KR102265811B1

KR102265811B1 - 분산성 및 안정성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102265811B1
Application number: KR1020210046721A
Authority: KR
Inventors: 윤은정; 박시준; 김정수; 김현민
Original assignee: 주식회사 에이바이오머티리얼즈
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-06-16

Abstract

본 발명은 안정성 및 분산성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 초고압전처리 및 수성 2상 시스템을 이용하여 안정성 및 분산성이 우수한 병풀 유래 엑소좀을 정제하고 이를 화장료 조성물로 이용하는 기술에 관한 것이다.

Description

분산성 및 안정성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물{Method for isolation and purification of Centella asiatica exosome and cosmetic composition containing the same}

본 발명에서 "엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.

최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 이의 항산화, 항염 등의 피부 효능에 대해서도 연구가 시작되고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.

이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.

종래, 엑소좀을 분리하는 방법에는 초원심분리, 밀도 구배 초원심분리, 접선흐름여과(TFF), 폴리머 침전법 등이 있다. 초원심분리 방법은 매우 고가의 장비를 사용하여야 하고, 분리 시간이 긴 단점이 있으며, 밀도 구배 초원심분리 방법은 낮은 효율과 엑소좀이 응집하는 문제가 있다. 접선흐름여과(TFF) 방법 역시 장비 셋업이 복잡하며 대량화가 어려운 단점이 있다.

본 발명자들은 이러한 단점을 극복하기 위해 수성 2상 시스템을 사용하여 분산성 및 안정성이 증가된 식물 유래 엑소좀을 분리 정제하고 이를 화장료로 이용하기 위한 연구를 하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-2125567호 (2020.06.16) (0002) 대한민국 공개특허 제10-2020-0121062호 (2020.10.23) (0003) 대한민국 공개특허 제10-2019-0050286호 (2019.05.10)

그러므로 본 발명은 분산성 및 안정성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 정제된 병풀 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 제형 내에서 그 활성이 장기간 유지되는 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A) 병풀을 세척하여 초고압 처리를 하는 단계;

(B) 초고압 처리된 병풀을 착즙하는 단계;

(C) 상기 병풀 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

(D) 엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;

(E) 상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및

(F) 상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법이 제공된다.

상기 (A) 단계에서 병풀 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로, 바람직하게는 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 한다.

상기 (E) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 PEG와 Dextran은 3.3중량% : 1.7중량%의 농도비율로 사용된다.

상기 정제방법에 있어서, 더욱 바람직하게는 엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (F)단계에 이어 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 추가 반복 수행한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 상기 방법에 의하여 정제된 병풀 유래 엑소좀을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~20중량% 함유하는 피부재생용, 주름개선용 또는 항염용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 정제 방법에 따르면 병풀 유래 엑소좀의 낮은 분산력과 응집하려는 성질이 개선되어 안정성이 증가된다. 그러므로 안정성이 증가된 병풀 유래 엑소좀은 제형 내에서 그 활성이 장기간 유지되므로 다양한 피부 효능을 확보할 수 있어 피부재생, 주름 개선 및 항염용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 병풀 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 병풀 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 비교예에 따라 초고압 전처리를 거치지 않고 정제된 병풀 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 의해 정제된 병풀 유래 엑소좀의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 병풀 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 콜라겐 생성능으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 병풀 유래 엑소좀의 항염 효능을 NO(Nitric oxide) 생성 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 피부개선활성이 알려진 병풀로부터 분산성과 안전성이 우수한 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.

병풀(Centella asiatica)은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀이다. 병풀은 오래 전부터 약용 식물로 사용되어 왔다. 병풀의 유효성분으로서 asiaticoside, madecasosside, asiatic acid, madecassic acid를 포함하는 pentacyclic triterpenes가 알려져 있으며, 이들 성분은 피부 세포의 콜라겐 형성 효능과 항산화 활성, 피부 노화 억제 효능, 항염 효능, 피부 광노화 개선, 상처 치유 효능이 뛰어난 것으로 보고되어 있으며 국내에서도 화장품이나 상처치료 연고제의 원료로 사용되고 있다.

본 발명에 따르면, (A) 병풀을 세척하여 초고압 처리를 하는 단계; (B) 초고압 처리된 병풀을 착즙하는 단계; (C) 상기 병풀 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (D) 엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (E) 상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (F) 상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법이 제공된다.

상기 (A) 단계에서 병풀은 생물 또는 건조물을 모두 사용할 수 있으며, 병풀 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로, 바람직하게는 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 한다. 엑소좀은 생리활성물질로 그 처리 온도를 15℃~25℃로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 초고압 처리는 병풀 건조물을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로 20초~2분간 초고압 처리를 하여 수행한다. 병풀 생물을 사용하는 경우에는 증류수 없이 비닐 팩에 넣어 수행할 수 있다.

상기 (B) 단계에서 병풀을 착즙하는 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 초고압 처리에 의한 식물세포벽의 투과율 변화로 즙이 쉽게 빠져나오기 때문에 교반 속도가 일정 이하인 스크류를 사용하는 것이 좋다.

상기 (C) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 바람직하다.

상기 (D) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50~-80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.

엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueaus two phase partition method)을 사용하였다.

수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.

상기 (E) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량% : 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (F)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.

이와 같은 방법에 의하여 제조된 병풀 유래 엑소좀은 다른 방법에 의하는 경우보다 수율이 더 높았으며(시험예 2), 분산 안정성이 더욱 우수하였다(시험예 3). 또한, 상기 방법에 의하여 정제된 병풀 유래 엑소좀은 우수한 피부재생 효과(시험예 5), 주름개선효과(시험예 6) 및 항염효과(시험예 7)를 나타내었다. 그러므로 상기 병풀 유래 엑소좀은 피부재생용, 주름개선용 또는 항염용 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 이때 상기 유효성분으로서의 병풀 유래 엑소좀은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~20중량% 함유될 수 있다.

상기의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스, 립스틱 등으로 제조될 수 있다.

한편, 상기의 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위 내에서 통상 화장품에 이용되는 성분, 예를 들면, 보습제, 산화방지제, 계면활성제, 알코올류, 증점제, 수성성분, 물, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 필요에 따라 당업자가 어려움 없이 적절히 선정하여 배합할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1: 병풀 유래 엑소좀의 제조

병풀 초고압 처리

병풀 건조물 30 g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 25℃의 온도에서 200Mpa의 압력으로 30초간 초고압 처리를 실행하였다.

병풀 착즙

초고압 처리한 병풀을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 병풀 착즙을 수행하였으며 수득한 병풀 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 병풀 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

엑소좀 정제를 위한 상층액 회수

병풀 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.

상층액 동결건조

엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.

수성 2상계 형성

동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG(Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran (Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.

병풀 유래 엑소좀의 회수

상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.

추가 세척 공정

순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.

실시예 2~3: 적정 농도 확인 위한 수성 2상계 형성

수성 2상계에 사용되는 용액의 적정 농도 확인을 위하여 농도만을 달리하고 상기 실시예 1과 동일하게 실시하여 병풀 유래 엑소좀을 제조하였다. 건조물에 정제수를 넣어 초고압 처리를 한 후 착즙을 수행하였다. 병풀 착즙액은 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 하여 큰 오염물질을 제거하고 부피를 줄이기 위한 동결건조를 진행하였다. 동결건조된 상층액에 정제수를 추가하여 하기 표 1의 조성으로 농도를 달리하여 수성 2상계를 형성하고 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 순도를 높이기 위해 정제 시와 동일한 농도의 수성 2상 용액을 추가하여 세척 공정을 진행하였다.

조성	실시예 2	실시예 3
PEG (중량%)	6.6	13.2
Dextran (중량%)	3.4	6.8

비교예 1: 초원심분리(Ultracentrifuge) 방법을 이용한 병풀 유래 엑소좀 정제

상기 실시예 1과 동일하게 병풀 건조물에 정제수를 넣어 초고압 처리를 한 후 착즙을 수행하였다. 병풀 착즙액은 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 하여 큰 오염물질을 제거하였다. 상층액을 회수하여 초원심분리기를 사용하여 150,000xg에서 70분동안 4℃에서 초원심분리를 수행하여 엑소좀을 회수하였다.

비교예 2: 초고압처리를 하지 않은 병풀 유래 엑소좀 정제

상기 초고압 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 하여 병풀 유래 엑소좀을 정제하였다.

시험예 1: 병풀 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 병풀 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 2: 병풀 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 병풀 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 초고압처리의 여부에 따른 엑소좀의 입자 수를 비교하기 위해 비교예 2에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 NTA 분석도 수행하였다.

도 2는 상기 실시예 1에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 179.2nm와 1 mL의 단위 부피당 2.1 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다. 도 3은 상기 비교예 2에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프로 입자들의 평균 크기 161.0nm와 1 mL의 단위 부피당 1.3 x 10⁹ 개의 농도를 확인하였다. 실시예 1과 비교예 2는 동일한 양으로 실험을 진행하였으며 수율을 비교해보면 초고압처리를 했을 때(실시예) 더 많은 양의 엑소좀을 추출할 수 있음을 확인하였다.

시험예 3: 병풀 유래 엑소좀의 zeta potential(제타전위) 분석

용액 내 분산되어 있는 입자인 콜로이드는 수용액 내에 존재 시 입자 표면의 표면극성기의 해리와 이온의 흡착에 의하여 전하를 띤다. 입자들 간의 반발력의 정도가 콜로이드의 안정성을 평가하는 중요한 척도로 사용된다. 즉, 음(-) 또는 양(+)의 제타전위 값이 크다면 입자들간의 반발력이 크고 분산 안정성이 좋다고 볼 수 있고, 작으면 입자들간의 인력이 크게 작용하여 응집력이 크다고 볼 수 있다. 따라서 정제한 병풀 유래 엑소좀의 용액 내 분산 및 응집을 확인하기 위해 Zetasizer를 통해 zeta potential(제타 전위) 분석을 진행하였다. 하기 표 2는 상기 실시예 1에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 제타 전위(zeta potential)값과 상기 비교예 1에 따라 본 발명의 정제 방법이 아닌 초원심분리법으로 분리한 병풀 유래 엑소좀의 제타 전위(zeta potential) 값을 나타내었다.

	병풀 유래 엑소좀(실시예 1)	병풀 유래 엑소좀(비교예 1)
Zeta potential(mV)	-35.5	-14.3

제타 전위 분석 결과, 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명 실시예에 따라 정제한 병풀 유래 엑소좀의 분산 안정성이 더 우수함을 알 수 있다.

시험예 4: 병풀 유래 엑소좀의 수율 및 안정성 분석

수성 2상 용액의 적정 농도를 확인하기 위해 병풀 유래 엑소좀의 수율 및 안정성을 비교하였다. 하기 표 3은 상기 실시예 1 내지 3에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀을 12주 간 4℃에서 보관 후 나노입자추적분석(NTA)을 통해 입자의 크기와 농도를 나타낸 표이다.

	병풀 유래 엑소좀 (실시예 1)		병풀 유래 엑소좀 (실시예 2)		병풀 유래 엑소좀 (실시예 3)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	2.10 x 10¹⁰	179.2	1.07 x 10⁸	187.8	1.07 x 10⁹	172.4
2주차	2.19 x 10¹⁰	178.1	1.02 x 10⁸	190.4	1.06 x 10⁹	181.5
4주차	2.11 x 10¹⁰	181.3	9.97 x 10⁷	192.7	1.01 x 10⁹	181.7
8주차	2.03 x 10¹⁰	184.7	9.27 x 10⁷	201.1	9.51 x 10⁸	187.3
12주차	1.97 x 10¹⁰	182.6	8.07 x 10⁷	203.4	9.31 x 10⁸	190.3

초기 농도를 비교해보면 실시예 1에 해당하는 PEG:Dextran의 농도 비율이 3.3 : 1.7일 때 엑소좀의 수율이 가장 높았다. 또한 12 주 후의 안정성을 분석한 결과, 실시예 2, 실시예 3과 비교했을 때 실시예 1에 해당하는 병풀 유래 엑소좀의 크기 및 농도 변화가 더 안정적임을 확인하였다. 따라서 수성 2상 용액의 가장 적정한 농도는 PEG 3.3 중량%, Dextran 1.7 중량%인 것을 알 수 있다.

시험예 5: 병풀 유래 엑소좀의 피부재생 효능 평가

병풀 유래 엑소좀의 피부재생 효능을 확인하기 위해 wound healing assay 평가를 진행하였다. 각질형성세포(HaCaT)를 6well 플레이트에 2×10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 200 ㎕ 파이펫 팁을 이용하여 세포를 긁어 내었다. 긁어낸 후 떨어져나간 세포들은 PBS buffer로 반복해서 세척하고 1.5% 소혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체한 후 병풀 유래 엑소좀을 처리하고 양성대조군으로는 TGF-β1을 5ng/mL 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 다음 현미경 상에서 세포 이동률을 측정하였다.

도 4는 상기 실시예 1에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이다. 시험 결과, 병풀 유래 엑소좀은 양성대조군과 유사한 수준으로 세포 이동을 증가시키는 것을 확인하였다.

시험예 6: 병풀 유래 엑소좀의 주름 개선 효능 평가

병풀 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 확인하기 위해 Procollagen Type I 생성능 평가를 진행하였다. 인간 피부 섬유아세포인 HS68 세포(human skin fibroblasts)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)에 페니실린 7.5mg/L, 스트렙토마이신 7.5mg/L를 함유하고 있는 DMEM 배지를 사용하여 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 10% PBS로 세척 후 새로운 배지와 병풀 유래 엑소좀을 처리하고 24시간 배양한다. 그 후 배양액을 수거하여 Procollagen type-I C peptide (PIP) EIA kit (Takara)를 사용하여 배양액 내 콜라겐 생성량을 측정하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 TGF-β1를 5ng/mL를 처리하였다.

도 5는 상기 실시예 1에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 Procollagen Type I 생성능으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 병풀 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 콜라겐 생성량이 증가하였으며 주름 개선 효과가 있음을 확인하였다.

시험예 7: 병풀 유래 엑소좀의 항염 효능 평가

병풀 유래 엑소좀의 항염 효능을 확인하기 위해 NO(Nitric oxide) 생성 억제율 평가를 진행하였다. Raw264.7 대식세포를 96 well plate에 8×10⁴ cells/well로 분주하고 24시간 배양한 후, 병풀 유래 엑소좀을 1시간 동안 처리하였다. 처리 후 LPS를 100ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하여 염증을 유발하였다. 그 후 세포배양 상층액 100 μL와 Griess 시약을 동량 혼합하여 10분간 실온 암소에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀의 항염 효능을 NO(Nitric oxide) 생성 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 병풀 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하였으며 NO 생성 억제 활성이 우수한 것을 확인하였다.

제형예 1~3: 크림의 제조

하기 표 4의 조성으로 상기 실시예 1 내지 3에 따라서 정제된 병풀 유래 엑소좀을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 비교예 1의 병풀 유래 엑소좀을 함유하는 크림을 비교제형예 1로 하였다.

성분	제형예 1	제형예 2	제형예 3	비교제형예 1
성분	함량(중량 %)
병풀 유래 엑소좀(실시예 1)	3
병풀 유래 엑소좀(실시예 2)	-	3	-	-
병풀 유래 엑소좀(실시예 3)	-	-	3	-
병풀 유래 엑소좀(비교예 1)	-	-	-	3
글리세린	10	10	10	10
부틸렌글라이콜	5	5	5	5
글리세릴올리에이트	1.8	1.8	1.8	1.8
세테아릴올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5
솔비탄올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0	5.0	5.0
세틸에틸헥사노에이트	1.0	1.0	1.0	1.0
비즈왁스	0.5	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	0.2	0.2	0.2	0.2
1,2-헥산다이올	0.2	0.2	0.2	0.2
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트	1.0	1.0	1.0	1.0
디메치콘	0.5	0.5	0.5	0.5
사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산	2.0	2.0	2.0	2.0
세티아릴알코올	1.0	1.0	1.0	1.0
미네랄 오일	2.5	2.5	2.5	2.5
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02
비에이치티	0.05	0.05	0.05	0.05
토코페릴아세테이트	0.3	0.3	0.3	0.3
판테놀	0.2	0.2	0.2	0.2
에칠헥실메톡시신나메이트	0.2	0.2	0.2	0.2
향	0.01	0.01	0.01	0.01
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량

시험예 8: 병풀 유래 엑소좀의 제형 성상 안정성 분석

상기 제형예에 따라서 제조된 크림의 성상안정성 시험을 진행하였다.

제조된 크림을 12주 간 Cycling Chamber에서 24시간 간격으로 4℃ ↔ 45℃ 의 온도 변화를 주면서 그 성상의 변화를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

주차	제혀예 1	제형예 2	제형예 3	비교제형예 1
초기	-	-	-	-
2주차	-	-	+	++
4주차	-	++	++	+++
8주차	-	++	+++	+++
12주차	+	+++	+++	+++

(-; 변화없음, +; 약간 색의 변화, ++; 색변화 또는 약간의 침전, +++; 색변화와 침전 발생)

수성 2상 용액의 농도 조건 별로 정제한 병풀 유래 엑소좀(실시예 1~3)과 초원심분리법으로 정제한 병풀 유래 엑소좀(비교예 1)을 함유한 크림 제형의 안정성을 관찰한 결과, 상기 실시예의 병풀 유래 엑소좀을 함유한 크림이 비교예 1의 병풀 유래 엑소좀을 함유한 크림에 비하여 성상안정성이 높았으며, 그 중에서도 실시예 1의 병풀 유래 엑소좀을 함유한 제형예 1의 크림의 성상이 가장 안정한 것으로 확인되었다.

Claims

(A) 병풀을 세척하여 초고압 처리를 하는 단계;
(B) 초고압 처리된 병풀을 착즙하는 단계;
(C) 상기 병풀 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
(D) 엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;
(E) 상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및
(F) 상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 (A) 단계에서 병풀 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 (E) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량% 사용하는 것을 특징으로 하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법.
제3항에 있어서, 상기 PEG와 Dextran은 3.3중량% : 1.7중량%의 농도비율로 사용하는 것을 특징으로 하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 (F)단계에 이어 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 것을 특징으로 하는 병풀 유래 엑소좀의 정제 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의하여 정제된 병풀 유래 엑소좀을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~20중량% 함유하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부재생용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.