KR20200002496A - 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식용 식물 유래 엑소좀을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 감귤류(citrus), 오이 또는 감자 등 식용 식물 유래엑소좀을 이용하여, 피부 미백 효능뿐만 아니라, 안전성, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능도 우수한, 식용 식물 유래 엑소좀을 함유하는 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물{Composition comprising exosome extracted from edible plant for skin whitening}
본 발명은 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 피부 미백 효능뿐만 아니라, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능도 우수한, 감귤류(Citrus), 오이 또는 감자 등의 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
알려진 모든 동물, 식물 및 미생물 세포는 엑소좀을 분비하며, 이들 엑소좀을 이중지질막(lipid bilayer) 구조를 가진 물질로 세포유래 단백질(Protein), 핵산(예를 들면, messenger RNA 및/또는 micro RNA 등) 및 대사산물(metabolite) 등을 포함한다.
상기 엑소좀은 세포 간 이동 후 분비된 원세포(autologous) 또는 타깃 세포(heterologus)와 세포막 융합(membrane fusion)을 통하여, 내부 물질을 전달하는 매개체(vehicle)로 작용하여, 제3의 신호절단 기능을 수행할 수 있다.
즉, 이들 엑소좀은 자신이 배출한 세포와 다시 접촉(interaction)하거나 장거리 이동을 통해 타깃 세포와 접촉 및 흡수되며, 흡수된 세포의 대사활동(metabolism) 및 유전자 발현(gene expression) 조절을 통하여 표현형 및 형질변환을 유도할 수 있다(Mittelbrunn & Sanchez-Madrid, Nature Reviews 13 (2012) 328-335: hery et al. Nat. Rev. Immunol. 2 (2002) 569-579; Valadiet et al. Nat. Cell. Biol. 9 (2007) 654-659). Exosomes are secreted by all types of cells in culture, and also found in abundance in body fluids including blood, saliva, urine, and breast milk (Kosaka et al., Silence 3 (2010) 1-7: Mitchellet al., PNAS 105 (2008) 10513-10518; Palanisamy et al., LoS One 5 (2010) 8577).
엑소좀은 특정 환경에 처한 세포의 특성을 나타내는 동시에 인간에서는 혈액을 포함하는 모든 체액에서 발견된다는 점에서 비침습적(non invasive) 진단 소재로 연구가 활발하게 진행 중이다.
또한, 최근 엑소좀을 이용한 인간 질병 치료 목적의 적용 사례가 증가하고 있다 (Harrell CR, et. Al. Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes in the Treatment of Eye Diseases. Adv Exp Med Biol. 2018 May 18. doi: 10.1007/5584_2018_219. [Epub ahead of print]).
최근에는 줄기세포, 식물 및 식물병원균으로부터 관찰되거나 분리된 엑소좀에 대한 여러 보고가 이루어지고 있으나, 줄기세포 변이나, GMO 식물에 대한 두려움 등으로 안전성에 대한 고려가 필요한 실정이다.
본 발명에 대한 배경기술로 대한민국 등록특허 제10-17504110000호에는 엑소좀 단백질 EIF3A 특이반응 오토항체검출용 항원 조성물 및 이를 이용한 간암진단법에 대해 기재되어 있다.
상기의 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해의 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명의 목적은 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 감귤류(citrus), 오이, 또는 감자에서 유래된 엑소좀을 포함하는 안전성, 피부탄력 증진, 및 주름살 억제 효능도 우수한 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식용 식물 유래 엑소좀을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
일 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 상기 감귤류는 오렌지 또는 레몬일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능 중 1 이상을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 엑소좀은 50 ~ 500 ㎍/㎖로 포함될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 엑소좀은 1 X 107 ~ 1 X 1012/ml의 입자수로 포함될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 엑소좀의 직경은 10nm ~ 300nm일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 엑소좀은 열처리 없이 분리된 것일 수 있다.
다른 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 식품 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 상기 식품 조성물은 피부 미백, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능 중 1 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상을 착즙하여 착즙물을 수득하는 단계; 상기 착즙물을 원심분리하여 필터링하는 단계; 상기 필터링한 용액을 원심분리 후 침전물을 완충액에 용해하는 단계; 및 상기 용해된 용액을 -30 ~ -100℃에서 보관하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이 또는 감자를 착즙하여 착즙물을 수득하는 단계; 상기 착즙물을 원심분리하여 필터링하는 단계; 상기 필터링한 용액 추가적인 원심분리 후 PEG(Polyehtylene glycol)에 용해시키는 단계; 및 상기 용해된 용액을 원심분리 후 완충액에 용해시키는 단계를 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 상기 감귤류는 껍질을 제거한 상태일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 필터링은 1차 및 2차 필터링하는 단계를 포함하고, 상기 2차 필터링 하는 단계는 직경 10nm ~ 50nm의 필터를 이용하여 필터링하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 피부 미백 효능뿐만 아니라, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능도 우수한, 복합기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 감귤류(citrus), 오이 또는 감자 등 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하여, 종래의 줄기세포 유래 엑소좀 또는 화학합성 엑소좀에 비하여 우수한 안전성을 가진 피부 미백용 조성물을 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 피부 미백 효능뿐만 아니라, 안전성, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능도 우수한, 피부 미백용 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 피부세포의 조성(A) 및 멜라닌세포(Melanocyte) 내에서 멜라닌 합성과정과 티로시나아제 반응단계(B)를 나타낸 도면이다.
도 2는 피부세포의 자외선 노출 시 주름살 생성 및 피부탄성 감소 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 오렌지 엑소좀의 RNA-Seq 및 메타볼로믹스(metabolomics)의 워크플로우를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 오렌지 엑소좀의 추출 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 일 실시예에 따른 오렌지 엑소좀의 온도에 의한 티로시나아제 억제에 대한 안정성 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 실시예에 따른 오렌지 엑소좀의 피부개선 효능을 확인하기 위하여, 엑소좀의 지름 측정(도 6의 A), 티로시나아제 억제 활성(도 6의 B), MMP-1 억제 활성(도 6의 C) 및 엘라스타아제 활성(도 6의 D)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 실시예에 따른 오렌지, 오이, 감자 및 이외 기타 식용 식물 유래의 엑소좀의 티로시나아제 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 실시예에 따른 오렌지, 오이, 감자 및 이외 기타 식용 식물 유래의 엑소좀의 MMP-1 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 일 실시예에 따른 오렌지, 오이, 감자 및 이외 기타 식용작물 유래의 엑소좀의 호중구 엘라스타제 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부한 도면들을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
일 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 식용 식물 유래의 엑소좀은 GMO가 아닌 자연 산물로서, 엑소좀 자체가 이중지질막 구조이므로, 피부는 물론 기타 세포내로 흡수가 가능하고, 이동이 자유로워 화장료 제제로서 큰 이점이 있다.
본 출원인은 엑소좀의 분리 기술을 확립한 경험을 바탕으로 식용 식물 중 감귤류, 오이 또는 감자에서 유래된 엑소좀은 우수한 피부 미백, 주름살 억제 및 피부탄성 증진 효능을 동시에 갖는 물질임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 감귤류는 오렌지 또는 레몬일 수 있다.
도 1에는 피부 세포의 조성(A) 및 멜라닌세포(Melanocyte) 내에서 멜라닌 합성과정과 티로시나아제 반응단계(B)가 나타나 있다.
도 1을 참조하면, 피부색은 표피(epidermis)에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)가 생성하는 멜라닌(melanin)에 의해 결정되며, 자외선 (ultraviolet light, UV light)의 자극을 받으면 멜라닌세포의 내부에 멜라닌소체(melanosome)라는 베지클(vesicle)의 표면에 존재하는 효소인 티로시나아제(tyrosinase)가 활성화된다. 이후, 멜라닌소체(melanosome) 내에서 멜라닌(melanin) 합성이 진행된다. 또한, 멜라닌세포(melanocyte)에서 합성된 멜라닌은 주위의 케라틴세포(keratinocyte)로 분비되거나, 축적되며 UV 흡수를 통하여 피부암 생성을 억제한다고 알려져 있다.
멜라닌세포(melanocyte) 내 멜라닌 합성 기전은 최종적으로 유멜라닌(eumelanin, 다크 또는 브라운 색소)과 페오멜라닌(pheomelanin, 노란색과 붉은 색소)을 생성한다.
효소 티로시나아제는 L-티로시나아제로부터 티로신 유도체인 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)를 생성하고, L-DOPA로부터 L-도파퀴논(L-dopaquinone) 합성을 유도하여 유멜라닌과 페오멜라닌 모두의 초기 공통된 합성단계를 조절한다. 피부 미백의 관점에서 효소 티로시나아제의 억제는 유멜라닌과 페오멜라닌을 공통적으로 억제할 수 있는 효율적인 단계이며, 화장품 개발에서 미백 기능물질 개발의 핵심 타깃이 될 수 있다(del Marmol V, et. Al., Tyrosinase and related proteins in mammalian pigmentation. FEBS Lett. 1996 Mar 4;381(3):165-8.).
본 발명의 의한 감귤류, 오이 또는 감자에서 유래된 엑소좀은 티로시나아제 억제 활성이 우수하고, 특히 감자 및 오이에서 유래된 엑소좀은 티로시나아제 억제 활성이 매우 우수하다(도 7 참조).
도 2는 피부세포의 자외선 노출 시 주름살 생성 및 피부탄성 감소 과정을 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하면, 주름살 생성 및 억제에 관하여, 체내 정상세포의 세포간 연결은 세포들이 분비하는 세포외기질(Extracellular matix, ECM)에 의해 유지되며, 알려진 ECM 성분에는 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 엘라스틴(elastin), 및 프로테오글리칸(proteoglycans) 등의 단백질 및 당단백질이 있다.
피부가 장기 자외선 노출되거나 염증에 의해 사이토카인 등에 의해 자극 받으면, 피부 케라틴세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)에서는 MMP (matrix metalloproteinase)의 단백질이 다량 생성되며, 이들 MMP에 의해 ECM 성분들을 분해되어 궁극적으로는 피부암과 피부노화로 이어질 수 있다.
자외선 노출에 의한 피부노화는 특히 광노화(photoaging)로 불리며, 피부조직내의 ECM 조성 물질(예를 들어, 단백질 및 당단백질)들의 분해와 합성간의 균형이 무너지는 경우 발생하게 된다.
피부조직의 ECM 내에 가장 많이 존재하는 단백질은 콜라겐이며, 콜라겐의 양은 분해효소인 콜라게나아제(collagenase, 특히 MMP-1)와 분해효소에 대한 억제효소(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)간의 양과 활성 등의 균형에 의해 결정된다.
따라서, MMP-1의 양과 활성의 증가는 광노화를 촉진시키는 가장 핵심적인 요소라고 할 수 있다. 즉, MMP-1의 활성화는 피부 광노화의 대표적인 현상으로, 이에 대한 억제제는 피부 주름살의 생성 억제물질의 후보물질이 될 수 있다.
본 발명의 의한 감귤류, 오이 또는 감자에서 유래된 엑소좀은 MMP-1 억제 활성이 우수하고, 특히 오이에서 유래된 엑소좀은 MMP-1 억제 활성이 매우 우수하다(도 8 참조).
ECM의 또 다른 성분인 엘라스틴은 콜라겐 구조를 유지하는 역할을 하는 탄력적인 섬유성분이며, 이 역시 자외선에 장기노출 시 엘라스틴 분해효소인 엘라스타제의 억제를 통하여 피부 탄성의 유지 및 회복을 유도할 수 있다.
도 2를 참조하면, 피부세포의 자외선 노출이 활성산소의 증가로 이어지며, 이는 사이토카인 수용체(cytokine receptor)를 자극시키고, 사이토카인인 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 발현으로 이어지는 것이 나타나 있다. 또한, NK-kB는 MMP 유전자 발현을 통하여 MMP 단백질들을 생성하며, MMP-1은 콜라겐 분해 (collagen degradation)을 통하여 주름살 생성 (wrinkle generation), MMP-12 등은 엘라스틴 분해 (elastin degradation)을 통하여 피부탄성 감소로 이어질 수 있음이 나타나 있다.
본 발명의 의한 감귤류, 오이 또는 감자에서 유래된 엑소좀은 엘라스타제 억제 활성이 우수하고, 특히 감자에서 유래된 엑소좀은 엘라스타제 억제 활성이 매우 우수하다(도 9 참조).
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 엑소좀은 50 ~ 500 ㎍/㎖로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 엑소좀은 피부 미백, 주름살 억제 및 피부탄성 증진에 적합할 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 엑소좀은 1 X 107~ 1 X 1012/ml의 입자수로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 엑소좀은 피부 미백, 주름살 억제 및 피부탄성 증진에 적합할 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 엑소좀의 직경은 10nm ~ 300nm일 수 있다. 상기 범위 내에서 엑소좀은 피부 미백, 주름살 억제 및 피부탄성 증진에 적합할 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 엑소좀은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량부로 함유될 수 있고, 보다 구체적으로 1 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.
상기 엑소좀은 열처리 없이 분리된 것일 수 있다.
본원에서 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것이나, 특정 제형에 한정되는 것은 아니고 통상적인 화장료 조성물의 제형을 가질 수 있다.
아울러, 상기 각각의 제형에 첨가물 역시 한정되지 않으며 화장료 분야의 일반적인 첨가물이 첨가될 수 있다. 상기 화장료 분야의 일반적인 첨가물의 예로는 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다.
다른 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 식품 조성물이 제공된다.
본 발명에 의한 식품 조성물은 식용 식물에서 유래하여 안전하고, 우수한 피부 미백, 주름살 억제 및 피부탄성 증진 효능을 동시에 가질 수 있다.
본원에서 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식용 식물 추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명에서 유효 성분으로 포함되는 식용 식물 유래 엑소좀은 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50 중량부로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 다른 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상을 착즙하여 착즙물을 수득하는 단계; 상기 착즙물을 원심분리하여 필터링하는 단계; 상기 필터링한 용액을 원심분리 후 침전물을 완충액에 용해하는 단계; 및 상기 용해된 용액을 -30 ~ -100℃에서 보관하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
또 다른 측면에 따르면, 감귤류(citrus), 오이 또는 감자를 착즙하여 착즙물을 수득하는 단계; 상기 착즙물을 원심분리하여 필터링하는 단계; 상기 필터링한 용액 추가적인 원심분리 후 PEG(Polyehtylene glycol)에 용해시키는 단계; 및 상기 용해된 용액을 원심분리 후 완충액에 용해시키는 단계를 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
상기 감귤류는 껍질을 제거한 상태일 수 있다.
상기 필터링은 1차 및 2차 필터링하는 단계를 포함하고, 상기 2차 필터링 하는 단계는 직경 10nm ~ 50nm의 필터를 이용하여 필터링하는 것일 수 있다.
상기 방법에 의해 피부 미백 효능뿐만 아니라, 안전성, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능도 우수한, 피부 미백용 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예
1. 식용 식물의 엑소좀 스크리닝
엑소좀 스크리닝의 대상을 선정하기 위하여, Pubmed 검색을 통하여 혼합 추출물 형태라도 효능이 알려진 작물을 선정하고, 인 비트로(In vitro) 티로시나아제 시험법을 중심으로, 기타 작물의 엑소좀의 효능을 검사하였다. 하수오 및 어성초는 직접적인 식용 작물은 아니나, 우수한 효능이 기재된 논문에 의해 후보군에 포함하였다. 엑소좀 효능 검사의 대상이 된 식용 식물을 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
2. 식용 식물에서의 엑소좀의 분리방법
엑소좀은 초고속원심분리(ultracentrifugation)와 PEG 침전 방법(Peterson MF, Integrated systems for exosome investigation, Methods. 2015 Oct 1;87:31-45)으로 크게 나눌 수 있다. 식용작물 엑소좀의 복합 피부미용 효능를 검증하기 위한 엑소좀 분리는 기존 방법을 참고하였고, 어느 한 가지 방법보다는 초고속원심분리와 PEG 침전 방법을 혼용하였다.
1) 초고속 원심분리( ultracentrifugation )를 이용한 엑소좀 분리
각 식용 식물을 유기 세척제가 포함되지 않은 흐르는 물로 세척한 후 가정용 녹즙기를 이용하여 착즙하였다. 이때 오렌지와 같은 감귤류의 경우는 껍질을 제거하여 사용하였다. 착즙액은 저속 원심분리기를 사용하여, 6,000 x g 속도로 30분 원심분리를 한 후, 상층액만 별도로 30,000 x g 속도로 1시간 원심분리를 진행하였다.
상층액만을 별도로 0.8 ㎛와 0.2 ㎛의 필터를 사용하여 연속적으로 필터링을 진행하였다. 상기 필터된 용액을 100,000 x g 속도로 2시간 원심분리를 진행한 후 상층액을 버리고 침전된 부분을 인산완충액 (phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.5)에 용해하였다.
해당 용액을 100,000 x g 속도로 2시간 원심분리를 진행한 후 상층액을 버리고 남은 용액을 최대한 필터 페이퍼 또는 파이펫을 이용하여 제거하고, 침전된 부분인 엑소좀을 인산완충액에 용해하였다.
상기 분리되어 인산완충액에 용해된 엑소좀은 -80℃에서 보관하였다.
2) PEG(Polyethylene glycol)를 이용한 엑소좀 분리
각 식용 작물을 유기 세척제가 포함되지 않은 흐르는 물로 세척한 후 가정용 녹즙기를 이용하여 착즙하였다. 이때 오렌지와 같은 감귤류의 경우는 껍질을 제거하여 사용하였다. 착즙액은 저속 원심분리기를 사용하여, 6,000 x g 속도로 30분 원심분리를 한 후, 상층액만 별도로 30,000 x g 속도로 1시간 원심분리를 진행하였다.
PEG8000D을 최종농도 10%까지 추가하여 혼합한 후 12시간 동안 4℃ 보관하였다. 상기 혼합용액을 10,000 x g 1시간 원심분리를 진행한 후 상층액을 버리고, 침전된 부분을 인산완충액 (phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.5)에 용해하였다.
상기 분리된 식용 작물의 엑소좀의 크기 측정은 Nano-sight LM10 (Nanosight, UK) 기기를 이용하여, 제조사 프로토콜에 따라 측정하였다. 상기 기기는 나노 사이즈 물질에 레이저 광선 주사를 통하여 크기를 측정할 수 있다. 이 기기를 이용하여 크기 측정을 위해서는 고농도의 엑소좀을 PBS로 계속 희석시키며 적절한 농도를 확정한 이후에 사이즈 측정을 진행하였다.
3. 엑소좀의 안정성 및 성분 분석
1) 엑소좀 분리
각 식용 작물은 신선한 것을 구입하여 세척제 없이 흐르는 물에 수세미를 이용한 세척 후에 착즙기를 이용하여 착즙하였다. 착즙물은 미리 고압멸균 (autoclave)한 그릇에 수집하였고, 착즙액은 6,000 x g 속도로 30분 원심분리 실행하였다. 상층액은 새로운 멸균된 그릇으로 옮긴 이후 30,000 x g 속도로 1시간 원심분리 실행하였고, 상층액만을 별도로 0.8 ㎛와 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 연속적으로 필터링하였다.
상기 필터된 용액을 100,000 x g 속도로 2시간 원심분리한 후 상층액을 버리고 남은 용액을 최대한 필터 페이퍼나 파이펫을 이용하여 제거하고, 침전(엑소좀)된 부분을 인산완충액에 용해하였다.
도 4에는 오렌지 엑소좀의 추출 과정을 개략적으로 나타나 있다.
상기 분리 후 인산완충용액에 용해된 엑소좀은 BSA(bovine serum albumin)을 기준으로 한 브레드포드(Bradford) 단백질 정량법을 이용하여 정량하였다. 소량(500 ㎕)으로 분할된 엑소좀들은 각각 -20℃, 상온(20~25℃) 및 37℃ 인큐베이터에 보관하였다. 3일 (72시간) 이후 엑소좀 안정성 시험을 티로시나아제 억제제 스크리닝 키트(Tyrosinase Inhibitor Screening Kit, BioVision, Milpitas, California) 및 해당 상품의 프로토콜을 이용하여 진행하였다.
2) 엑소좀 안정성 분석
당일 분리된 엑소좀을 상온(~23℃), 37℃ 및 -20℃에서 24, 48, 72시간, 1주, 2주 및 4주간 방치하며, 매 정해진 시간별 동일한 티로시나아제(Tyrosinase) 억제시험을 3회 반복 수행하여 엑소좀 활성이 유지되는 정도 측정하였다.
도 5에는 상기 오렌지 엑소좀의 안정성 테스트 결과가 나타나 있다. 동일한 lot의 엑소좀에 대해 서로 다른 온도에 3일(72시간)간 보관하였을 때, 엑소좀 활성에는 유의한 차이를 보이지 않음이 확인되었다.
동일한 방법을 이용하여, 오이 및 감자에서 유래된 엑소좀의 안정성 테스트를 진행한 결과 오렌지와 같이, 안정성이 높음이 확인하였다.
4. 식용 식물 유래 엑소좀의 복합 피부미용 효능
1) 감귤류(citrus) 엑소좀 복합 피부미용 효능
식약처 가이드라인 기준에 맞춘 효능 검사를 실시하였다(http://www.mfds.go.kr/index.do). 기능성 화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인 내 ‘vitro tyrosinase 활성 저해시험’‘vitro DOPA 산화반응 저해시험’및 ‘멜라닌 생성 저해시험’규정에 따른 미백실험을 하였다. 또한, ‘피부의 주름개선에 도움을 주는 제품의 유효성 또는 기능을 입증하는 자료’의 규정 내 방법을 준수하여 주름개선 실험을 진행하였다.
본 출원인은 인체에 적용시 부작용이 최소화되는 동시에 인간질환의 치료가 가능한 “식용 작물 유래 엑소좀”의 효능에 관한 스크리닝을 하였다.
4개의 오렌지를 이용하여, 엑소좀 분리 수율이 300 ㎍의 엑소좀을 분리한 후 DLS를 이용하여 사이즈를 측정(직경 <200nm)하고, 피부미용의 효능을 나타내는 대표적인 3가지의 실험을 진행하였다.
상기 분리된 오렌지의 엑소좀의 크기 측정은 Nano-sight LM10 (Nanosight, UK) 기기를 이용하여, 제조사 프로토콜에 따라 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 오렌지 엑소좀의 사이즈는 30~150nm인 것이 나타났다(도 6의 A 참조).
(1) 티로시나아제( Tyrosinase ) 어세이
티로시나아제는 아미노산 타이로신(Tyrosine) 산화를 통하여 멜라닌 합성에 관여하는 것으로, 오렌지 엑소좀의 티로시나아제(tyrosinase) 억제 기능은 BioVision사의 티로시나아제 억제제 스크리닝 키트(Tyrosinase Inhibitor Screening Kit, Colorimetric)를 이용하여 진행되었고, 이때, 코직산(Kojic acid)은 양성대조군으로 사용되었다.
오렌지 엑소좀은 6, 12, 24 μM 농도를 처리하였을 때, 농도 의존적으로 티로시나아제(tyrosinase) 기능을 억제함을 보여주었다(도 6의 B 참조).
또한, 오렌지 엑소좀은 티로시나제 억제제인 코직산(kojic acid)의 활성농도인 10mM에 비해 매우 낮은 농도인 약 24μM에서 유사한 티로시나아제 억제기능을 보임을 확인하였다.
(2) 매트릭스 메탈로프로티나아제 (Matrix metalloproteinase1 , MMP-1 ) 어세이
매트릭스 메탈로프로티나아제는 콜라겐 I, II, III VII, VIII, X, 젤라틴(gelatin), 에타크틴(etaktyn), 아그리칸(agrecan)을 분해하여 피부노화 및 손상을 주는 효소이다.
오렌지 엑소좀의 MMP-1 억제 기능은 BioVision 사의 MMP-1 억제제 스크리닝 키트(MMP-1 Inhibitor Screening Kit, Fluorometric)를 이용하여 진행되었다. 피부탄성 유지제로 인정받은 바 있는 GM6001(Ilomastst)를 양성대조군으로 사용하였다.
4, 10, 20 및 40 μM 농도의 오렌지 엑소좀을 처리한 경우, 오렌지 엑소좀은 농도 의존적으로 MMP-1 기능을 억제함을 보여주었다(도 6의 C 참조). 상기 결과로부터 MMP-1 억제 효능을 보여 피부탄성 유지제로 개발 가능성이 큰 것으로 나타났다(도 6의 C 참조).
(3) 호중구 엘라스타제 (Neutrophil Elastase , NE) 어세이
호중구 엘라스타제는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)내의 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 프로테오글리칸(proteoglycans), 콜라겐(collagens) 및 엘라스틴(elastin) 등의 단백질들을 분해하여. 피부탄성 손실을 가져오고, 궁극적으로 주름살(wrinkle)을 생성한다고 알려져 있다.
오렌지 엑소좀의 엘라스타제 억제 기능은 BioVision 사의 호중구 엘라스타제 억제제 스크리닝 키트(Neutrophil Elastase Inhibitor Screening Kit, Fluorometric)를 이용하여 진행되었다. 7.2, 30, 150 μM 농도의 오렌지 엑소좀을 처리하였을 때, 엑소좀은 농도 의존적으로 엘라스타제(elastase) 기능을 억제함을 확인하였다(도 6의 D 참조). 상기 결과로부터, 오렌지 엑소좀은 주름살의 억제효능을 보일 수 있음을 알 수 있었다.
2) 다양한 식용 식물 유래 엑소좀의 복합 피부미용 효능 비교
상술한 방법에 의해 오렌지, 오이, 감자, 샐러리, 무우, 자몽 및 아스파라거스에서 각각 엑소좀을 분리하였다.
식약처 가이드라인 기준에 맞춘 효능 검사를 실시하였다(http://www.mfds.go.kr/index.do). 기능성 화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인 내 ‘vitro tyrosinase 활성 저해시험’‘vitro DOPA 산화반응 저해시험’및 ‘멜라닌 생성 저해시험’규정에 따른 미백실험을 하였다. 또한, ‘피부의 주름개선에 도움을 주는 제품의 유효성 또는 기능을 입증하는 자료’의 규정 내 방법을 준수하여 주름개선 실험을 진행하였다.
(1) 티로시나아제( Tyrosinase ) 어세이
다양한 식용 식물 유래 엑소좀의 티로시나아제(tyrosinase) 억제 기능은 각각의 20μM의 엑소좀들로 BioVision사의 티로시나아제 억제제 스크리닝 키트(Tyrosinase Inhibitor Screening Kit, Colorimetric)를 이용하여 진행되었고, 이때, 코직산(Kojic acid)은 양성대조군으로 사용되었다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 일 실시예에 따른 오렌지, 오이, 감자 및 이외 기타 식용 식물 유래의 엑소좀의 티로시나아제 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 각 식용 식물 유래 엑소좀들은 상이한 활성을 나타내고, 감자, 오이, 및 오렌지가 특히 티로시아나제 억제 활성이 높은 것으로 나타났다.
(2) 매트릭스 메탈로프로티나아제 (Matrix metalloproteinase1 , MMP -1) 어세이
다양한 식용 식물 유래 엑소좀의 MMP-1 억제 기능은 각각의 20μM의 엑소좀들로 BioVision사의 MMP-1 억제제 스크리닝 키트(MMP-1 Inhibitor Screening Kit, Fluorometric)를 이용하여 진행하였다. 피부탄성 유지제로 인정받은 바 있는 GM6001(Ilomastst)를 양성대조군으로 사용하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8은 일 실시예에 따른 오렌지, 오이, 감자 및 이외 기타 식용 식물 유래의 엑소좀의 MMP-1 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 각 식용 식물 유래 엑소좀들은 상이한 활성을 나타내고, 감자, 오이, 및 오렌지가 MMP-1 억제 활성이 높은 것으로 나타났다.
(3) 호중구 엘라스타제(Neutrophil Elastase, NE) 어세이
다양한 식용 식물 유래 엑소좀의 엘라스타제 억제 효능은 각각의 20μM의 엑소좀들로 BioVision사의 호중구 엘라스타제 억제제 스크리닝 키트(Neutrophil Elastase Inhibitor Screening Kit, Fluorometric)를 이용하여 진행되었다.
그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9는 일 실시예에 따른 오렌지, 오이, 감자 및 이외 기타 식용작물 유래의 엑소좀의 호중구 엘라스타제 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 9에 나타난 바와 같이, 각 식용 식물 유래 엑소좀들은 상이한 활성을 나타내고, 감자가 엘라스타제 억제 효능이 높은 것으로 나타났다.
상기 결과들로부터, 본 발명의 오렌지, 오이 및 감자의 엑소좀은 다른 식용식물, 특히 미백 등의 효능가 높다고 평가된 아스파라거스보다 피부미백, 주름살 억제효능 및 피부탄성 효능가 훨씬 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 오렌지, 오이, 및 감자의 엑소좀은 화학처리 또는 열처리 없이 분리되어 안전하고, 피부 미백뿐만 아니라 피부탄성, 및 주름살 억제 등의 다양한 효능을 나타낸다.
이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량할 수 있음이 명백하다. 본 발명의 단순한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (13)

  1. 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 감귤류는 오렌지 또는 레몬인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능 중 1 이상을 더 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 50 ~ 500 ㎍/㎖로 포함되는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 1 X 107~ 1 X 1012/ml의 입자수로 포함되는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀의 직경은 10nm ~ 300nm인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 열처리 없이 분리된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  8. 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 피부 미백, 피부탄력 증진 및 주름살 억제 효능 중 1 이상을 포함하는, 식품 조성물.
  10. 감귤류(citrus), 오이, 및 감자 중 1종 이상을 착즙하여 착즙물을 수득하는 단계;
    상기 착즙물을 원심분리하여 필터링하는 단계;
    필터링한 용액을 원심분리 후 침전물을 완충액에 용해하는 단계; 및
    상기 용해된 용액을 -30 ~ -100℃에 보관하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
  11. 감귤류(citrus), 오이 또는 감자를 착즙하여 착즙물을 수득하는 단계;
    상기 착즙물을 원심분리하여 필터링하는 단계;
    필터링한 용액 추가적인 원심분리 후 PEG(Polyehtylene glycol)에 용해시키는 단계; 및
    상기 용해된 용액을 원심분리 후 완충액에 용해시키는 단계를 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 감귤류는 껍질을 제거한 상태인, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 필터링은 1차 및 2차 필터링하는 단계를 포함하고,
    상기 2차 필터링 하는 단계는 직경 10nm ~ 50nm의 필터를 이용하여 필터링하는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
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