KR102646357B1 - 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellualr vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 등에 관한 것이다.. 본 발명의 세포외 소포체는 피부 주름 개선, 피부 보습, 피부 활력 증진 등의 효과를 나타내며, 원료 식물을 저온진공법으로 전처리하여 추출 효율을 증대시킴으로써 조성물에 고농도로 포함될 수 있으므로 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 저온진공법을 이용하여 추출 효율을 높인 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용, 피부 보습용 및/또는 피부 활력 증진용 조성물 등에 관한 것이다.
피부는 인체 내에서 외부 환경과 가장 밀접하게 접하고 있는 신체 기관으로 인체 내부를 보호하는 기능을 가지며, 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하지방(hypodermis)으로 이루어져 있다.
진피를 구성하는 주요 성분으로는 콜라겐과 엘라스틴이 있으며, 이들 성분은 피부를 탄력있게 만들어 준다. 콜라겐의 경우, I형 콜라겐이 80%, Ⅲ형 콜라겐이 15%를 차지한다. 그러나, 자연적인 피부 노화와 함께 자외선, 공해, 스트레스 등에 의해 생성된 활성 산소는 이러한 콜라겐 및 엘라스틴의 양을 감소시켜 피부에 주름을 생성시킨다.
또한, 인간의 피부에서, 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소하는 것으로 알려져 있고, 이는 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나라고 여겨지고 있다. 이러한 히알루론산의 합성은 HAS(Hyaluronic Acid Synthase)에 의해 진행된다. CAS14 유전자는 천연 보습 인자의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, HAS2 및 CAS14 유전자의 발현을 통해 원료의 보습 효능이 확인될 수 있다(비특허문헌 1).
또한, 피부 세포 내 미토콘드리아의 활성이 감소하면 피부의 생기 또는 활력이 감소하는 것으로 알려져 있다.
최근 세포 분비체(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비체 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 "엑소좀(exosome)" 등과 같은 세포외 소포체(extracellular vesicels, EVs)가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 특히, 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 인자들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 인자는 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화를 포함한 다양한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들을 포함하고 있다(비특허문헌 2).
엑소좀을 포함하는 세포외 소포체를 이용한 특정 질환의 치료 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있으나, 식물 추출물 유래 세포외 소포체에 대한 연구는 아직 미진한 상태이다.
Journal of Drugs in Dematology, 6, s20-4, 2007; Experimental Dermatology, 18(12), 1028-1035, 2009
Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포외 소포체의 피부 상태 개선 용도를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체의 제조 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 피부 상태 개선을 위한 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 또는 이를 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공된다.
탄닌 함유 식물(예컨대, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함함) 추출물 유래 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부의 상태를 개선하는 효과가 있다. 구체적으로, 본 발명의 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부 주름 개선 효과, 피부 보습 효과, 피부 활력 증진 효과 등을 나타내므로, 주름, 피부 탄력 감소 등의 피부 노화, 가려움 등의 피부 건조로 인한 증상을 예방하거나 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 피부에 생기를 주어 건강한 피부가 되게 할 수 있어서 피부 미용에도 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 탄닌 함유 식물을 저온진공으로 전처리한 경우 막 손상 없이 고순도 및 고농도의 엑소좀을 얻을 수 있으므로 상대적으로 적은 양의 처방으로도 최대의 효과를 이끌어낼 수 있고, 피부에 직접 적용(도포)되는 형태의 제제화에도 유리하며, 동일한 중량의 원료로부터 더 많은 양의 제품 제조가 가능하다는 상업적인 이점 또한 가진다.
도 1은 제조예 1 및 제조예 2의 방법에 따라 추출 및 정제한 탄닌 함유 식물 추출물 유래 엑소좀의 NTA(Nanoparticle Tracking Analysis) 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 제조예 1 및 제조예 2의 방법에 따라 추출 및 정제한 탄닌 함유 식물 추출물 유래 엑소좀의 제타 전위 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 탄닌 함유 식물 추출물 유래 엑소좀을 TEM(투과전자현미경)으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다(Scale bar: 200 nm).
도 4는 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀 처리 시의 세포 생존율 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포 및 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 엑소좀을 농도별로 투여 시 대조군 대비 생존율을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀의 주름 개선 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 엑소좀을 농도별로 투여하고 Real-time PCR을 통해 확인한 주름 개선 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 5a는 COL1A1를 코딩하는 유전자, 도 5b는 COL3A1를 코딩하는 유전자, 도 5c는 ELASTIN을 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀의 피부 보습 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 엑소좀을 농도별로 투여하고 Real-time PCR을 통해 확인한 피부 보습 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 6a는 HAS2를 코딩하는 유전자, 도 6b는 CAS14를 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 7은 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀의 피부 활력 증진 평가에 관한 도면이다.
도 2는 제조예 1 및 제조예 2의 방법에 따라 추출 및 정제한 탄닌 함유 식물 추출물 유래 엑소좀의 제타 전위 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 탄닌 함유 식물 추출물 유래 엑소좀을 TEM(투과전자현미경)으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다(Scale bar: 200 nm).
도 4는 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀 처리 시의 세포 생존율 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포 및 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 엑소좀을 농도별로 투여 시 대조군 대비 생존율을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀의 주름 개선 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 엑소좀을 농도별로 투여하고 Real-time PCR을 통해 확인한 주름 개선 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 5a는 COL1A1를 코딩하는 유전자, 도 5b는 COL3A1를 코딩하는 유전자, 도 5c는 ELASTIN을 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀의 피부 보습 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 엑소좀을 농도별로 투여하고 Real-time PCR을 통해 확인한 피부 보습 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 6a는 HAS2를 코딩하는 유전자, 도 6b는 CAS14를 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 7은 제조예 2의 방법으로 추출 및 정제한 엑소좀의 피부 활력 증진 평가에 관한 도면이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 발명을 설명하면서 제시된 용어는 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 통상적인 의미로 이해되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 조건, 조성, 양 등을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "탄닌 함유 식물"은 폴리페놀의 일종으로 아주 떫은 맛과 쓴맛을 주는 탄닌이 주성분인 식물을 지칭한다. 그 예로는 호장근(Reynoutria japonica root), 커피콩(Coffee bean), 감나무잎(Diospyros kaki leaf), 율피(Castanea crenata shell) 및 홍화(Carthamus tinctorius)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"탄닌" 성분은 현재까지 150개 이상이 존재한다고 알려져 있고, 대표적인 성분으로는 갈산(gallic acid), 플로로글루시놀(phloroglucinol), 플라반-3-올(flavan-3-ol)과 같은 화합물들이 복잡하게 결합한 폴리페놀을 들 수 있다. 탄닌은 거의 모든 식물의 잎과 나무껍질, 나뭇가지, 뿌리, 열매에 많이 있고, 미생물, 곤충 및 동물로부터 식물을 방어하는 역할을 하고, 수렴작용, 소염작용, 지혈작용, 지사작용을 가지고 있어 급성 및 만성 장염, 설사 등의 치료에 사용된다.
용어 "호장근"은 다년초인 호장(Polygonum cuspidatum), 왕호장(Polygonum sachalinense) 및 둥근잎호장(Polygonum ellipticum) 등 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 호장의 뿌리 및 근경을 말린 것으로, 근경은 옆으로 뻗으며 황갈색이다. 볕이 잘 드는 냇가나 산기슭에서 생육하는 다년생초본이다. 한국이 원산으로 국외로는 일본, 대만, 중국 등지에 분포한다.
용어 "커피콩"은 커피나무 열매의 씨로서, 커피나무 열매가 붉게 익으면 과육이 벌어지면서 푸른빛을 띤 생두가 나온다. 맛은 쓴맛, 신맛, 단맛, 떫은 맛 등 다양한데, 쓴맛은 카페인, 떫은 맛은 탄닌, 신맛은 지방산, 단맛은 당질에서 비롯된다. 커피는 자극제로서 신경계통에 작용해 정신의 활동력과 지각을 활발하게 만들어 사고를 한층 명료하게 하고, 육체적으로는 근육을 긴장시켜 노동력을 증진시키고, 이뇨작용을 도와줘 위장활동을 촉진시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
용어 "감나무잎"은 우리나라 중부 이남 지방에 주로 분포하는 감나무의 잎으로서, 주로 차로 이용되어 동의보감에 혈관질환의 예방, 치료와 함께 자반증(혈관염증)에도 효과가 있다고 기록되어 있다. 또한, 감나무잎에는 비타민 C, 아미노산, 핵산, 페놀성 화합물, 유리당 등 여러 물질들이 다양하게 함유되어 있어 우수한 항균성이 있고, 감기 및 성인병 예방의 약리작용 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.
용어 "율피"는 너도 밤나무과(Buna)의 다년생 초목인 밤나무(Castanea crenata)의 과실인 밤의 속껍질로 여러 기능성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 율피는 전체 밤 함량의 약 25%를 차지하고 있지만, 가공식품 제조시 폐기처리되는 일종의 산업 부산물이다. 따라서, 율피를 고부가가치 제품 개발을 위한 소재로 이용한다면 이에 따른 경제적 이점이 상당할 것이다.
용어 "홍화"는 잇꽃이라고도 하며, 예로부터 한의학에서 부인병, 통경, 복통에 사용되어 왔다.
용어 "저온진공(Low temperature vacuum)"은 추출 대상 내부에 존재하는 성분들이 대기압보다 낮은 진공 상태와 유사한 저온 환경에서 음의 압력을 통해 외부로 배출되는 것을 촉진하는 기술을 의미한다. 이 기술은 추출 대상 조직에 다공성을 부여함으로써 추출 시 용해도 및 수분 복원력을 극적으로 증가시킬 수 있다.
용어 "피부 상태 개선"은 피부 장벽의 모양 또는 기능 손상을 포함한 모든 피부적 상태를 개선하는 것을 의미하며, 예를 들어 피부 장벽 기능 강화, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 수분 유지 또는 수분 손실 방지, 피부 세포 재생, 피부 활력 증진, 피부의 항산화 작용 증진 또는 피부의 염증 개선 또는 치료 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체
본 발명의 일 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)가 제공된다.
상기 "세포외 소포체(extracellular vesicles)"는 세포 내에서 생성되어 외부로 방출되는 소포의 일종으로서, 기원과 분비 기작, 크기 등을 기준으로 엑소좀(exosomes), 미세소포체(microvesicles), 엑토좀(ectosomes), 미세입자(microparticles), 막 소포체(membrane vesicles), 나노소포체(nanovesicles), 외막 소포체(outer membrane vesicles) 등 다양한 명칭으로 불려 오고 있으나, 모두 세포 외부로 분비되는 소포체라는 공통점이 있으며, 따라서 이들을 모두 포괄하는 개념으로서 본 명세서에서는 용어 "세포외 소포체"가 사용된다. 상기 "세포외 소포체"는 또한 특정한 조건 및 제법에 의해 균일하게 만들어지는, 세포 내 물질을 포함하는 막 구조물도 포함하며, 엑소좀-유사 막 구조체(exosome-like membrane) 또는 엑소좀-유사 소포체(exosome-like vesicle) 등의 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. "엑소좀-유사 막 구조체" 또는 "엑소좀-유사 소포체"는 나노크기의 세포외 소포체를 의미하는 것으로서, 나노크기의 엑소좀을 포함할 뿐만 아니라 나노크기의 소포체 구조 및 그 조성물이 엑소좀과 유사한 소포체를 모두 포함하는 개념일 수 있다.
일 구현예에서, 추출물은 착즙 추출물일 수 있으나, 세포외 소포체를 수득하기 위한 것이라면 추출 방법에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 탄닌 함유 식물은 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 탄닌 함유 식물은 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화를 모두 포함할 수 있다. 그러나, 탄닌 함유 식물은 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것일 수 있다: (ⅰ) 탄닌 함유 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계; (ⅱ) 전처리된 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 추출물에서 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계. 여기서, 저온진공 전처리 단계 (ⅰ)은 식물로부터 추출물을 수득하기 전에, 구체적으로 식물의 착즙 및 여과를 진행하기 전에 수행될 수 있다. 추출물 수득 단계 (ⅱ)는 전처리된 탄닌 함유 식물을 착즙하는 단계를 포함할 수 있다. 분리 및 정제 단계 (ⅲ)은 추출물, 보다 구체적으로 착즙 추출물을 여과하는 단계, 상기 여과 단계에서 수득한 여과물에서 원심분리에 의해 액포를 포함하는 잔여물을 제거하는 단계, 선택적으로 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 단계, 및 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)에 의해 세포외 소포체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체는 다음 복수의 단계 전부 또는 일부를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것일 수 있다: 탄닌 함유 식물을 착즙하는 단계; (착즙) 추출물을 여과하는 단계; 원심분리에 의해 액포를 포함한 잔여물을 제거하는 단계; 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 단계; 및 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)에 의해 세포외 소포체를 수득하는 단계.
상기 착즙 단계는 다음 복수의 단계 전부 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다. 원료 식물인 탄닌 함유 식물을 (필요한 경우, 세척 후) 착즙기에 넣고 저속 회전하는 스크류를 사용하여 착즙하는 단계; 및 (착즙) 추출물을 미세 타공망에 통과시켜 식물 찌꺼기를 제거하는 단계.
상기 착즙 단계는 원료 식물인 탄닌 함유 식물을 (필요한 경우, 세척 후) 착즙기에 넣고 회전 속도가 20 내지 100 rpm인 스크류로 압착 및/또는 분쇄하여 착즙하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 스크류의 회전 속도는 20 내지 50 rpm 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 스크류의 회전 속도는 43 rpm 일 수 있다. 그러나, 상기 스크류의 회전 속도는 이에 제한되지 않는다.
상기 (착즙) 추출물을 미세 타공망에 통과시키는 단계에서, 상기 미세 타공망의 타공 크기는 원료 식물의 찌꺼기가 통과할 수 없는 크기로서, 착즙하려는 원료 식물의 종류에 따라 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 (착즙) 추출물을 여과하는 단계에서, 여과막 또는 필터가 사용될 수 있다. 구체적으로, 착즙 추출물은 평균 기공 사이즈가 0.22 μm 내지 5 μm인 여과막 또는 필터를 사용하여 여과할 수 있다. 예를 들어, 상기 (착즙) 추출물의 여과는 기공 사이즈가 0.22 ㎛, 0.45 ㎛, 0.65 ㎛, 0.8 ㎛, 1.5 ㎛, 3 ㎛ 또는 5 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 탄닌 함유 식물로부터 수득한 (착즙) 추출물은 평균 기공 사이즈가 0.45 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용하여 여과될 수 있다. 또한, 여과 단계는 여과막 또는 필터를 통과한 여과물을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 원심분리에 의해 액포를 포함한 잔여물을 제거하는 단계에서, 상기 원심분리는 저속 원심분리(low-speed centrifugation), 고속 원심분리(high-speed centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 저속 원심분리는 6,000 rpm (6,000 xg) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심분리에 이용되고, 고속 원심분리는 최고속도가 20,000 내지 25,000 rpm (60,000 xg) 정도이며, 초원심분리는 최고속도가 40,000 내지 80,000 rpm (600,000 xg) 정도인 원심분리법을 의미한다. 일 실시예에서, 상기 원심분리는 고속 원심분리일 수 있다.
상기 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 단계는 여과막 또는 필터를 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 평균 기공 사이즈가 0.025 μm 내지 5 μm인 여과막 또는 필터로 여과할 수 있다. 예를 들어, 상기 잔여물이 제거된 생성물의 재여과는 기공 사이즈가 0.025 ㎛, 0.1 ㎛, 0.22 ㎛, 0.45 ㎛, 0.65 ㎛, 0.8 ㎛, 1.5 ㎛, 3 ㎛ 또는 5 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용할 수 있으며, 상기 (착즙) 추출물을 여과하는 단계에서 사용된 여과막의 기공 사이즈보다 더 작은 사이즈의 기공을 갖는 여과막을 사용하는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 탄닌 함유 식물로부터 수득한 (착즙) 추출물은 평균 기공 사이즈가 0.45 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용하여 1차 여과하고, 원심분리에 의해 잔여물을 제거한 뒤, 이를 다시 기공 사이즈가 0.22 ㎛ 인 여과막 또는 필터를 사용하여 제균을 위한 여과를 수행할 수 있다. 또한, 재여과 단계는 여과막 또는 필터를 통과한 여과물을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
세포외 소포체는 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)법을 통해 수득한 식물 추출물로부터 분리, 정제 및/또는 탈염될 수 있으며, TFF법 외에도 공지된 다른 분리/정제 방법이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 세포외 소포체는 5.0 × 107 개 입자/mL 내지 3.0 × 1010 개 입자/mL의 농도로 존재할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외 소포체는 상술한 단계의 일부 또는 전부를 포함하는 방법에 의해 1 mL의 단위 부피당 약 약 5.0 × 107 개 입자 내지 약 3.0 × 1010 개 입자의 농도로 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 약 5.0 × 108개 입자 내지 약 2.0 × 109 개 입자 농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다. 상기 세포외 소포체의 농도는 목적하는 용도, 제형, 적용 대상, 적용 부위, 투여 경로 등에 따라 당업자에 의해 용이하게 변경/조절될 수 있으며, 이를 위해서는 고농도의 세포외 소포체를 얻는 것이 중요하다.
다른 구현예에서, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 220 nm일 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 140 nm 내지 215 nm일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 150 nm 내지 210 nm일 수 있다. 그러나, 상기 세포외 소포체의 평균 입자 크기는 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -15 mV 내지 약 -50 mV일 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -20 mV 내지 -40 mV일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -25 mV 내지 -35 mV일 수 있다. 그러나, 상기 세포외 소포체의 제타 전위는 이에 제한되지 않는다.
피부 상태 개선용 조성물
본 발명의 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 본 발명의 세포외 소포체를 처리한 경우, COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자의 발현이 크게 증가하였고, 이로써 피부 주름 개선 효능이 우수함을 확인하였다. 또한, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 본 발명의 세포외 소포체를 처리한 경우, HAS2 및 CAS14 유전자의 발현이 크게 증가하였고, 이로써 피부 보습 효능이 우수함을 확인하였다. 또한, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 UVB 50 mJ/cm2을 조사한 후 본 발명의 세포외 소포체를 처리한 경우, 미토콘드리아 활성이 증가하였고, 이로써 피부 활력 증진 효능이 있음을 확인하였다.
일 구현예에서, 피부 상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 피부 주름 개선용 조성물, 피부 보습용 조성물 및/또는 피부 활력 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 피부 주름 개선용 조성물은 주름, 피부 탄력 감소 등을 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 보습용 조성물은 가려움 등의 피부 건조로 인한 증상의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 활력 증진용 조성물은 피부에 생기를 주어 건강한 피부가 되게 할 수 있어서 피부 미용에 사용될 수 있다. 상술한 다양한 용도의 조성물은 후술하는 바와 같이 화장료 조성물, 약학 조성물/의약외품 조성물, 식품 조성물의 분야에 이용될 수 있다.
다른 구현예에서, 세포외 소포체 또는 이를 포함하는 조성물은 주름 개선 관련 관련 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 주름 개선 관련 관련 유전자에는 COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. COL1A1 및 COL3A1은 각각 I형 콜라겐 및 III형 콜라겐을 발현하고, ELASTIN은 엘라스틴을 발현한다. 콜라겐 및 엘라스틴은 모두 피부 탄력을 증진시켜 피부 주름을 방지할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체 또는 이를 포함하는 조성물은 피부 보습과 관련된 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 피부 보습과 관련된 유전자에는 HAS2 및 CAS14 중 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. HAS2는 히알루론산 합성효소를 발현하고, CAS14는 천연 보습 인자의 생성에 관여한다.
상기 "탄닌 함유 식물", "추출물", "세포외 소포체" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
화장료 조성물
본 발명의 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 조성물은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진 중 하나 이상을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 "탄닌 함유 식물", "추출물", "세포외 소포체" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인 세포외 소포체 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 이러한 성분에는 예컨대 (추가적) 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및/또는 담체가 포함된다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀전, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 에멀전 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센셜 오일, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 오일, 식물성 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 에멀전인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 에멀전화제가 사용되고, 그 예로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 구체적인 예로는 여성청결제, 손세정제, 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 유액, 화장수, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 비누, 보디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 양모료, 육모료, 헤어크림, 헤어리퀴드, 세트로션, 헤어 스프레이, 헤어브리지, 컬러린스, 컬러스프레이, 퍼머넌트웨이브액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 핸드 크림, 및 립스틱 등을 들 수 있다.
약학 조성물/의약외품 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질환 및/또는 이러한 질환으로 인한 유해 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.
용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.
일 구현예에서, 피부 질환은 아토피성 피부염, 습진, 건선, 소양증, 모공각화증, 두피건조증 및 피부이완증을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 "탄닌 함유 식물", "추출물", "세포외 소포체" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 동물에 적용되는 경우에 수의학적 조성물이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제는 당업계에 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화규소 등의 광물유 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 첨가제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 제제화를 위한 첨가제는 약제 분야에서 통상 사용하는 것 중에서 적합한 것을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형의 구체적인 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 주사용액, 경고제(Plasters), 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 에어로졸제, 엑스제(Extracts), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 침제, 크림제, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 패치제 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여된다. 용어 "약학적으로 유효한 양" 또는 "수의학적으로 유효한 양"은 의학적 또는 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자 또는 동물의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1일 0.001 내지 50 mg/kg 또는 0.01 내지 10 mg/kg일 수 있지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 또는 수의학적 조성물은 개별 치료제로 적용/투여하거나 다른 치료제와 병용하여 적용/투여될 수 있고 순차적 또는 동시에 적용/투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 적용/투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물이 제공된다.
용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병 또는 상태를 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 구체적으로, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 또는 상태의 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다. 의약외품 조성물의 예로는 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스, 스프레이, 팩제, 코팅제, 청결제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물을 의약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 증진 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 "탄닌 함유 식물", "추출물", "세포외 소포체" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
식품 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물이 제공된다. 이러한 식품 조성물은 의료용 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 식품 조성물을 포함한다.
용어 "의료용 식품" 또는 "뉴트라슈티컬 식품"은 인체에 유익한 기능을 할 가능성이 있는 원료 또는 성분으로 제조된 식품으로서, 정상적인 기능을 유지하거나 인체의 생리적 기능을 활성화함으로써 건강을 유지시키거나 개선시키는 식품을 지칭하고, 식품의약품안전처에 의해 규정되지만 이로 한정되지 않으며, 임의의 통상적인 건강 식품을 그 의미에서 배제하지 않는다.
상기 "탄닌 함유 식물", "추출물", "세포외 소포체" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
상기 식품에는 각종 식품류, 식품 첨가제, 음료(예를 들어, 기능성 음료, 천연 과일 주스 및 야채 음료), 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
상기 식품은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 의료용 식품, 뉴트라슈티컬 식품 또는 건강기능식품은 피부 상태를 개선시킬 목적으로 상기 세포외 소포체에 더하여 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 통상의 기술자는 그 제형에 따라 적절한 성분을 조합하여 제조할 수 있다.
상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명에 따른 세포외 소포체의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자의 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 약 0.001 내지 약 99.9 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 50 중량% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식품의 섭취/투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 섭취/투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 약 10 내지 약 1000 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 섭취량/투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 섭취량/투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 건강기능식품의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없을 수 있으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 수 있다.
세포외 소포체의 제조방법
본 발명은 부분적으로 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 등 탄닌 함유 식물 재료로부터 세포외 소포체를 제조함에 있어 식물 재료를 저온진공으로 전처리하는 경우에 막 손상 없이 고순도 및 고농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다는 발견에 기초한다. 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 세포외 소포체의 제조 방법을 사용하면 동일한 중량의 식물 원료로부터 더 많은 양의 제품 제조가 가능하다는 상업적인 이점이 있으며, 상대적으로 적은 양의 처방으로도 최대의 효과를 이끌어낼 수 있고, 피부에 직접 적용(예를 들어, 도포)되는 형태의 제제화에도 유리한 이점 또한 가진다. 특히, 저온진공으로 전처리하는 단계는 일반적인 추출 형태인 고온 및 고압에서의 추출이 식물 원료의 영양성분을 파괴하거나 또는 식물 원료에서 추출되는 세포외 소포체의 막을 손상시킬 수 있는 문제점의 해결책이 될 수 있다. 즉, 저온진공으로 전처리하는 단계는 식물 원료의 손상을 최소화시킬 수 있으며, 나아가 식물 원료에서 추출된 세포외 소포체의 막 손상을 최소화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 등 식물 재료를 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 식물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 제조 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 제조 방법은 전처리된 상기 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 수득한 상기 추출물에서 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포외 소포체의 제조 방법은 고순도 및 고농도의 세포외 소포체를 얻기 위해 식물 재료를 저온진공으로 전처리하는 것에 특징이 있으므로, 세포외 소포체를 생성, 분비 또는 함유하고 있는 식물 재료라면 식물의 종류에 제한되지 않고 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 피부 상태 개선 효과가 있는 식물 유래 세포외 소포체를 고순도 및 고농도로 얻기 위해, 상기 제조 방법을 이용하여 탄닌 함유 식물 유래 세포외 소포체를 제조할 수 있다. 따라서 일부 구현예에 따르면, 탄닌 함유 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 탄닌 함유 식물 유래 세포외 소포체의 제조 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 세포외 소포체의 제조 방법에 포함되는 전처리 단계는 80℃ 이하의 저온 조건, 구체적으로 10 내지 80℃, 보다 구체적으로 20 내지 60℃의 온도 조건에서 수행되는 저온진공법일 수 있다. 또는, 상기 전처리 단계는 대기압 이하의 압력 조건, 구체적으로 0 Bar 내지 1 Bar 범위의 압력 조건에서 수행되는 저온진공법일 수 있다. 또는, 상기 전처리 단계는 24시간 내지 72시간 동안 수행되는 저온진공법일 수 있다. 식물 재료의 물리적, 화학적 특성에 따라 상기 온도, 압력 및 시간 조건은 통상의 기술자에 의해 적절하게 조합될 수 있다. 예를 들어, 상기 전처리 단계는 20 내지 60℃의 온도 조건 및 0 Bar 내지 1 Bar 범위의 압력 조건에서 24시간 내지 72시간 동안 진행되는 저온진공법일 수 있다. 또는, 상기 전처리 단계는 30 내지 50℃의 온도 조건 및 0.5 Bar 내지 1 Bar 범위의 압력 조건에서 30시간 내지 60시간 동안 진행되는 저온진공법일 수 있다. 또는, 상기 전처리 단계는 40℃의 온도 조건 및 1 Bar의 압력 조건에서 48시간 동안 진행되는 저온진공법일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 식물 유래 세포외 소포체의 제조 방법은 (ⅰ) 전처리된 식물 재료로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅱ) 수득한 상기 추출물에서 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 단계 (ⅰ)의 추출물을 수득하는 단계는 전처리된 식물 재료를 착즙하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (ⅱ)의 분리 및 정제 단계는 추출물, 보다 구체적으로 착즙 추출물을 여과하는 단계, 상기 여과 단계에서 수득한 여과물에서 원심분리에 의해 액포를 포함하는 잔여물을 제거하는 단계, 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 단계, 및 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)에 의해 세포외 소포체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 착즙하는 단계는 다음 복수의 단계 전부 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다: 원료 식물을 (필요한 경우, 세척 후) 착즙기에 넣고 저속 회전하는 스크류를 사용하여 착즙하는 단계; 및 (착즙) 추출물을 미세 타공망에 통과시켜 식물 찌꺼기를 제거하는 단계.
상기 착즙 단계는 원료 식물을 (필요한 경우, 세척 후) 착즙기에 넣고 회전 속도가 20 내지 100 rpm인 스크류로 압착 및/또는 분쇄하여 착즙하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 스크류의 회전 속도는 20 내지 50 rpm 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 스크류의 회전 속도는 43 rpm 일 수 있다. 그러나, 상기 스크류의 회전 속도는 이에 제한되지 않는다.
상기 (착즙) 추출물을 미세 타공망에 통과시키는 단계에서, 상기 미세 타공망의 타공 크기는 원료 식물의 찌꺼기가 통과할 수 없는 크기로서, 착즙하려는 원료 식물의 종류에 따라 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 분리 및 정제 단계는 착즙물을 여과하는 단계, 상기 여과물에서 원심분리에 의해 액포를 포함하는 잔여물을 제거하는 단계, 선택적으로 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 단계, 및 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)에 의해 세포외 소포체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
여과 또는 재여과는 여과막 또는 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 여과는 평균 기공 사이즈가 0.22 μm 내지 5 μm인 기공을 포함하는 여과막 또는 필터로 수행될 수 있다. 여과 또는 재여과 단계는 여과물을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 착즙 추출물의 여과는 기공 사이즈가 0.22 ㎛, 0.45 ㎛, 0.65 ㎛, 0.8 ㎛, 1.5 ㎛, 3 ㎛ 또는 5 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용할 수 있고, 상기 잔여물이 제거된 생성물의 재여과는 기공 사이즈가 0.025 ㎛, 0.1 ㎛, 0.22 ㎛, 0.45 ㎛, 0.65 ㎛, 0.8 ㎛, 1.5 ㎛, 3 ㎛ 또는 5 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용할 수 있으며, 여기서 여과 단계에서 사용되는 여과막 또는 필터의 기공 사이즈보다 재여과 단계에서 사용되는 여과막 또는 필터의 기공 사이즈가 더 작은 것이 바람직하다. 예를 들어, (착즙) 추출물의 여과 단계는 기공 사이즈가 0.45 ㎛인 여과막 또는 필터로 수행되고, 이후의 재여과 단계에서는 기공 사이즈가 0.22 ㎛인 여과막 또는 필터로 수행될 수 있다.
원심분리는 저속 원심분리(low-speed centrifugation), 고속 원심분리(high-speed centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 저속 원심분리는 6,000 rpm (6,000 xg) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심분리에 이용되고, 고속 원심분리는 최고속도가 20,000 내지 25,000 rpm (60,000 xg) 정도이며, 초원심분리는 최고속도가 40,000 내지 80,000 rpm (600,000 xg) 정도인 원심분리법을 의미한다. 일 실시예에서, 상기 원심분리는 고속 원심분리일 수 있다.
세포외 소포체는 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)법을 통해 수득한 식물 추출물로부터 분리, 정제 및/또는 탈염될 수 있으며, TFF법 외에도 공지된 다른 분리/정제 방법이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 식물 재료는 탄닌 함유 식물일 수 있다. 상기 탄닌 함유 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 수득된 세포외 소포체는 다음 중 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다: (ⅰ) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 × 107 개 내지 약 3.0 × 1010 개 입자의 농도; (ⅱ) 약 120 nm 내지 약 230 nm의 평균 입자 크기; 및 (ⅲ) 약 -15 mV 내지 약 -50 mV의 제타 전위.
상기 탄닌 함유 식물에서 수득된 세포외 소포체의 농도, 입자 크기 및 제타 전위에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
다른 구현예에서, 상기 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법은 전처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법과 비교하여 더 고농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다. 일 실시예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법으로 추출한 엑소좀(제조예 2)이 전처리 단계를 포함하지 않은 제조 방법으로 추출한 엑소좀(제조예 1)에 비해 농도가 약 2.7배 높게 추출되었다.
또 다른 구현예에서, 상기 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법은 전처리 단계를 포함하지 않는 제조 방법과 비교하여 더 고순도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다. 일 실시예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법으로 추출한 엑소좀(제조예 2)을 TEM(투과전자현미경)을 통해 관찰한 결과, 추출된 엑소좀의 막에 손상이 없음을 확인하였다.
상기 "탄닌 함유 식물", "추출물", "세포외 소포체" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상술한 바를 참조한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
제조예 1. 엑소좀의 추출 및 정제
탄닌 함유 식물인 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로부터 세포외 소포체인 엑소좀을 추출 및 정제하였으며, 구체적인 방법은 다음과 같다. 원물 혼합물(호장근: 50g, 커피콩: 40g, 감나무잎: 5g, 율피: 4g, 홍화: 1g)(여기서, 커피콩은 워너빈로스터리㈜의 베트남산 커피콩이고, 나머지는 한약재시장에서 구입한 것임)을 착즙기(HUROM, H-AF-EBF19A)에 넣고 착즙 및 여과하고, 0.45 μm 필터(Milipore, Durapore PVDF Filter Cat. HVLP04700)를 이용하여 다시 여과하였다. 다음, 상기 여과물을 3,000 x g로 30분, 10,000 x g로 60분간 원심분리하여 액포를 포함한 파쇄 잔여물을 제거하고, 상등액을 0.22 μm 필터(Milipore, Durapore PVDF Filter Cat. GVWP04700)로 제균 여과하였다.
다음, 제균 여과된 추출물을 TFF(접선유동여과, Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하여 엑소좀을 분리, 농축, 탈염 및 버퍼교환(diafiltration)하여 수득하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, GE Healthcare) 또는 카세트 필터(cassette filter; Sartorius)를 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터는 다양한 분자량 컷오프(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리 및 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다. 추출물로부터 엑소좀을 분리 및 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton) 내지 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였으며, 상기 MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 수득하였다.
제조예 2. 저온진공법에 의해 전처리한 엑소좀의 추출 및 정제
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로부터 엑소좀을 추출 및 정제하기 전에 추출 효율을 높이기 위하여 저온진공기(㈜에스이씨)에 넣어 40℃ 온도 및 1 Bar 압력 조건에서 48시간 동안 전처리 과정을 진행하였다. 저온진공법은 추출 용해도 및 수분 복원력을 극적으로 증가시킬 수 있는 추출 방법이다.
전처리 과정을 진행한 다음 제조예 1과 같은 방식으로 엑소좀을 추출 및 정제하였다.
실시예 1. 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석 및 투과전자현미경(TEM) 관찰
실시예 1.1. NTA 분석
상기 제조예 1 및 제조예 2에서 추출 및 정제한 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 엑소좀 용액을 준비하고, 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle Tracking Analyzer, NTA; Particle metrix)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 입자의 크기 분포, 농도 및 제타 전위(Zeta potential) 분석을 진행하였다.
제타 전위는 수용액 내 엑소좀의 분산 및 응집을 확인하기 위해 측정하였다. 수용액 내 분산되어 있는 콜로이드 입자는 표면 극성기의 해리 및 이온의 흡착에 의하여 전하를 나타내며, 입자들 간의 반발력의 정도가 콜로이드의 안정성을 평가하는 중요한 척도로 사용된다. 즉, 음(-) 또는 양(+)의 제타 전위 값이 크다면 입자들 간의 반발력이 크고 분산 안정성이 좋다고 볼 수 있고, 작으면 입자들 간의 인력이 크게 작용하여 응집력이 크다고 볼 수 있다.
상기 제조예 1 및 제조예 2의 방법에 의해 추출 및 정제된 엑소좀의 NTA 분석 결과, 입자들의 평균 크기는 제조예 1의 엑소좀이 205.7 nm 및 제조예 2의 엑소좀이 151.8 nm로 측정되었으며, 1 mL의 단위 부피당 농도는 제조예 1의 엑소좀이 6.0 x 108 개 및 제조예 2의 엑소좀이 1.6 x 109 개의 농도를 나타내었다. 또한, 제타 전위 값은 제조예 1의 엑소좀이 -34.16 mV를 나타내었으며, 제조예 2의 엑소좀이 -29.18 mV를 나타내었다(표 1). 결과적으로, 제조예 2의 추출법으로 추출한 엑소좀은 제조예 1의 엑소좀에 비해 농도가 약 2.7배 높게 추출되어 저온진공법의 도입으로 엑소좀의 추출 효율이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 제조예 1 및 제조예 2를 통해 추출된 엑소좀의 크기 및 농도 그래프는 도 1에 도시하였으며, 제타 전위 그래프는 도 2에 도시하였다.
| 시료 | 평균 크기 | 농도 | 제타 전위 |
| 제조예 1 | 205.7 nm | 6.0 x 108 개 입자/mL | -34.16 mV |
| 제조예 2 | 151.8 nm | 1.6 x 109 개 입자/mL | -29.18 mV |
실시예 1.2. 투과전자현미경(TEM) 관찰
제조예 2의 추출법으로 추출한 엑소좀의 모양을 확인하기 위하여, 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope)으로 엑소좀을 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 제조예 2의 추출법으로 추출한 엑소좀은 막 손상이 없음이 확인되었다.
실시예 2. 엑소좀의 세포독성 평가
제조예 2에서 얻은 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 엑소좀의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT 분석을 통하여 세포 생존율을 평가하였다. 먼저, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포(입수처: American Type Culture Collection, Cat. CRL-2076 및 인간 각질세포주인 HaCaT 세포(Cell Line Service, Cat. 300493GKD)를 24 웰 플레이트에 각각 1x105 cells/well 및 1.5x105 cells/well 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 세포 배양을 위한 배지는 CCD-1064SK 세포의 경우 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco, Cat. 12483-020) 및 1% 항생제(입수처: Corning, Cat. 30-004-CI)가 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 사용하였고, HaCaT 세포의 경우 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco, Cat. 12483-020) 및 1% 항생제(Corning, Cat. 30-004-CI)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Welgene, Cat. LM001-05) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 각 웰을 무혈청 배지(serum free medium)로 교체하고 엑소좀을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 다음, 배양액을 제거한 웰에 무혈청 배지를 이용하여 희석한 MTT 용액(0.1 mg/mL 농도) 500 μL를 분주한 후 4시간 동안 암반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응액을 제거한 웰에 DMSO를 500 μL 분주하여 생성된 포르마잔(Formazan)을 녹여 흡광도 570 nm에서 측정하였다.
MTT 분석 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, CCD-1064SK 세포와 HaCaT 세포에 엑소좀을 5.0E+07 particles/mL 농도에서부터 1.0E+09 particles/mL 농도까지 처리하여 농도별로 세포 생존율을 확인한 결과, 두 가지 세포 모두 1.0E+09 particles/mL 농도에서부터 약 10% 이상의 세포 생존율 감소가 관찰되어 효능 실험 농도를 mL당 5.0E+08 개 입자의 농도까지 설정하여 하기 실험을 진행하였다.
실시예 3. 엑소좀의 주름 개선 효능 평가
제조예 2에서 얻은 엑소좀의 주름 개선 효능을 확인하기 위하여 주름 개선 관련 유전자(COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN을 코딩하는 유전자)의 발현을 관찰하였다. 먼저, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포를 24웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 IMDM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 상기 엑소좀과 양성 대조군인 아스코르브산(Ascorbic acid)을 처리하였다. 이 때, 엑소좀은 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후, COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 발현을 관찰하였다.
CCD-1064SK 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. 양성대조군 및 엑소좀이 처리된 세포는 PBS(Phosphate buffered saline)를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol®(QIAGEN, USA)를 처리하여 세포 용해(cell lysis)를 진행하였다. 다음, 제조사인 QIAGEN에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA는 RNA 정량 키트(Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit)를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. 이 때, cDNA의 합성은 cDNA 합성 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 이 때, 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 발현량 결과는 무처리군(Control)의 유전자 발현량을 기준으로 비율로 나타내었다.
그 결과, 표 2 및 도 5a 내지 도 5c에 나타낸 바와 같이, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 엑소좀(제조예 2)을 농도별로 처리한 결과, 엑소좀 농도가 증가함에 따라 주름 개선 관련 유전자인 COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 엑소좀을 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 무처리군과 비교하여 COL1A1의 경우 최대 60.97%, COL3A1의 경우 최대 80.78% 그리고 ELASTIN의 경우 최대 266.56%까지 발현이 증가하였다. 이 결과는 양성대조군인 아스코르브산과 비교해 보아도 월등히 우수한 효능을 나타내므로, 제조예 2의 엑소좀은 뛰어난 피부 주름 개선 효능을 가짐을 알 수 있다.
| 시료 | 농도 | 유전자 발현량(% of control) | ||
| COL1A1 | COL3A1 | ELASTIN | ||
| 무처리(Control) | 100.0 | 100.00 | 100.00 | |
| 제조예 2(Particles/mL) | 1.0E+08 | 126.67 | 160.22 | 322.50 |
| 2.5E+08 | 150.27 | 171.76 | 350.85 | |
| 5.0E+08 | 160.97 | 180.78 | 366.56 | |
| 아스코르브산(μg/mL) | 100 | 113.88 | 106.07 | 168.54 |
실시예 4. 엑소좀의 피부 보습 효능 평가
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 엑소좀의 피부 보습 효능을 확인하기 위하여, 피부 보습 관련 유전자(HAS2 및 CAS14를 코딩하는 유전자)의 발현을 관찰하였다. 먼저, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 상기 엑소좀과 양성 대조군인 레티노산(Retinoic acid)을 처리하였다. 이 때, 엑소좀은 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후, HAS2 및 CAS14 유전자 발현을 관찰하였다.
HaCaT 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. 양성대조군 및 엑소좀이 처리된 세포는 PBS(Phosphate buffered saline)를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol®(QIAGEN, USA)를 처리하여 세포 용해(cell lysis)를 진행하였다. 다음, 제조사인 QIAGEN에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA는 RNA 정량 키트(Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit)를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. 이 때, cDNA의 합성은 cDNA 합성 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트(2 PCRBIOSYSTEMS(UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 이 때, 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. HAS2 및 CAS14 유전자 발현량 결과는 무처리군(Control)의 유전자 발현량을 기준으로 비율로 나타내었다.
그 결과, 표 3 및 도 6a와 도 6b에 나타낸 바와 같이, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 엑소좀(제조예 2)을 농도별로 처리한 결과, 엑소좀 농도가 증가함에 따라 피부 보습 관련 유전자인 HAS2 및 CAS14 유전자의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 엑소좀을 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 무처리군과 비교하여 HAS2의 경우 최대 74.9% 및 CAS14의 경우 최대 283.8%까지 발현이 증가하였다. 이 결과는 양성대조군인 레티노산과 비교해 보아도 월등히 우수한 효능을 나타내므로, 제조예 2의 엑소좀은 뛰어난 피부 보습 효능을 가짐을 알 수 있다.
| 시료 | 농도 | 유전자 발현량(% of control) | |
| HAS2 | CAS14 | ||
| 무처리(Control) | 100.0 | 100.00 | |
| 제조예 2(Particles/mL) | 1.0E+08 | 121.0 | 211.3 |
| 2.5E+08 | 138.4 | 262.9 | |
| 5.0E+08 | 174.9 | 383.8 | |
| 레티노산(μM) | 1 | 110.4 | 110.50 |
실시예 5. 엑소좀의 피부 활력 증진 효능 평가
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 엑소좀의의 피부 활력 증진 평가를 위하여, JC-1 염색을 진행하여 미토콘드리아의 세포막 전위 변화를 검증하였다.
먼저, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, UVB 50 mJ/cm2을 조사하여 건조한 환경을 만들어주었다. 다음, 각 웰을 새로운 무혈청 배지로 교체하고 상기 엑소좀을 처리하였다. 이 때, 엑소좀은 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후, HBSS를 이용하여 세척하였다. 다음, 무혈청 배지에 JC-1 염료를 희석하여 세포에 처리하고, 2시간 동안 37℃에서 암반응시켰다. 다음, 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
이때, 미토콘드리아의 상태가 건강한 경우, 이와 같은 JC-1 염료를 이용한 염색을 통해 레드:그린(Red:Green)의 비가 1:1로 확인된다. 그러나, 미토콘드리아의 기능 장애를 유도할 수 있는 스트레스가 가해진 상태나 세포의 손상이 유도된 상태인 경우, 레드 형광 값이 현저하게 줄어들게 된다.
도 7에 도시된 결과로부터, UVB 조사에 의한 세포 손상 시 레드형광이 줄어들고, 엑소좀 처리시 레드 형광이 다시 발광함을 확인하였다. 따라서, 제조예 2의 엑소좀은 피부 세포의 미토콘드리아의 활성을 증가시킴으로 피부 활력 증진 효능이 있음을 알 수 있다.
Claims (19)
- 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는 상기 식물을 착즙 추출하여 얻어진 것인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는
(ⅰ) 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화를 저온진공으로 전처리하는 단계;
(ⅱ) 상기 전처리된 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및
(ⅲ) 수득한 추출물에서 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 방법에 의해 얻어진 세포외 소포체는 5.0 × 107 개 입자/mL 내지 2.0 X 1010 개 입자/mL의 농도로 수득되는 것인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 135 nm 내지 220 nm인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는 제타 전위가 -15 mV 내지 -50 mV인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는 피부 세포에서 COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는 피부 세포에서 HAS2 및 CAS14 유전자 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포체는 피부 세포에서 미토콘드리아의 활성을 증가시키는 것인
피부 상태 개선용 화장료 조성물. - (ⅰ) 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화를 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 제조 방법. - 제11항에 있어서,
상기 저온진공으로 전처리하는 단계는 20 내지 60℃의 온도 및 0 Bar 내지 1 Bar 범위의 압력 조건에서 24 내지 72시간 동안 수행되는
제조 방법. - 제11항에 있어서,
상기 방법은 (ⅱ) 상기 전처리된 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅲ) 수득한 상기 추출물에서 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는
제조 방법. - 제13항에 있어서,
단계 (ⅱ)의 추출물을 수득하는 단계는 전처리된 상기 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화를 착즙하는 단계를 포함하는
제조 방법. - 제13항에 있어서,
단계 (ⅲ)의 분리 및 정제 단계는 추출물을 여과하는 단계, 상기 여과물에서 원심분리에 의해 액포를 포함하는 잔여물을 제거하는 단계, 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 단계, 및 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)에 의해 세포외 소포체를 수득하는 단계를 포함하는
제조 방법. - 제11항에 있어서,
상기 수득된 세포외 소포체는 하기 중 하나 이상의 특성을 갖는
제조 방법:
(ⅰ) 1 mL의 단위 부피당 5.0 × 107 개 입자/mL 내지 2.0 × 1010 개 입자/mL의 농도;
(ⅱ) 135 nm 내지 220 nm의 평균 입자 크기; 및
(ⅲ) -15 mV 내지 -50 mV 의 제타 전위. - 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는
피부 건조증의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물. - 제17항에 있어서,
상기 조성물은 피부 주름 개선 또는 피부 활력 증진의 효과를 추가로 나타내는
피부 건조증의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물. - 제17항에 있어서,
상기 조성물은 의약외품인
피부 건조증의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
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| KR20150102362A (ko) * | 2014-02-28 | 2015-09-07 | (주)라누베 | 파상된 산양산삼으로부터 최대함량 진세노사이드 추출방법 |
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2022
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