KR102523528B1 - 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자몽, 동백꽃 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초고압처리와 UV 전처리 및 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 자몽 엑소좀 및/또는 동백꽃 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 보습, 피부장벽강화, 주름개선, 항산화 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초고압처리와 UV 전처리 및 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 자몽 엑소좀 및/또는 동백꽃 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 보습, 피부장벽강화, 주름개선, 항산화 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
화장품의 기능은 청결과 단순한 메이크업을 지나, 공해 물질, 스트레스, 자외선, 활성산소, 과산화물 등의 피부 노화 원인을 제거하거나 억제하는 것으로 확장되어 왔다. 최근 들어 안전한 천연물을 소재로 하여 피부 주름을 개선하고, 피부 자극 및 염증을 완화시켜 주는 화장료의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
본 발명에서 "엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.
최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.
이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 용해도 및 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.
본 발명자들은 다양한 방법을 적용하여 우수한 피부 상태 개선 활성을 나타내는 식물 유래 엑소좀을 제조하고 이를 화장료로 이용하기 위해 노력하였으며, 그 결과 특정한 조건에서의 초고압처리 및 UV 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 자몽 엑소좀 및/또는 동백꽃 엑소좀이 우수한 피부 개선 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며 보습, 피부장벽강화, 주름개선, 항산화 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 자몽 엑소좀 또는 동백꽃 엑소좀의 정제방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
상기 유효성분으로서의 자몽 엑소좀과 동백꽃 엑소좀은,
(A) 자몽 또는 동백꽃을 초고압 처리하는 단계; (B) 초고압 처리한 자몽 또는 동백꽃에 UV-A를 1~6시간 처리하는 단계; (C) UV 처리한 자몽 또는 동백꽃을 착즙하는 단계; (D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것이다.
상기 (A) 단계에서의 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로, 바람직하게는 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 하며, 상기 (B) 단계에서의 UV 처리는 365nm 파장의 UV-A로 6시간 동안 수행한다.
유효성분으로서의 상기 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0%(w/w) 함유된다.
상기 화장료 조성물은 보습용, 피부장벽강화용, 주름개선용 또는 항산화용임을 특징으로 한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,
(A) 자몽 또는 동백꽃을 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 초고압 처리하는 단계;
(B) 초고압 처리한 자몽 또는 동백꽃에 UV-A를 1~6시간 처리하는 단계;
(C) UV 처리한 자몽 또는 동백꽃을 착즙하는 단계;
(D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
(E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;
(F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및
(G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 자몽 또는 동백꽃 엑소좀의 정제방법이 제공된다.
상기 (A) 단계에서의 초고압 처리는 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 하며, 상기 (B) 단계에서의 UV 처리는 365nm 파장의 UV-A로 6시간 동안 수행하는 것임을 특징으로 한다.
초고압처리 및 UV 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 안정성이 우수하며, 우수한 보습 효과, 피부장벽강화 효과, 주름개선 효과 및 항산화 효과를 나타내므로 피부개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 자몽 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 동백꽃 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 자몽 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 동백꽃 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 피부장벽 강화 효능을 filaggrin 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 COL1A1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 MMP-1 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 동백꽃 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 자몽 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 동백꽃 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 피부장벽 강화 효능을 filaggrin 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 COL1A1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 의해 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 MMP-1 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 초고압처리 및 UV 조사의 전처리를 통하여 자몽, 동백꽃으로부터 피부 개선활성이 우수한 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.
자몽(Citrus Paradisi, Grapefruit)은 감귤속에 속하는 그레이프프루트 나무의 열매이다. 자몽은 나무가 비교적 크고, 눈에 띄는 날개형 잎자루가 있는 잎이 있으며 향기 나는 하얀 꽃이 피며 커다란 둥근 열매가 포도처럼 작은 다발로 열린다. 과육은 옅은 노란색으로 즙액이 풍부하고 맛은 시면서도 단맛이 강하며 쓴맛이 조금 있다. 열매의 지름은 100mm 이상이 되는 크기로 열매 중에서도 큰 편에 속한다. 자몽은 각종 항산화 성분이 풍부한 웰빙 간식거리부터 요리 재료, 피부 보호, 방충 등 다양하게 사용되고 있다. 자몽은 비타민 C, 비타민 A, 칼륨, 식이섬유가 풍부하다. 비타민 C 함유량은 레몬 다음으로 높다. 섭취 후 체내에서 비타민 A로 전환되는 베타카로틴도 풍부하며 자몽에 다량 함유되어 있는 라이코펜은 색소 성분이자 항산화 성분이어서 항암과 눈 관련 질환의 예방에 도움이 된다. 또한 비타민 C, 비타민 E가 면역 체계 유지에 기여하고 상처치유, 신진대사 촉진에 중요한 역할을 하며 신경 간 의사소통과 함께 콜라겐 생성에도 관여하고 있다. 이러한 항산화 성분은 피부에 쌓여 피부 손상, 변색 등을 일으키는 활성산소를 없앤다. 여드름 치료에 효과를 주는 살리실산도 많이 포함되어 있어 좋은 피부 유지에 도움을 준다.
동백꽃(Camellia japonica flower)은 동백나무의 꽃으로, 동백나무는 일본이 원산지로 알려진 차나무과에 속하는 상록교목이다. 기본적으로 낙엽이 잘 안지는 상록수 계열이면서도 잎이 타원형으로 제법 넓다. 다른 나무들에 비해 잎이 두껍고 반짝거리며, 어린잎의 경우 특히 연두빛이 섞인 맑은 녹색으로 빛난다. 겨울에 꽃이 핀다고 하여 동백이라는 이름이 붙여졌다. 동백꽃은 대표적인 조매화로 동박새가 꽃가루를 옮겨주기 때문에 벌과 나비가 활동하지 않는 겨울에도 꽃을 피워 열매를 맺을 수 있다. 동백꽃은 흔히 붉은색이지만 흰색 꽃이 피는 흰동백, 분홍동백, 애기 동백나무 등이 있다. 동백꽃은 하얀 눈 속에서도 강렬한 붉은색의 아름다움도 있지만 꽃과 잎, 열매 모두가 융용한 성분들과 다양한 효능을 가지고 있어 버릴 게 없다고 알려져 있다. 항산화, 항염, 해독, 구풍, 심장보호, 간보호, 면역강화효과로 잘 알려져 있으며 또한 열매에서 얻은 동백기름은 피부 재생을 촉진하고 상처와 화상치료, 두피 건강에도 좋아서 오랫동안 머릿기름으로도 사용되었다. 동백꽃에는 올레산과 리놀레산, 스쿠알렌, 비타민 E, 비타민 A 등의 항산화 성분과 비타민, 미네랄을 포함한 노화 방지 영양소가 풍부하여 탁월한 연화제 및 항산화 특성이 있다. 또한 타닌, 카멜리아겐, 류코시아니딘 등의 성분을 함유하고 있으며 지혈 효과가 뛰어나고 인후통과 아토피 개선에도 도움이 된다.
본 발명 화장료 조성물의 유효성분으로서의 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀은 다음과 같은 방법으로 정제된다.
(A) 자몽 또는 동백꽃을 초고압 처리하는 단계; (B) 초고압 처리한 자몽 또는 동백꽃에 UV-A를 1~6시간 처리하는 단계; (C) UV 처리한 자몽 또는 동백꽃을 착즙하는 단계; (D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된다.
본 발명에서는 피부개선활성이 우수한 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 제조하기 위하여 먼저 원물에 초고압 처리 및 UV 조사의 전처리를 수행한다.
식물의 경우 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비특성이 달라질 수 있으며 특히 식물이 스트레스를 받았을 때 엑소좀의 분비량에 영향을 줄 수 있다. 따라서 식물이 엑소좀을 분비하는 최적의 조건을 확인하기 위해 다양한 전처리를 통해 그 수율과 피부개선활성을 확인하였으며, 자몽, 동백꽃은 전처리로서 초고압처리 및 UV 조사처리를 수행하는 경우에 엑소좀의 분비가 증가하며, 피부개선활성이 증가한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 (A) 단계에서 초고압 전처리는 자몽 또는 동백꽃을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa 이상의 압력으로 20초~2분간 초고압 처리를 하여 수행한다.
이어서, 초고압 전처리된 자몽, 동백꽃을 UV-A 파장, 더욱 바람직하게는 365nm 파장의 UV-A에 1~6시간 동안 노출시킨다.((A), (B) 단계).
상기 (C) 단계에서 착즙하는 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (D) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 (E) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50 ~ -80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.
엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueous two phase partition method)을 사용하였다.
수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.
상기 (F) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량%: 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.
엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (G)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.
이와 같은 방법에 의하여 제조된 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀은 일반 자몽 추출물, 동백꽃 추출물과 비교하여, 그리고 전처리를 수행하지 않고 정제한 엑소좀과 비교하여 우수한 보습 효과(시험예 7), 피부장벽강화 효과(시험예 8, 시험예 12), 주름개선 효과(시험예 9, 시험예 10, 시험예 13), 항산화 효과(시험예 11)를 나타내었다.
그러므로 상기 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀은 보습용, 피부장벽강화용, 주름개선용, 항산화용 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 이때 상기 유효성분으로서의 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀 또는 그 혼합엑소좀은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스, 립스틱 등으로 제조될 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
실시예 1: 자몽 엑소좀의 제조
자몽 초고압 처리
자몽 100g을 비닐 팩에 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 25℃의 온도에서 200Mpa의 압력으로 30초간 초고압 처리를 실행하였다.
자몽 UV-A 처리
초고압 처리한 자몽에 365nm 파장의 UV-A를 6시간동안 처리하였다.
자몽 착즙
UV 처리한 자몽을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 자몽 착즙을 수행하였으며 수득한 자몽 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 자몽 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
엑소좀 정제를 위한 상층액 회수
자몽 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.
상층액 동결건조
엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.
수성 2상계 형성
동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG(Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran(Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.
자몽 엑소좀의 회수
상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.
추가 세척 공정
순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.
실시예 2: 동백꽃 엑소좀의 제조
상기 실시예 1과 동일하게 하여 동백꽃 유래 엑소좀을 정제하였다.
실시예 3: 자몽, 동백꽃 혼합 엑소좀의 제조
상기 실시예 1, 2에서 제조한 자몽 엑소좀과 동백꽃 엑소좀을 동일 중량비율로 혼합하여 혼합 엑소좀을 제조하였다.
실시예 4~15: 자몽, 동백꽃 엑소좀의 제조
식물의 경우 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비특성이 달라질 수 있다. 식물이 엑소좀을 분비하는 최적의 조건이 모두 다르기 때문에 초고압 및 UV 처리 스트레스에 의한 엑소좀의 수율 비교를 통해 최적의 전처리 조건을 확립하기 위해 자몽과 동백꽃의 UV 처리 조건을 달리하여 엑소좀을 정제하였다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 초고압처리 유무와 UV 처리 조건을 달리하여 상기 실시예 1과 동일하게 엑소좀을 정제하였다. 실시예 4와 실시예 10은 자몽과 동백꽃을 초고압처리와 UV 전처리 없이 바로 착즙하여 수성 2상 시스템을 적용하여 정제하였다.
| 원물 | 초고압처리 유무 | UV 처리 조건(hr) | |
| 실시예 4 | 자몽 | X | X |
| 실시예 5 | 자몽 | ○ | 3 |
| 실시예 6 | 자몽 | ○ | 1 |
| 실시예 7 | 자몽 | X | 6 |
| 실시예 8 | 자몽 | X | 3 |
| 실시예 9 | 자몽 | X | 1 |
| 실시예 10 | 동백꽃 | X | X |
| 실시예 11 | 동백꽃 | ○ | 3 |
| 실시예 12 | 동백꽃 | ○ | 1 |
| 실시예 13 | 동백꽃 | X | 6 |
| 실시예 14 | 동백꽃 | X | 3 |
| 실시예 15 | 동백꽃 | X | 1 |
비교예 1: 자몽 추출물 제조
자몽 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 자몽 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.
비교예 2: 동백꽃 추출물 제조
동백꽃 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 동백꽃 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.
시험예 1: 자몽 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석
정제한 자몽 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 자몽 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 200nm의 입자의 존재를 확인하였다.
시험예 2: 동백꽃 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석
정제한 동백꽃 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 2는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 동백꽃 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 160nm의 입자의 존재를 확인하였다.
시험예 3: 자몽 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석
정제한 자몽 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다.
도 3은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 자몽 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 198.4nm와 1 mL의 단위 부피당 7.10 × 1010 개의 농도를 확인하였다.
시험예 4: 동백꽃 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석
정제한 동백꽃 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다.
도 4는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 동백꽃 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 166.8nm와 1 mL의 단위 부피당 6.80 × 1010 개의 농도를 확인하였다.
시험예 5: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 수율 비교
초고압처리 및 UV 처리의 최적 조건을 확인하기 위해 상기 실시예 1, 2 및 4~15에 따라 정제한 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 수율을 비교하였다. 하기 표 2는 수율 비교를 나노입자추적분석(NTA) 결과로 나타낸 표이다.
| 번호 | Particle Number (Particles/ml) |
Particle Size (nm) |
| 실시예 1 | 7.10 x 1010 | 198.4 |
| 실시예 2 | 6.80 x 1010 | 166.8 |
| 실시예 4 | 2.60 x 108 | 189.7 |
| 실시예 5 | 9.70 x 109 | 195.3 |
| 실시예 6 | 1.00 x 1010 | 190.6 |
| 실시예 7 | 6.60 x 109 | 189.4 |
| 실시예 8 | 1.70 x 109 | 188.7 |
| 실시예 9 | 2.40 x 109 | 189.6 |
| 실시예 10 | 3.20 x 108 | 166.5 |
| 실시예 11 | 1.30 x 1010 | 164.1 |
| 실시예 12 | 9.90 x 109 | 166.7 |
| 실시예 13 | 5.90 x 109 | 160.4 |
| 실시예 14 | 2.20 x 109 | 162.6 |
| 실시예 15 | 3.70 x 109 | 167.9 |
상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 초고압 처리 후 UV 처리를 했을 때(실시예 5, 6, 11, 12) 높은 수율을 나타내었으며, 그 중에서도 UV를 6시간 동안 처리한 조건인 실시예 1, 2에서 엑소좀의 수율이 가장 높았다. 실시예 4와 실시예 10의 결과로 보았을 때 초고압 처리 및 UV 전처리를 수행하지 않은 엑소좀의 경우 가장 낮은 수율을 보였다. 이는 전처리 조건이 엑소좀의 수율에 큰 영향을 주는 것으로 나타내며, 가장 최적의 조건은 초고압 전처리 후 UV-A 6시간 처리임을 확인하였다.
시험예 6: 세포독성 평가
자몽 엑소좀(실시예 1, 실시예 4), 동백꽃 엑소좀(실시예 2, 실시예 10) 및 그 혼합엑소좀(실시예 3)과 자몽 추출물(비교예 1), 동백꽃 추출물(비교예 2)의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96well 플레이트에 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 1×105 cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지에 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 농도 별로 투여하고 다시 24시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution(5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는 상기 시료들의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀, 자몽과 동백꽃 혼합 엑소좀 및 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.
시험예 7: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 보습 효능 평가(AQP3 발현)
자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 보습 효능을 확인하기 위해 용매 추출물과 비교하여 AQP3 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 표피 각질 세포주(human keratinocyte, HEKa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 처리하고 48시간 배양하였다. 배양 후에 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 세포의 수분 이동에 관여하는 보습 인자이며 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3(Aquaporin 3)의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며, 양성 대조군으로는 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였다. 도 6은 상기 실시예 1, 2, 3, 4, 및 10에 따라서 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀 및 그 혼합엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자몽 엑소좀과 동백꽃 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 AQP3의 발현이 증가하였으며 자몽 추출물과 동백꽃 추출물을 처리하였을 때보다 더 높은 보습 효과가 있음을 확인하였다. 자몽과 동백꽃 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 가장 높은 보습 효과를 확인할 수 있었으며, 양성 대조군인 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였을 때는 136.7% 발현율을 보였다.
시험예 8: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 피부장벽강화 효능 평가(filaggrin 발현)
피부 장벽 단백질은 피부 구조를 이루고 있는 중요한 요소로 외부 항원이 체내 안으로 유입되는 것을 차단하는 중요한 역할을 한다. 피부 장벽 단백질의 종류로는 filaggrin, involucrin, loricrin이 있으며, 이중 filaggrin은 각질형성세포 내에서 케라틴 필라멘트를 응집하여 피부 장벽에 중요한 역할을 담당한다. 따라서 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 피부장벽강화 효능을 확인하기 위해 일반 용매 추출물과 비교하여 filaggrin 유전자 발현 시험을 진행하였다. 사람의 표피 각질 세포주(human keratinocyte, HEKa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 처리하고 48시간 배양하였다. 그 후 배양된 세포들을 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하였고 PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 CaCl2 20mM을 처리하였다.
도 7은 상기 실시예에 따라서 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀과 그 혼합 엑소좀의 피부장벽강화 효능을 filaggrin 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자몽 유래 엑소좀과 동백꽃 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 filaggrin 발현이 증가하였으며, 자몽 추출물과 동백꽃 추출물을 처리하였을 때보다 훨씬 더 높은 증가율을 확인하였다. 또한 자몽과 동백꽃 혼합 엑소좀을 처리하였을 때도 높은 증가율을 나타냄을 확인하였다. 양성 대조군인 CaCl2 20mM 처리하였을 때는 131.9% 발현율을 보였다.
시험예 9: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능 평가(COL1A1 발현)
자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 COL1A1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium (Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀, 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 각각 처리하고 48시간 배양하였다. 배양 후에 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 피부 연결 조직을 유지시키는 collagen의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였다.
도 8은 상기 실시예에 따라서 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀과 그 혼합 엑소좀의 주름개선 효능을 COL1A1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자몽 유래 엑소좀과 동백꽃 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 COL1A1의 발현이 증가하였으며 자몽 추출물과 동백꽃 추출물을 처리하였을 때보다 더 높은 주름개선 효과가 있음을 확인하였다. 자몽과 동백꽃 혼합 엑소좀을 처리하였을 때도 주름개선 효과가 우수함을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Retinyl palmitate 50mM을 처리하였을 때는 149.4% 발현율을 보였다.
시험예 10: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능 평가 (MMP-1 발현)
자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium (Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀, 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 각각 처리하고 48시간 배양하였다. 세포 손상을 유도하기 위해 UVB 비조사군을 제외한 나머지 배양된 세포군에 배지를 제거한 뒤 UVB 20 mJ/cm2를 조사하고 새로운 배지로 교체 후 24시간 배양하였다. 24시간 후에 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 피부 노화 및 주름 생성과 관련 있는 MMP-1의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel 에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였다.
도 9는 상기 실시예에 따라서 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀과 그 혼합 엑소좀의 주름개선 효능을 MMP-1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자몽 유래 엑소좀과 동백꽃 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 MMP-1 발현이 감소하였으며 자몽 추출물과 동백꽃 추출물을 처리하였을 때보다 더 높은 주름개선 효과가 있음을 확인하였다. 자몽과 동백꽃 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 더욱 우수한 주름개선 효과를 나타내었다. 양성 대조군인 Retinyl palmitate 50μM을 처리하였을 때는 69.3% 발현율을 보였다.
시험예 11: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 항산화 효능 평가(DPPH 라디칼 소거 활성)
자몽 유래 엑소좀, 동백꽃 유래 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀의 항산화 효능을 확인하기 위해 각각의 추출물과 비교하여 DPPH 라디칼 소거 활성 시험을 진행하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력으로 측정하였다. DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 시약을 에탄올에 용해하여 0.4mM 용액을 제조하였으며 96 well plate에 농도별로 준비된 시료(엑소좀, 추출물) 또는 양성 대조군인 BHT (Butylated hydroxyl toluene 또는 2,6-Di-tert-butyl-p-cresol)를 에탄올에 용해한 용액 100㎕와 0.4 mM DPPH 용액 100㎕을 넣고 혼합하였다. 이때 음성 대조군으로는 에탄올을 처리하였으며 혼합 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였으며 아래 계산식을 이용하여 시료 또는 양성대조군인 BHT의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거능(%) = {1-(양성 대조군 또는 시료의 흡광도/대조군의 흡광도)} × 100
표 3은 각 시료의 항산화 효과를 DPPH 라디칼 소거능으로 평가한 결과를 나타낸 표이다.
| Concentration (%) | DPPH 라디칼 소거활성(%) | ||||||
| 실시예 1 | 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | 실시예 10 | 비교예 1 | 비교예 2 | |
| 0.01 | 17.6 | 15.1 | 21.4 | 9.0 | 7.6 | 6.8 | 8.1 |
| 0.1 | 40.3 | 39.8 | 47.3 | 30.6 | 27.8 | 27.6 | 30.8 |
| 1 | 54.9 | 52.6 | 64.5 | 48.3 | 45.1 | 44.9 | 47.4 |
| BHT (0.01%) | 69.33 | ||||||
시험 결과, 자몽 유래 엑소좀, 동백꽃 유래 엑소좀과 자몽 추출물, 동백꽃 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으며 용매 추출물에 비해 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 처리하였을 때 활성이 더 증가됨을 확인하였다. 또한 자몽과 동백꽃 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
제형예 1~3: 크림의 제조
하기 표 4의 조성으로 상기 실시예에 따라서 정제된 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 비교예 1의 자몽 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 1로 하고 비교예 2의 동백꽃 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 2로 하였다.
| 성분 | 제형예 1 | 제형예 2 | 제형예 3 | 비교 제형예 1 |
비교 제형예 2 |
| 함량(중량 %) | |||||
| 자몽 엑소좀(실시예 1) | 5 | - | - | - | - |
| 동백꽃 엑소좀(실시예 2) | - | 5 | - | - | - |
| 자몽 + 동백꽃 엑소좀(실시예 3) | - | - | 5 | - | - |
| 자몽 추출물(비교예 1) | - | - | - | 5 | - |
| 동백꽃 추출물(비교예 2) | - | - | - | - | 5 |
| 글리세린 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 부틸렌글라이콜 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 글리세릴올리에이트 | 1.8 | 1.8 | 1.8 | 1.8 | 1.8 |
| 세테아릴올리베이트 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 솔비탄올리베이트 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 세틸에틸헥사노에이트 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 비즈왁스 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 스쿠알란 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 1,2-헥산다이올 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 디메치콘 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 세티아릴알코올 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 미네랄 오일 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 디소듐이디티에이 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 비에이치티 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 토코페릴아세테이트 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 판테놀 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 에칠헥실메톡시신나메이트 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 향 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 |
시험예 12: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 경피 수분 증발 억제 효과
자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 경피 수분 증발 억제 효과를 확인하기 위해 투와미터(Tewameter, Courage&Khazaka)를 사용하였다. 피부가 건조한 30세~40세의 남녀 성인 20명을 대상으로 왼쪽 팔 하부 안쪽에 구획을 나누고 경피 수분 손실량을 각 구획 당 3회씩 측정 한 후 제형예 1~3 및 비교제형예 1, 2를 1일 2회씩 5일간 도포하고, 경피수분증발량(Transepidermal Water Loss;TEWL)을 측정하였다. 측정은 실내온도 24±2℃, 상대 습도 40±2%의 항온 항습실에서 실시하였고 각 조건당 3회씩 측정하여 얻어진 평균값을 사용하였다. 결과값은 시료를 도포하기 전 경피 수분 손실량을 100% 기준으로 하여 도포 3일 후, 5일 후에 따른 수분 증발량을 나타내었다. 표 5는 상기 제형예에 따라 제조된 크림의 경피 수분 증발 억제 효과를 평가한 결과를 나타낸 표이다.
| 수분 증발량(%) | |||
| 초기 | 도포 3일 후 | 도포 5일 후 | |
| 제형예 1 | 100 | 73 | 49 |
| 제형예 2 | 100 | 76 | 51 |
| 제형예 3 | 100 | 65 | 42 |
| 비교제형예1 | 100 | 87 | 65 |
| 비교제형예2 | 100 | 84 | 61 |
상기 표 5의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀, 자몽, 동백꽃 혼합 엑소좀이 포함된 크림에서 우수한 경피 수분 억제 효과를 확인하였다.
시험예 13: 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 평가
자몽 엑소좀(실시예 1), 동백꽃 엑소좀(실시예 2) 및 그 혼합 엑소좀(실시예 3)의 주름 개선 효능을 확인하기 위해 30 ~ 50대의 성인 여성 20명을 대상으로 상기 제형예에서 제조된 크림을 얼굴 양쪽면에 바르고, LED 광원장치로 633nm의 적색광을 6주간 누적 시간 24시간 조사한 후, 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
표 6은 상기 실시예에 따라서 정제된 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀의 주름개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가한 결과를 나타낸 표이다.
| 주름개선효과 | |||
| 우수 | 약간 | 없음 | |
| 제형예 1 | 7 | 10 | 3 |
| 제형예 2 | 8 | 8 | 4 |
| 제형예 3 | 11 | 8 | 1 |
| 비교제형예1 | 1 | 2 | 17 |
| 비교제형예2 | 2 | 4 | 14 |
상기 표 6의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀과 자몽, 동백꽃 혼합 엑소좀이 포함된 크림에서 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다.
Claims (11)
- 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 있어서,
상기 유효성분으로서의 자몽 엑소좀과 동백꽃 엑소좀은,
(A)자몽 또는 동백꽃을 초고압 처리하는 단계; (B)초고압 처리한 자몽 또는 동백꽃에 UV-A를 1~6시간 처리하는 단계; (C)UV 처리한 자몽 또는 동백꽃을 착즙하는 단계; (D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (A) 단계에서의 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 (B) 단계에서의 UV 처리는 365nm 파장의 UV-A로 6시간 동안 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 자몽 엑소좀, 동백꽃 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽 강화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020220126475A KR102523528B1 (ko) | 2022-10-04 | 2022-10-04 | 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102523528B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102671639B1 (ko) * | 2023-11-14 | 2024-06-03 | 주식회사 에이바이오머티리얼즈 | 울릉국화, 은행잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170003000A (ko) * | 2015-06-30 | 2017-01-09 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법 |
| KR20170037380A (ko) * | 2015-09-25 | 2017-04-04 | (주)프로스테믹스 | 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물 |
| KR20200002496A (ko) * | 2018-06-29 | 2020-01-08 | 엑소메드 주식회사 | 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물 |
| KR102125567B1 (ko) | 2019-07-02 | 2020-06-22 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 식물 엑소좀의 대량 생산 방법 |
| KR102265811B1 (ko) | 2021-04-09 | 2021-06-16 | 주식회사 에이바이오머티리얼즈 | 분산성 및 안정성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 |
| KR20220122577A (ko) | 2020-09-22 | 2022-09-02 | 주식회사 바이오솔루션 | 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법 |
-
2022
- 2022-10-04 KR KR1020220126475A patent/KR102523528B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20170003000A (ko) * | 2015-06-30 | 2017-01-09 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법 |
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| KR20200002496A (ko) * | 2018-06-29 | 2020-01-08 | 엑소메드 주식회사 | 식용 식물 유래 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물 |
| KR102125567B1 (ko) | 2019-07-02 | 2020-06-22 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 식물 엑소좀의 대량 생산 방법 |
| KR20220122577A (ko) | 2020-09-22 | 2022-09-02 | 주식회사 바이오솔루션 | 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법 |
| KR102265811B1 (ko) | 2021-04-09 | 2021-06-16 | 주식회사 에이바이오머티리얼즈 | 분산성 및 안정성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102671639B1 (ko) * | 2023-11-14 | 2024-06-03 | 주식회사 에이바이오머티리얼즈 | 울릉국화, 은행잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 |
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