KR102433271B1

KR102433271B1 - 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102433271B1
Application number: KR1020210182905A
Authority: KR
Inventors: 윤은정; 박시준; 김정수; 김현민; 조진성
Original assignee: 주식회사 에이바이오머티리얼즈
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-08-18

Abstract

본 발명은 티트리, 하수오 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초임계 유체 처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 티트리, 하수오의 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하여 세포재생효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetics composition comprising extracellular vesicles from Tea Tree, Polygonum multiflorum}

본 발명은 티트리, 하수오 유래의 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초임계 유체 처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 티트리, 하수오의 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하여 세포재생효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

대부분의 식물, 동물세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포내 기원의 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 분비할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 세포외 소낭은 식물내, 혈액, 타액 및 세포배양액을 포함하는 모든 생물학적 유체(biological fluids)에서 발견된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부환경과 정보교환을 하며 이를 위해 세포외 소포체를 분비한다.

세포외 소포체 중의 한 종류인 "엑소좀(Exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막구조의 작은 소낭이며, 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.

최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 이의 항산화, 항염 등의 피부 효능에 대해서도 연구가 시작되고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노 입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.

기존의 엑소좀은 인체 유래와 같은 동물 유래 엑소좀으로 주로 바이오 마커로 사용되어 왔고, 엑소좀 자체의 효능을 이용하여 엑소좀을 특정 용도로 사용하는 기술은 아직 개발이 미흡한 실정이다. 특히, 식물 세포에서 유래된 엑소좀 유사의 막 구조 소낭체의 특정 용도에 대해서는 알려진 바가 거의 없고, 티트리의 경우 티트리 유래 추출물이나 단일 성분의 여드름 증상 개선 효능은 보고된 바 있으나 복합 생리 활성 물질인 티트리 유래 엑소좀 유사의 세포외 소포체의 항노화, 항염 효능에 관해서는 보고된 바가 없다.

종래, 엑소좀을 분리하는 방법에는 초원심분리, 밀도 구배 초원심분리, 접선흐름여과(TFF), 폴리머 침전법 등이 있다. 초원심분리 방법은 매우 고가의 장비를 사용하여야 하고, 분리 시간이 긴 단점이 있으며, 밀도 구배 초원심분리 방법은 낮은 효율과 엑소좀이 응집하는 문제가 있다. 접선흐름여과(TFF) 방법 역시 장비 셋업이 복잡하며 대량화가 어려운 단점이 있다.

본 발명자들은 이러한 단점을 극복하기 위해 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 초임계 유체 처리와 글리콜류/Dextran을 사용하는 수성 2상분배법에 의하여 제조하였으며, 이 경우 세포외 소포체의 피부 흡수가 촉진되어 항노화, 항염 및 피부자극완화 효과가 우수하다는 효과 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-2125567호 (2020.06.16) (0002) 대한민국 등록특허 제10-2265811호 (2021.06.16.) (0003) 대한민국 등록특허 제10-2139778호 (2020.07.24.)

본 발명은 초임계 유체 처리와 수성 2상계에 의하여 특정 성분이 강화되어, 우수한 항노화, 항염 및 피부자극완화 효과를 나타내는 티트리, 하수오 세포외 소포체 함유 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 티트리 세포외 소포체, 하수오 세포외 소포체 또는 그 혼합 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합 세포외 소포체는 티트리 세포외 소포체 및 하수오 세포외 소포체가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되는 것임을 특징으로 한다.

유효성분으로서의 상기 티트리 세포외 소포체 또는 하수오 세포외 소포체는,

(A)건조된 티트리 잎 또는 하수오를 분쇄하는 단계;

(B)상기 분쇄된 티트리 잎 또는 하수오를 30℃ ~ 45℃ 및 100 atm ~ 200 atm의 압력에서 이산화탄소 및 용매로 초임계 유체 처리하는 단계;

(C)초임계 유체 처리된 티트리 잎 또는 하수오를 착즙하는 단계;

(D)착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

(E)상기 상층액에 글리콜류/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및

(F)세포외 소포체가 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 한다.

상기 티트리 소포외 소포체, 하수오 세포외 소포체 또는 그 혼합 세포외 소포체는 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 50중량% 함유되는 것임을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 피부 재생용, 주름개선용, 피부자극완화용 또는 피부염증완화용인 것을 특징으로 한다.

초임계 유체 처리 후 글리콜류/Dextran을 사용하는 수성 2상계에 의해 정제되는 본 발명의 티트리, 하수오 세포외 소포체는 안정성이 우수하여 그 활성이 장기간 유지되며 피부주름 개선 및 피부 염증개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 티트리 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 하수오 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있으며, 티트리의 경우 티트리 유래 추출물이나 단일 성분의 여드름 증상 개선 효능은 보고된 바 있으나 복합 생리 활성 물질인 티트리 유래 엑소좀 유사의 세포외 소포체의 항노화, 미백 및 항산화 효능에 관해서는 보고된 바가 없다. 본 발명은 피부개선활성이 알려진 티트리로부터 우수한 효능의 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.

티트리(Melaleuca Alternifolia, Tea Tree)는 쌍떡잎식물 도금양목 도금양과의 허브의 한 종류이다. 티트리는 오래 전부터 약용 식물로 사용되어 왔다. 티트리의 유효성분으로서 티트리 오일이 알려져 있으며, 이들 성분은 피부창상의 치료제, 항균성과 항진균성 등의 효능이 있는 것으로 입증되었다. 본 발명에서 세포외 소포체의 제조에는 바람직하게는 티트리 잎이 사용된다.

하수오(Polygonum multiflorum)는 여러해살이 덩굴식물로 뿌리는 옆으로 길게 뻗으며 둥근 덩이뿌리가 생긴다. 하수오는 종기, 불면증 등 간과 신장을 보호하고 머리를 검게한다. 하수오라는 이름은 중국 하씨(何氏) 성을 가진 사람이 하수오를 먹고 머리카락이 검어지면서 건강해졌다고 하여 하수오라고 전해진다. 동의보감속 하수오는 혈(血)을 보충하고 뼈를 튼튼하게 해주며 머리카락을 검게해주고 오래 먹으면 늙지 않는다라고 기록되어 있으며 중국에서는 인삼, 구기자와 더불어 3대 명약으로 알려져 있다. 하수오에는 각종 아미노산과 항산화물질인 레시틴(lecithin), 에모딘(rhein emodin), 크리소페놀(Chrysophanol), 하이퍼림(hyporim)과 같은 기능성 성분이 다량 함유되어 있다. 본 발명에서 세포외 소포체의 제조에는 하수오의 뿌리가 사용된다.

본 발명에 따르면, 티트리 세포외 소포체, 하수오 세포외 소포체 또는 그 혼합 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합 세포외 소포체는 티트리 세포외 소포체 및 하수오 세포외 소포체가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되는 것이며, 더욱 바람직하게는 동일 중량비율로 혼합되는 것이다.

바람직하게는 상기 유효성분으로서의 티트리 세포외 소포체 또는 하수오 세포외 소포체는,

(A)건조된 티트리 잎 또는 하수오를 분쇄하는 단계;

본 발명에서는 전처리 공정으로서 초임계 유체 처리를 수행한다.

초임계 유체란 일정한 고온과 고압의 한계, 즉 임계점(supercritical point)을 넘어선 상태에 도달하여 액체인지 기체인지를 구분할 수 없는 시점의 유체를 가리킨다. 초임계 유체는 분자의 밀도 변화가 큰 것이 특징이다. 분자의 밀도는 액체에 가깝지만, 점성도는 낮아 기체에 가깝다. 또 확산이 빨라 열전도성이 높다. 이러한 성질로 인해, 초임계 유체를 용매로 사용하면 용질 주변의 용매 농도가 극히 높아지는 효과를 나타낸다. 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 분쇄된 티트리 잎 또는 하수오를 30℃ 내지 45℃ 온도 및 100atm 내지 200atm의 압력에서 이산화탄소 및 용매로 처리하는 초임계 유체 처리 단계를 거치게 된다.

이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 이때, 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다.

보조용매로는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 물이나, 에탄올/물을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 일 구체예에 따르면, 추출은 1 내지 8시간 동안 수행될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 추출 후 회수부 온도는 45℃ 내지 60℃ 일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 추출 시 냉매 온도는 5℃ 내지 7℃ 일 수 있다.

이어서, 초임계 유체 처리된 티트리 잎 또는 하수오를 착즙한다. 이때, 상기 초임계 유체 처리에 의하여 얻어진 추출액과 함께 착즙한다.

상기 (D) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 바람직하다.

세포외 소포체를 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueaus two phase partition method)을 사용하였다.

수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 글리콜류/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.

상기 (E) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 4중량% : 1중량% ~ 1중량% : 4중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 세포외 소포체의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

세포외 소포체의 순도를 높이기 위해, 상기 (F)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.

이와 같은 방법에 의하여 제조된 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체는 티트리 추출물과 하수오 추출물과 비교하여 우수한 피부 재생효과(시험예 3), 콜라겐 합성증진 효과(시험예 4), 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과(시험예 5), 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(시험예 6)를 나타내었다.

그러므로 상기 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체는 피부재생용, 주름개선용 또는 피부 자극 및 염증완화용 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 이때 유효성분으로서의 상기 티트리 세포외 소포체, 하수오 세포외 소포체 또는 그 혼합 세포외 소포체는 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 50중량% 함유될 수 있다.

상기의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스 등으로 제조될 수 있다.

한편, 상기의 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위 내에서 통상 화장품에 이용되는 성분, 예를 들면, 보습제, 산화방지제, 계면활성제, 알코올류, 증점제, 수성성분, 물, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 필요에 따라 당업자가 어려움 없이 적절히 선정하여 배합할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1: 티트리 세포외 소포체의 제조

티트리 잎 추출물의 제조

티트리 잎 건조물을 분쇄한 다음 200 매쉬 이하로 미분하였다.

초임계 유체 처리 후 착즙

분쇄한 티트리 잎을 35℃의 추출온도에서 120atm의 압력으로 이산화탄소와 물 용매를 이용하여 3시간 동안 초임계 유체 처리를 수행한 후, 티트리 잎과 반응액을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 착즙을 수행하였으며 수득한 티트리 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 티트리 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

세포외 소포체 정제를 위한 상층액 회수

티트리 착즙액은 세포외 소포체 정제를 위해 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.

수성 2상계 형성

원심분리한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG(Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 4 중량% 사용하고 Dextran(Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.

티트리 유래 세포외 소포체의 회수

상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 세포외 소포체를 회수하였다.

추가 세척 공정

순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 세포외 소포체가 농축된 하층액을 회수하였다.

실시예 2: 하수오 유래 세포외 소포체의 제조

하수오 뿌리를 상기 실시예와 동일하게 하여 하수오 세포외 소포체를 정제하였다.

실시예 3: 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체의 혼합 세포외 소포체 제조

상기 실시예 1, 2에서 제조한 티트리 세포외 소포체와 하수오 세포외 소포체를 1:1 비율로 혼합하여 제조하였다.

비교예 1: 티트리 추출물 제조

티트리 잎 건조물 20g을 정제수 400g에서 80℃로 3시간 중탕 가온하여 추출하였다. 추출이 완료된 후 여과하여 추출액 370g을 회수하였다.

비교예 2: 하수오 추출물 제조

하수오 뿌리 건조물 20g을 정제수 400g에서 80℃로 3시간 중탕 가온하여 추출하였다. 추출이 완료된 후 여과하여 추출액 340g을 회수하였다.

시험예 1: 티트리 유래 세포외 소포체의 특성 분석: TEM 분석

정제한 티트리 유래 세포외 소포체의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 티트리 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 130nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 2: 하수오 유래 세포외 소포체의 특성 분석: TEM 분석

정제한 하수오 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 2는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 하수오 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 133.6nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 3: 피부세포 재생

24 웰 플레이트에 HaCaT 각질 형성 세포(German Cancer Research Institute, Germany)를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)으로 접종하고 가습화된 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청 DMEM으로 교환 후 상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3, 비교예 1 및 2의 티트리, 하수오 유래 엑소좀 또는 추출물 농도를 달리하여 첨가한 후 1일간 배양하였다.

양성 대조군으로서 세포 재생 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/㎖)를 사용하였다(비교예 3). MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료명	비고	흡광도 (at 570nm)
실시예 1 (티트리 세포외 소포체)	1%	1.220
	5%	1.299
	10%	1.492
실시예 2 (하수오 세포외 소포체)	1%	1.180
	5%	1.258
	10%	1.322
실시예 3 (티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체)	1%	1.345
	5%	1.501
	10%	1.919
비교예 1 (티트리 추출물)	1%	0.800
	5%	0.895
	10%	0.927
비교예 2 (하수오 추출물)	1%	0.793
	5%	0.805
	10%	0.882
비교예 3	양성대조군(TGF-β)	1.520
비교예 4	음성대조군(0%)	0.825

시험결과 초임계 유체 처리한 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체가 티트리 또는 하수오 추출물보다 세포 재생효과가 현저히 높은 것을 확인할 수 있다. 그 중에서도 실시예 3의 혼합 세포외 소포체에서 더욱 우수한 세포 재생효과를 나타내었다.

시험예 4: 콜라겐 합성증진

인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1×10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음 시험예 1의 배양기에서 상기 실시예의 세포외 소포체와 비교예의 추출물을 여러 농도로 첨가하고 1일간 배양하였다. 양성 대조군으로서 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β(10ng/㎖)를 사용하였다.

배양 후 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 IC-펩타이드(PICP) 양을 측정하여 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료명	비고	콜라겐 생합성 증가율(%)
실시예 1 (티트리 세포외 소포체)	1%	11.2
	5%	19.8
	10%	22.7
실시예 2 (하수오 세포외 소포체)	1%	5.0
	5%	7.5
	10%	9.2
실시예 3 (티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체)	1%	19.2
	5%	29.8
	10%	31.2
비교예 1 (티트리 추출물)	1%	0
	5%	5.5
	10%	7.2
비교예 2 (하수오 추출물)	1%	0
	5%	3.5
	10%	8.4
비교예 3	양성대조군(TGF-β)	25.5
비교예 4	대조군	0

초임계 유체 처리 후 수성 2상계에 의하여 정제된 실시예의 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체의 콜라겐 생합성율은 비교예의 추출물들에 비하여 높았으며, 특히 실시예 3의 혼합 세포외 소포체에서는 각각 19.2, 29.8, 31.2%로 측정되어 더욱 우수한 효과를 나타내었다.

상기 시험예의 결과로부터 본 발명의 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체는 초임계 유체 처리에 의해 활성화되어 피부주름개선효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

시험예 5: 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 1000㎕의 PBS를 추가하였다. 이 섬유아세포에 자외선 B 램프를 이용하여 자외선 10mJ/cm²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 시험예 1의 배양기에서 상기 티트리, 하수오 세포외 소포체 및 추출물을 첨가하고 1일간 배양하였다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고, 각 웰당 세포 배양 배지 500㎕와 MTT 용액(2.5mg/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ 및 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후 마이크로 플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 비교 실험을 위해 양성 대조군으로 TGF-β를 사용하였다.

하기식에 의해 세포 생존율(%)과 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%)을 계산하였다.

(여기서, St는 시료를 처리한 웰의 흡광도를 나타내고, Bo는 세포 배양 배지의 흡광도를 나타내며, Bt는 시료를 처리하지 않은 웰의 흡광도를 나타낸다.)

(여기서, St는 자외선을 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포 생존율을 나타내고, Bo는 자외선을 조사하지 않고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포 생존율을 나타내며, Bt는 자외선을 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포 생존율을 나타낸다.)

세포 독성 완화율을 하기 표 3에 나타내었다.

시료명	비고	세포독성 완화율(%)
실시예 1 (티트리 세포외 소포체)	5%	63.4
실시예 3 (티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체)	5%	88.5
비교예 1 (티트리 추출물)	5%	42.7
비교예 3	TGF-β(양성 대조군)	75.1

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 상기 실시예의 티트리 유래 세포외 소포체와 티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체는 자외선에 의한 세포 독성을 완화시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

시험예 6: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제

사람의 표피 조직에서 분리한 각질 형성 세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질 형성 세포에 자외선 B 램프를 이용하여 자외선 10mJ/cm²를 조사한 다음 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(FBS가 첨가되지 않은 DMEM) 350㎕를 첨가하였다. 그리고 시험예 1의 배양기에서 상기 티트리 세포외 소포체 및 티트리 추출물을 첨가하고 1일간 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 염증성 사이토카인(1L-1α)을 정량함으로써 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. 염증성 사이토카인의 양은 초임계 면역 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 양성 대조군으로서 염증성 사이토카인 억제 물질로 알려진 케토프로펜(ketoprofen)을 사용하였다.

염증성 사이토카인의 발현 억제율(%)은 하기식에 의해 계산하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

(여기서, St는 자외선을 조사하고 시료를 처리한 웰의 염증성 사이토카인 생성량을 나타내고, Bo는 자외선을 조사하지 않고 시료를 처리하지 않은 웰의 염증성 사이토카인 생성량을 나타내며, Bt는 자외선을 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 염증성 사이토카인 생성량을 나타낸다.)

시료명	비고	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 1 (티트리 세포외 소포체)	5%	25.8
실시예 3 (티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체)	5%	41.2
비교예 1 (티트리 추출물)	5%	12.7
비교예 5	양성대조군(ketoprofen)	38.1

상기 표 4를 통하여 초임계 유체 처리 후 정제된 상기 실시예의 티트리 세포외 소포체와, 하수오 세포외 소포체와의 혼합 세포외 소포체는 자외선에 의한 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

제형 실시예 1: 크림의 제조

하기 표 5의 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다.

성 분	제형 실시예1	비교 제형예1(정제수)	비교 제형예2
티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체 (실시예 3)	2.0	-	-
아데노신	-	-	2.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0
세테아릴알콜	2.2	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6	0.6
경화식물유	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0	3.0
트리에타올아민	1.0	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
합 계	100	100	100

시험예 7: 피부 주름 개선 효과

30~ 50대의 성인 여성 80명을 대상으로 상기 제형 실시예에서 제조된 크림을 얼굴 양쪽 면에 바르고, 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

상기 티트리, 하수오 혼합 세포외 소포체를 함유하는 크림(제형실시예 1), 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 정제수로 대체한 크림(비교 제형예1), 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신을 함유하는 크림(비교 제형예2)을 사용하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 6에 나타내었다.

	주름개선효과
	우수	약간	없음
제형 실시예 1	13	6	1
비교제형예 1	0	1	19
비교제형예 2	14	4	2

상기 표 6의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 함유한 제형 실시예 1의 크림은 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 함유하지 않은 비교 제형예 1의 크림에 비하여 높은 주름개선 효과를 보여주었다. 또한, 티트리 유래 세포외 소포체 대신 아데노신을 함유하는 비교 제형예 2의 크림과 유사한 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다.

Claims

티트리 세포외 소포체와 하수오 세포외 소포체의 혼합 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 세포외 소포체는 티트리 세포외 소포체 및 하수오 세포외 소포체가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 티트리 세포외 소포체 또는 하수오 세포외 소포체는,
(A)건조된 티트리 잎 또는 하수오를 분쇄하는 단계;
(B)상기 분쇄된 티트리 잎 또는 하수오를 30℃ ~ 45℃ 및 100 atm ~ 200 atm의 압력에서 이산화탄소 및 용매로 초임계 유체 처리하는 단계;
(C)초임계 유체 처리된 티트리 잎 또는 하수오를 착즙하는 단계;
(D)착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
(E)상기 상층액에 글리콜류/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및
(F)세포외 소포체가 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 티트리 세포외 소포체와 하수오 세포외 소포체의 혼합 세포외 소포체는 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 50중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 재생용임을 특징으로 하는화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 자극 완화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 염증 완화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.