산, 프로토포르피린(C34H34O4N4), 코포로포르피린(C36H38O8N4), 시토스테롤, 히스타민(C5H9N3), 레시틴 등이 함유되어 있고, 카로티노이드인 카로틴(C40H56), 크산토필(C40H56O2), 크산토필에폭시드(C40H56O3), 비올라크산틴(C40H58O4)와 엽록소 등이 함유되어있다.

쐐기풀추출물은 피의 응고성을 높이고 헤모글로빈의 함량과 적혈구 수를 늘리며 자궁평활근의 긴장도를 높이며, 핏줄 수축작용이 있는 것으로 알려져 있으며 또한, 쐐기풀추출물에 함유된 클로로필은 기초대사를 항진시키고 장과 심장, 핏줄 계통, 자궁의 긴장도를 높이며, 상처조직의 재생과 상피화 속도가 빠르게 나타난다.

본 발명에서 쐐기풀추출물은 항염증 효과, 피부 진정효과 및 수렴작용, 두피 및 피부의 혈액순환 촉진 효과를 갖는다.

피뿌리풀추출물(Stellera Chamaejasme Extract)은 피뿌리풀(Stellera ChamaejasmeL.)의 전초에서 추출한 것으로 높이는 15 내지 40cm의 여러해살이풀이이며, 줄기는 뿌리에서 여러 대가 모여 나고 잎은 피침형으로 촘촘히 어긋나게 달리며 뿌리는 딱딱하고 굵은 뿌리가 깊게 들어있다.

피뿌리풀추출물은 대식세포의 염증반응 억제, 각질세포의 세포이동 촉진, 섬유아세포의 콜라겐 합성 증진 효과가 있으며, 상처 치유제 원료인 병풀추출물보다 빠른 속도로 상처 면적을 감소시키는 효과가 있다.

본 발명에서 피뿌리풀추출물은 항염증 효과, 각질 세포의 세포 이동 촉진 효과를 갖는다.

상기 화장료 조성물은 천연 유래의 추출물을 유효성분으로 포함하여 피부장벽 기능 강화 및 피부 보습 효과가 있을 뿐만 아니라 항노화 및 항산화에도 효과가 있음을 확인하였다.

상기 "유효 성분으로 포함하는"은 화장료 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부장벽 기능 강화를 통한 항노화 관련된 보습 물질 생성, 또는 피부 회복력, 피부 자극 완화, 피부 진정 효과 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "피부장벽"이란 피부 가장 바깥층인 표피의 상부층으로 각질형성세포로 이루어진 각질층을 의미한다. 또한 피부장벽은 독성물질이나 미생물, 기계적 자극, 자외선에 대해 가장 중요한 일차방어선이며, 피부를 통한 전해질이나 수분손실을 억제하여 피부가 정상적인 기능을 수행할 수 있는 환경을 제공하는 기능을 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "피부장벽 기능 강화"란 피부의 가장 외각에 위치하는 각질층의 장벽 기능을 강화하는 것으로, 피부장벽 펩타이드인 필라그린(filaggrin)의 발현을 증가시킴으로써 피부장벽의 기능을 강화하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "보습 효과'"란 피부의 수분이 감소되는 것을 저해 또는 억제하거나 피부의 수분 함유량을 증가시켜 피부 표면을 매끄럽게 하며, 윤기를 부여하는 것을 의미한다.

바람직하게, 상기 보습 효과는 각질층의 형성에 중요한 역할을 하는 단백질인 필라그린(filaggrin)과 관련되며, 상기 필라그린의 발현 양의 감소는 피부장벽의 기능과 피부 보습에 변화를 가져오게 되며, 피부 보습과 관련된 상기 필라그린의 발현을 촉진시키는 경우 피부 보습 효과를 현저하게 증진시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따른, 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물 제조 방법은 복합추출물 추출단계, 원심분리단계, 여과단계를 포함한다.

먼저, 상기 복합추출물 추출단계는 천연물질인 상기 쐐기풀, 상기 피뿌리풀, 상기 바위돌꽃을 재료로 하며, 총 원물대비 20배수의 정제수를 이용하여 95℃에서 4시간 동안 환류 추출하는 것이 바람직하다.

상기 "추출물"은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분으로 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질이라면, 추출 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함할 수 있다.

예컨대, 물이나 유기용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출한 것, 천연물의 특정 성분뿐만 아니라 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃의 복합추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃의 복합추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

또한, 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃의 복합추출물을 추출하는 방법은 환류 추출법에 의해 추출하는 것이 바람직하며, 건조 후 분말화하거나, 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 에탄올 추출 등 종래에 알려진 다양한 추출 방법에 의해 수득할 수 있다.

다음으로, 상기 추출단계를 거친 상기 복합추출물은 공지된 원심분리기를 이용하여 1,500rpm으로 원심분리시켜 불순물을 제거한다.

상기 복합추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는 원심분리단계 후 5 내지 30분 동안 방치함으로써 불순물을 침전시켜 제거하며, 불순물이 제거된 후 여과단계를 진행한다.

다음으로, 여과 단계는 여과지를 이용하여 여과시키는 것이 적절하며, 상기 여과지는 1um의 유화 입자크기의 여과지가 바람직하다.

상기 제조방법에 의하여 불순물이 제거된 상기 쐐기풀, 상기 피뿌리풀, 상기 바위돌꽃 복합추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃의 복합추출물 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는 인체 세정용 화장품이 바람직하며, 그 예로 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클렌저, 세안제, 비누 등이 있으며, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류도 가능하다.

본 발명의 상기 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는, 인체 세정용 화장품인 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클렌저, 세안제, 비누의 제형이 바람직하며, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 샴푸, 바디로션, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 본 발명을 후술하는 실시예를 참조하여 설명하는 바, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아님이 자명하다.

제조예 - 복합추출물의 제조

쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃의 비율을 달리하여 추출한 복합추출물을 총 원물대비 20배수의 정제수를 이용하여 95℃에서 4시간 환류 추출을 실시하였다. 상기 복합추출물들은 추출 후 1,500rpm으로 원심분리를 실시하였으며, 원심분리 후 1um의 유화 입자크기의 여과지를 이용하여 여과되었다.

상기 복합추출물들은 120℃에서 1시간 이상 가열되었으며, 손실된 수분량을 기준으로 수분측정기를 이용하여 고형분 함량(추출수율)을 평가한 결과를 표 1에 나타내었다.

후보소재	쐐기풀	피뿌리풀	바위돌꽃	고형분(%)
Sample 1	3	1	1	1.67
Sample 2	2	1	1	1.62
Sample 3	3	1	2	1.58
Sample 4	1	3	1	1.60
Sample 5	1	2	1	1.62
Sample 6	2	3	1	1.59
Sample 7	1	2	2	1.53
Sample 8	1	1	2	1.57
Sample 9	1	2	3	1.53
Sample 10	3	2	1	1.63

실험예 1 - 폴리페놀 함량 분석

본 실험예 1은 상기 복합추출물에서 수득한 고형분의 폴리페놀의 함량을 측정하기 위해 Folin-Ciocalteu Method에 따라 후보소재의 비색정량을 실시하였다.

상기 복합추출물에서 수득한 고형분의 시료용액 100㎕에 Folin 시약(Folin-Ciocalteu reagent) 100㎕을 혼합한 후 2% Na2CO3 용액 2ml를 첨가하여 실온에서 20분간 암소에서 방치한 후 720nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

총 폴리페놀 함량은 갈산(Gallic Acid) 당량으로 나타내었으며, 미리 작성한 갈산의 표준곡선을 이용하여 별도의 농축과정을 거치지 않은 추출물에 포함된 폴리페놀을 정량하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

Total Phenolic Compound Content(ppm)
Sample 1	421.21 ± 1.93	Sample 6	408.08 ± 4.60
Sample 2	386.06 ± 3.33	Sample 7	451.11 ± 1.12
Sample 3	405.25 ± 3.48	Sample 8	401.92 ± 17.11
Sample 4	418.08 ± 10.19	Sample 9	475.35 ± 1.03
Sample 5	473.94 ± 3.16	Sample 10	428.69 ± 4.24

상기 표 2에 도시된 바와 같이 폴리페놀 함량은 Sample 5, Sample 7, Sample 9가 많으므로, 항산화 효과가 우수한 시료는 Sample 5, Sample 7, Sample 9로 확인되었다. 폴리페놀은 항산화 효과가 있는 항산화제이기 때문에 복합추출물의 총 폴리페놀 함량이 많을수록 항산화 효과가 뛰어난 것으로 평가할 수 있다.

실험예 2 - DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실험예 2는 상기 복합추출물에서 수득한 고형분의 항산화 효과를 측정하기 위해 비타민C(ascorbic acid)를 대조군으로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 프리라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정하는 방법이며, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 517nm 파장에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

사용한 시약으로서는 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 에탄올에 용해하여 0.04mM/ml의 농도가 되도록 제조한 DPPH 용액 100㎕로 한다.

DPPH 용액 100㎕에 각각의 시료용액 100㎕을 가하여 균일하게 혼합되도록 교반한 후 실온암소에서 20분간 방치시켰으며, 방치시킨 후 517nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 결과는 비타민C를 대조군으로 하여 수학식 1에 의하여 산출하여 표 3에 나타내었다.

수학식 1

자유라디칼 소거율(%)=[1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 517nm 파장에서의 흡광도

So : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 517nm 파장에서의 흡광도

Bt : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 517nm 파장에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 517nm 파장에서의 흡광도

DPPH 소거능(%)
Sample 1	30.68	Sample 6	33.63
Sample 2	44.54	Sample 7	48.67
Sample 3	45.43	Sample 8	45.72
Sample 4	42.48	Sample 9	50.74
Sample 5	46.90	Sample 10	35.10

자유라디칼 소거율이 높을수록 항산화 효과가 뛰어난 것으로 평가할 수 있으며, 상기 표 3에 도시된 바와 같이 Sample 5, Sample 7, Sample 9가 0.004mM 농도에서 자유라디칼 소거율이 우수한 것이 확인되었다.

실시예 및 비교예

상기 복합추출물에서 수득한 고형분의 피부 개선 효과를 보다 세부적으로 검증하고자, 상기 표 4에 도시된 바와 같이 폴리페놀 함량이 높으며, 자유라디칼 소거율이 우수한 시료인 Sample 5, Sample 7, Sample 9를 실시예 및 비교예로 선정하였다.

후보 소재	소재 제조비율			효능평가		비고
	쐐기풀	피뿌리풀	바위돌꽃	DPPH소거능(%)	폴리페놀함량(ppm)
Sample 1	3	1	1	30.68	421.21
Sample 2	2	1	1	44.54	386.06
Sample 3	3	1	2	45.43	405.25
Sample 4	1	3	1	42.48	418.08
Sample 5	1	2	1	46.90	473.94	비교예 1
Sample 6	2	3	1	33.63	408.08
Sample 7	1	2	2	48.67	451.11	비교예 2
Sample 8	1	1	2	45.72	401.92
Sample 9	1	2	3	50.74	475.35	실시예 1
Sample 10	3	2	1	35.10	428.69

실험예 3 - 세포생존율 평가(보습 효과 평가)

본 실험예 3은 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 세포생존율 및 세포독성을 평가하기 위해 WST assay kit를 이용하여 실험을 수행하였다.

상기 실험예 3에 사용된 세포는 각질형성세포(Human keratinocyte)인 피부각질세포주(HaCaT Cell line)를 사용하며, 세포주는 CLS Cell Lines Service(DKFZ, Heidelberg)에서 분양받았으며, 배지는 페니실린(Penicillin) 용액 100units/mL, 스트렙토마이신(streptomycin) 용액 100ig/mL과 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Midium, WELGENE) 배지를 사용하였다.

각질형성세포를 24-웰 플레이트에 3×10⁴cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 DMEM 배지에서 배양하였으며, 최종농도를 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml로 하여 혈청이 10% 함유되어 있는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 세포 생존율을 비교하기 위하여 WST 시약을 각 웰(well)에 첨가하여 반응시켰으며, ELISA reader(Wallac 1420, USA)를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

측정값은 대조군의 흡광도 값과 비교하여 상대적인 세포 생존율을 계산하였으며, 실험의 정확도를 위하여 3반복을 원칙으로 동일한 실험을 3회 반복하여 수학식 2를 계산식으로 하였으며, 결과는 도 1과 표 5에 나타내었다.

수학식 2

세포생존율(%)=(시료첨가군 흡광도 at 450nm)/(시료무첨가군 흡광도 at 450nm)]×100

	Control	비교예 1			실시예 1			비교예 2
		0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4
1	100	99.5	96.6	96.0	106.4	108.4	100.2	108.4	103.2	108.1
2	100	102.1	106.2	96.1	97.6	99.0	102.8	103.5	96.8	99.2
3	100	102.4	101.2	102.3	103.6	101.7	103.6	103.3	107.6	106.7
Average	100	101.33	101.33	98.13	102.53	103.03	102.20	105.07	102.53	104.67

상기 표 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료는 모든 농도에서 세포 독성이 확인되지 않음을 WST assay를 통해 확인하였으며, 상기 시료가 인체에 무해할 뿐만 아니라 인체 안전성이 있음을 확인하였다.

실험예 4 - 보습효과에 대한 복합 추출물의 영향 평가(보습 효과 평가)

본 실험예 4는 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 보습 효과를 평가하기 위해 보습물질 생성 바이오마커인 transglutaminase-1의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

총 RNA 추출에는 QIAGEN RNeasy Mini kit (QIAGEN GmbH, Germany)를 사용하였으며, cDNA 합성에는 Maxime RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 정량 실시간 PCR은 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 및 Chromo4 RT-PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하였으며, 상대적 유전자 발현은 Opticon Monitor 소프트웨어 프로그램에서 임계 방법을 사용하여 분석하여, transglutaminase-1의 PCR 결과를 도 1과 표 6에 나타내었다.

	Control	비교예 1			실시예 1			비교예 2
		0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4
1	1	0.9	1.7	2.5	1.2	2.9	3.2	1.3	2.9	3.5
2	1	0.8	1.3	2.7	1.5	2.1	3.7	1.5	3.0	3.2
3	1	1.0	1.5	3.1	1.4	2.4	3.0	1.2	2.5	4.1
Average	1	3.30	1.50	2.77	1.37	2.47	3.30	1.33	2.80	3.60

상기 표 6에 도시된 바와 같이, 비교예 1, 실시예 1, 비교예 2 모두 농도 의존적으로 효능이 증가함을 확인할 수 있으며, 실시예 1과 비교예 2가 가장 높은 효능을 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 5 - 세포내 지질 합성 측정(보습 효과 평가)

본 실험예 5는 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 지질 생성량을 평가하기 위Nile red staining kit(Abcam) & flow cytometry를 이용하여 지질 생성량을 측정하였다.

HaCaT Cell에 시료를 각각 처리하고 추가로 48시간 더 배양하였으며, 각 웰(well)에서 HaCaT Cell를 수거한 후, 1uM Nile red 용액으로 10 분간 염색하여 Flow Cytometer(Beckman Coulter FC500, Pasadena, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. Fluorescence intensity 결과는 CXP 2.0.을 이용하여 분석하였으며, 결과는 도 2와 표 7에 나타내었다.

	Control	비교예 1	실시예 1	비교예 2
1	8.8	12.3	25.5	15.1
2	7.21	6.2	28.0	16.9
3	11.56	8.5	33.0	24.0
Average	9.19	9.00	28.83	18.67

상기 표 7에 도시된 바와 같이, 실시예 1은 비교예 1, 비교예 2에 대비하여 지질 생성율이 가장 높은 것을 확인할 수 있다.

실험예 6 - 피부장벽 강화에 대한 복합 추출물의 영향 평가(보습 효과 평가)

본 실험예 6은 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 보습 효과를 평가하기 위해 피부 장벽 강화 바이오마커인 필라그린(Filaggrin)의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

총 RNA 추출에는 QIAGEN RNeasy Mini kit (QIAGEN GmbH, Germany)를 사용하였으며, cDNA 합성에는 Maxime RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 정량 실시간 PCR은 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 및 Chromo4 RT-PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하였으며, 상대적 유전자 발현은 Opticon Monitor 소프트웨어 프로그램에서 임계 방법을 사용하여 분석하여, 필라그린의 PCR 결과를 도 2와 표 8에 나타내었다.

	Control	비교예 1			실시예 1			비교예 2
		0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4
1	1	1.1	2.0	2.5	1.5	2.5	2.9	1.6	2.5	3.4
2	1	1.3	2.3	3.1	1.8	2.0	3.5	1.9	2.9	2.8
3	1	1.1	2.8	2.8	1.3	2.0	2.7	2.1	3.1	3.8
Average	1	1.17	2.37	2.80	1.53	2.17	3.03	1.87	2.83	3.33

상기 표 8에 도시된 바와 같이, 비교예 1, 실시예 1, 비교예 2 모두 농도 의존적으로 효능이 증가함을 확인할 수 있으며, 비교예 1에 비해 실시예 1과 비교예 2가 높은 효능을 나타내었다.

실험예 7 - 세포 회복력 평가

피부세포의 이동능은 진피에서 지속적으로 증식하여 표피로 이동하여 각피세포로 분화하기 위한 일반적인 생리활성이며, 본 실험예 7은 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 피부 회복력을 평가하기 위하여 피부세포 이동능을 측정하였다.

세포 회복력을 평가하기 위해 CytoSelect™ 24-Well Cell Migration assay (8μm, Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 사용하여 HaCaT Cell migration assay를 실시하였다.

serum-free 배지 내의 HaCaT Cell를 24-well microchemotaxis chamber의 top insert에 로딩한 후, 이동을 유도하기 위해 시료가 첨가된 배지를 화학유인물질(chemoattractant)로 bottom chamber에 첨가하였다. HaCaT Cell을 8-μm 공극의 폴리카보네이트 필터를 통하여 24시간 동안 이동시켰으며, Cell stain solution으로 염색시켜 막의 윗부분을 스크랩하여, 이동 또는 침윤하지 않은 세포를 면봉으로 제거하였다. 세포 이동의 정도는 FLUOstar Omega Plate Reader(BMG Labtech)를 이용하여 560nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 결과는 도 3과 표 9에 나타내었다.

	Control	비교예 1	실시예 1	비교예 2
1	100	125.3	178.3	155.7
2	100	98.7	167.0	159.6
3	100	125.7	194.9	154.6
Average	100.00	116.57	180.07	156.63

상기 표 9는 세포 회복력 평가 결과로 비교예 1, 2에 대비하여 실시예 1의 세포 이동력이 가장 높은 것을 확인할 수 있으며, 위상차 현미경을 통해서 세포 이동을 200배의 비율로 캡처한 도 3을 참조하면, 실시예 1은 비교예 1, 2에 대비하여 세포 이동이 활발하며 세포 회복력이 가장 좋은 것을 확인할 수 있다.

실험예 8 - 면역 활성 평가

본 실험예 8은 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 면역 활성을 평가하기 위해 염증 관련 바이오마커인 iNOS와 COX-2의 저해능을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

iNOS(inducible Nitric Oxide Synthase)는 유도성 나이트릭 옥사이드 생성 효소로 염증 관련 바이오마커이며, iNOS의 발현을 제어할 수 있는 경우, 생체 방어나 강력한 염증 매개물인 NO(Nitric Oxide)의 과잉 생산이 관여하는 질환인 암이나 염증성 질환, 세균 감염 등에 의한 엔도톡신 쇼크 등의 치료 및 예방에 유용하다.

COX-2는 염증 관련 바이오마커이며, 염증의 특징 중 하나는 염증의 매개체인 프로스타글란딘을 생성하는 COX(Cyclooxygenase) 경로에 의해 대사되는 아라키돈산(arachidonic acid)의 산소첨가반응의 증가이다. 따라서 염증 진행에 중요한 역할을 하는 COX-2의 발현을 억제하는 경우 염증을 감소시킬 수 있다.

총 RNA 추출에는 QIAGEN RNeasy Mini kit(QIAGEN GmbH, Germany)를 사용하였으며, cDNA 합성에는 Maxime RT PreMix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 정량 실시간 PCR은 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific, Inc.) 및 Chromo4 RT-PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하였으며, 상대적 유전자 발현은 Opticon Monitor 소프트웨어 프로그램에서 분석하여, 평가 결과는 도 4에 도시하였으며 iNOS의 PCR결과는 표 10에, COX-2의 PCR 결과는 표 11에 나타내었다.

	Control	TNF-A	비교예 1			실시예 1			비교예 2
			0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4
1	1	3.5	3.6	3.1	2.9	3.9	3.2	2.6	3.8	2.8	2.3
2	1	3.7	3.3	3.0	2.5	3.5	2.8	2.3	3.5	2.5	2.1
3	1	4.2	13.8	2.8	2.5	3.5	2.5	2.0	3.1	2.2	2.0
Average	1	3.80	6.90	2.97	2.63	3.63	2.83	2.30	3.47	2.50	2.13

상기 표 10은 염증 관련 바이오마커인 iNOS의 PCR 결과이며, 도 4에 도시된 바와 같이 비교예 1, 실시예 1, 비교예 2 모두 농도 의존적으로 iNOS의 발현을 저해시킴을 확인할 수 있었다.

	Control	TNF-A	비교예 1			실시예 1			비교예 2
			0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4	0.1	0.2	0.4
1	1	2.8	2.7	2.5	1.9	2.9	2.5	1.5	2.9	2.3	1.9
2	1	2.7	2.5	2.1	1.8	2.8	2.1	1.9	2.8	2.5	2.3
3	1	2.5	2.3	2.0	1.5	2.6	2.3	1.8	2.5	2.1	1.7
Average	1	2.67	2.50	2.20	1.73	2.77	2.30	1.73	2.73	2.30	1.97

상기 표 11은 염증 관련 바이오마커인 COX-2의 PCR 결과이며, 도 4에 도시된 바와 같이 비교예 1, 실시예 1, 비교예 2 모두 농도 의존적으로 COX-2의 활성을 저해시킴을 확인할 수 있었다.

따라서, 비교예 1, 실시예 1, 비교예 2 시료 모두 COX-2와 iNOS의 활성을 저해시켜 염증을 억제시키는 면역성이 있는 것을 확인하였다.

실험예 9 - 지표 물질 분석

본 실험예 9는 실시예 1, 및 비교예 1, 2 시료의 지표물질을 분석하기 위해 HPLC를 이용하여 정량분석을 하였다. 분석 시작 시 높은 극성도로 인해 C18 칼럼(Column)상에 비극성 물질을 흡착시킨 후 용리 용매 조건으로 분리능을 높였다.

칼럼은 ‘Shiseido CAPCELL PAK UG’ C18(4.6mm x 150mm)이고, 검출기는 UV 검출기(254nm)를 사용하였고, 유속은 1.0ml/min, 칼럼온도는 Room temp, 주입부피는 10μL, 용매는 A: 0.1% formic acid in Distilled water, B: 0.1% formic acid in Acetonitrile로 A:B를 95:5로 사용하였다.

이동상 조성이 분석시간 동안 시간의 흐름에 따라 변하는 것을 이용하여 표 12에 도시된 HPLC 기기 분석 조건으로 분석을 실시하였으며, HPLC 분석 결과는 도 5에 나타내었다.

Column	Shiseido CAPCELL PAK UG
Column size	4.6mm ×150mm
Column temp.	Room temp.
Detector	UV Dector(254nm)
Flow rate	1.0ml/min
Eluent	Time(min)	A : D.W(0.1% FA)	B : ACN(0.1% FA)
	int	95	5
	30	50	4
	0.1% formic acid
Injection vol.	10μL

표준용액의 HPLC 분석 결과 도 5에 도시된 바와 같이, 5.767분, 11.437분, 15.057분, 16.723분, 25.000분의 머무름 시간(Retention time)이 유의한 결과를 보여 지표물질로 고려할 수 있을 것으로 판단하여 후보물질로 선정하였다.

상기 후보물질을 상기 HPLC 분석 조건으로 분석을 실시한 결과, 11.437분의 머무름 시간이 클로로겐산으로 분석되었으며, 25.000분의 머무름 시간이 케르세틴으로 분석되었다.

상기 클로로겐산(Chlorogenic acid)은 주지된 바와 같이, 카페익산과 퀸산의 에스테르로, 커피콩 및 커피콩으로 만든 식품에서 추출되는 대표적인 페놀화합물로서, 강력한 항산화제로 알려져 있으며 항염제, 진통제 및 해열제로서의 그 기능이 보고된 물질이다.

상기 케르세틴(Quercetin)은 주지된 바와 같이, 식물유래 플라보노이드계(flavonoid)계의 페놀화합물로서, 강력한 항산화제일 뿐만 아니라 항동맥경화, 항균작용, 콜레스테롤 저하, 항암, 항바이러스 및 항알러지 활성을 지니고 있으며, 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 보고되어 상기 케르세틴이 많이 함유되어있는 식품을 섭취하면 혈액순환 개선, 혈압 강하와 당뇨, 체중감소, 면역기능 강화, DNA 손상억제효과 및 적혈구 막의 지질과산화 저해효과 등에 효과가 있다.

상기 결과를 통해 쐐기풀, 피뿌리풀, 홍경천 복합추출물은 피부장벽 기능을 강화시킬 뿐만 아니라 항노화 및 항산화 효과가 있다는 것을 확인하였다.

이상과 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (5)

1. 항노화 및 항산화 효과가 있는 화장료 조성물에 있어서,
   쐐기풀(Urtica thunbergiana), 피뿌리풀(Stellera chamaejasme), 및 바위돌꽃(Rhodiola sachalinensis) 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 복합추출물은 쐐기풀, 피뿌리풀, 바위돌꽃이 1:2:3의 중량비로 혼합되어 추출되어진 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 복합추출물은 환류 추출 방법으로 추출되어 얻어진 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 복합추출물은 항산화 및 항노화 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물.
5. 항노화 및 항산화 효과가 있는 화장료 제조방법에 있어서,
   쐐기풀, 피뿌리풀, 홍경천을 복합추출물로 정제수를 투입하여 추출하는 추출단계;
   상기 추출단계 후, 상기 복합추출물을 원심분리시키는 원심분리단계; 및,
   불순물을 제거하기 위해 여과지를 이용하여 여과시키는 여과단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 제조방법.

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