KR102413205B1

KR102413205B1 - 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 보습, 피부진정, 항염, 세포재생 및 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102413205B1
Application number: KR1020220044523A
Authority: KR
Inventors: 윤은정; 박시준; 김정수; 김현민; 조진성; 심성보; 김성훈; 임승록; 박혜린
Original assignee: 주식회사 에이바이오머티리얼즈; (주)더마펌
Priority date: 2022-04-11
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2022-06-24

Abstract

본 발명은 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 열풍건조 처리, 효소처리 및 초음파 처리의 전처리 공정을 수행한 후, 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며, 피부 보습 효과, 피부진정 효과, 피부 항염 효과, 세포재생 효과, 주름개선 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 보습, 피부진정, 항염, 세포재생 및 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin moisturizing, soothing, anti-inflammation, skin cell regeneration and anti-wrinkle containing Perilla Frutescens exosome, Eucalyptus Globulus exosome}

본 발명은 자소엽, 유칼립투스 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 열풍건조 처리, 효소 처리 및 초음파 처리의 전처리 공정 수행 후, 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 보습, 피부진정, 항염, 세포재생, 주름개선 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품의 기능은 청결과 단순한 메이크업을 지나, 공해 물질, 스트레스, 자외선, 활성산소, 과산화물 등의 피부 노화 원인을 제거하거나 억제하는 것으로 확장되어 왔다. 피부는 각종 환경오염과 스트레스에 노출되어 거칠어지고 건조해지며, 칙칙하게 보이는 등 피부 노화가 가속되고 있으며 이러한 현상은 피부의 수분공급 및 유지와 밀접한 관련이 있다. 피부 건조는 수분 손실에 따른 각질세포의 응집력 저하, 즉 피부장벽의 기능 이상에서 비롯된다. 또한 전 세계적으로 고령화 사회로 진입함에 따라 피부 노화 방지를 위한 화장품의 시장이 지속적으로 증가하고 있으며 현대 여성들에게 깨끗하고 건강한 피부를 갖고자 하는 것이 큰 관심사가 되어 최근 들어서는 안전한 천연물을 소재로 하여 피부 주름을 개선하고, 피부 자극 및 염증을 완화시켜 주며 보습 효과가 우수한 화장료의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

본 발명에서 "엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.

최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며 이의 항산화, 항염 등의 피부 효능에 대해서도 연구가 시작되고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.

이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 용해도 및 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.

본 발명자들은 다양한 방법을 적용함으로써 수율이 우수할 뿐 아니라 피부 개선 활성 및 제형내 분산안정성이 우수한 식물유래 엑소좀을 제조하기 위하여 노력하여 왔다. 그 결과 자소엽, 유칼립투스를 열풍 건조 처리, 효소 처리 및 초음파 처리의 전 처리 공정을 수행한 후, 수성 2상 시스템을 적용하면 안정성이 우수하며 우수한 보습 효과, 피부진정 효과, 항염 효과, 세포재생 효과 및 피부주름개선 효과를 나타내는 식물 유래 엑소좀이 얻어진다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-2125567호(2020.06.16) (0002) 대한민국 등록특허 제10-2265811호(2021.06.16.) (0003) 대한민국 공개특허 제10-2017-0031386호(2017.03.21)

본 발명은 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며 보습, 피부진정, 항염, 세포재생 및 주름개선 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

바람직하게는 상기 자소엽 엑소좀 또는 유칼립투스 엑소좀은, (A)자소엽 또는 유칼립투스 잎을 40~60℃, 20~24시간 열풍건조 처리하는 단계; (B)열풍건조 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎에 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 펙티나제(pectinase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 가하고 40~50℃, pH 4.5~5.0 조건에서 1~3시간 반응시키는 효소처리 단계; (C) 효소 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계; (D) 초음파 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 착즙하는 단계; (E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것이다.

더욱 바람직하게는 상기 열풍건조 처리는 50℃의 온도에서 24시간 동안 수행하는 것임을 특징으로 하며 초음파 처리는 25℃의 온도에서 30분 동안 수행하는 것임을 특징으로 한다.

유효성분으로서의 상기 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0%(w/w) 함유된다.

상기 혼합 엑소좀은 자소엽 엑소좀과 유칼립투스 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것이다.

상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 피부 진정용, 피부 염증개선용, 피부 세포재생용, 피부 주름개선용임을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스 등의 제형을 가지는 것임을 특징으로 한다.

다양한 식물 전처리(열풍건조 처리와 효소 및 초음파 처리)와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 안정성이 우수하며, 우수한 보습 효과, 피부진정 효과, 항염 효과, 세포재생 효과, 주름개선 효과를 나타내므로 피부 개선 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 자소엽 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 유칼립투스 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 자소엽 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 유칼립투스 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-1 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-6 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 세포재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 10은 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 세포재생 효능을 wound gap 면적율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 COL1A1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 의해 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 MMP-1 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 자소엽, 유칼립투스로부터 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

자소엽(Perilla Frutescens)은 꿀풀과의 한해살이풀로 우리나라에서 오래 전부터 자생해온 식물이다. 차즈기, 차조기, 소마(蘇麻) 등의 이름으로도 불린다. ‘계피의 매운 맛을 지닌 깻잎’이라 하여 계피 계, 깻잎 임, 계임(桂荏)이라고도 한다. 영어로는 소엽과 들깨를 모두 beefsteak plant 혹은 wild basil이라고 부른다.　들깨와 생김새가 매우 비슷하지만 줄기와 잎이 보라색인 점이 들깨와 자소가 다른 점이다. 보라색을 뜻하는 자(紫)에서 알 수 있듯이 잎의 앞 뒷면이 모두 보라색이다. 연한 자주색의 꽃은 늦여름쯤 피어 난다. 자소엽은 모근에 풍부한 영양공급을 하여 모발과 두피를 건강하게 하는데 좋은 효과가 있으며 자소엽에 들어있는 여러 항산화 물질들은 암을 유발하는 각종 유해 물질을 제거하는 것 외에도 암세포의 증식을 억제하는 작용을 통하여 항암 작용을 한다. 또한 자소엽에는 베타카로틴, 안토시아닌, 비타민 A, C 등과 같은 뛰어난 항산화 성분들이 노화를 촉진하는 주요 요인인 활성산소를 제거해주고, 세포의 산화를 막아주는 항산화 작용을 하여 노화를 예방하는데도 효과적이다. 염증을 억제하고 혈액 응고를 돕는 비타민 K도 풍부하게 함유되어 있으며 비타민 B1, B2, B6, 니아신 등의 비타민과 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 아연 등을 풍부하게 함유하고 있따. 면역력 강화 등의 효과도 있어 아토피 피부염, 알레르기 체질을 개선하는 효과도 있으며 자소엽에 들어있는 페릴알데히드 성분은 뛰어난 항균 작용을 하여 체내 유해한 균들을 제거하는 효능이 있다. 또한 리놀레산이 풍부하여 콜레스테롤과 체지방 수치를 낮춰주는 효과가 있으며 불포화지방산인 EPA 성분도 풍부해 면역력을 높이고 각종 성인병 예방에 도움을 준다. 본 발명의 자소엽 엑소좀 제조에는 잎, 줄기가 사용되며, 바람직하게는 자소엽의 잎이 사용된다.

유칼립투스(Eucalyptus Globulus)는 쌍떡잎식물 도금양과에 속하는 교목 또는 상록교목이며 열대지방을 비롯하여 오스트레일리아 지방에 널리 분포하고 있는 식물이다. 그리스어로 '아름답다'와 '덮인다'의 합성어인 유칼립투스의 잎은 은은한 향과 뛰어난 효능으로 약재나 오일로 많이 쓰인다. 유칼립투스는 강력한 살균작용으로 기관지 및 호흡기 내 세균을 없애주고 염증을 외부로 배출시켜주는 작용을 해줌으로써 비염이나 기관지염 등의 기관지 및 호흡기질환을 예방하는데 탁월한 효과가 있다. 또한 뛰어난 항균작용으로 피부의 재생을 도와 발진이나 각종 피부 트러블을 완화하는데 효과적이며 기미나 여드름을 완화시키는데 탁월한 효과가 있다.

유칼립투스 잎은 산화 스트레스와 자유 라디칼 손상으로부터 신체를 보호하는 항산화 물질, 특히 플라보노이드를 함유하고 있으며 주요 플라보노이드에는 카테킨, 이소르함네틴, 루테올린, 캄페롤, 플로레틴 및 케르세틴이 포함된다. 또한 유칼립투스를 사용하면 세라마이드 함량을 높여 건성 피부를 개선할 수 있다. 세라마이드는 장벽을 유지하고 수분을 유지하는 역할을 하는 피부의 지방산 유형이다. 유칼립투스잎 추출물은 피부 세라마이드 생성, 수분 유지 능력 및 피부 장벽 보호를 향상시키는 것으로 밝혀졌으며 세라마이드 생성을 자극하는 것으로 보이는 macrocarpal A라는 화합물을 포함하고 있다. 본 발명의 유칼립투스 엑소좀의 제조에는 바람직하게는 유칼립투스 잎이 사용된다.

바람직하게는 본 발명 유효성분으로서의 상기 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀은 다음과 같은 방법으로 분리 정제된다.

(A)자소엽 또는 유칼립투스 잎을 40~60℃, 20~24시간 열풍건조 처리하는 단계; (B)열풍건조 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎에 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 펙티나제(pectinase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 가하고 40~50℃, pH 4.5~5.0 조건에서 1~3시간 반응시키는 효소처리 단계; (C)효소 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계; (D)초음파 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 착즙하는 단계; (E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된다.

상기 (A) 단계에서 열풍건조 처리는 열풍건조기를 이용하여 자소엽 또는 유칼립투스 잎 생물을 40~60℃의 온도에서 20~24시간 동안 열풍건조하는 것이며, 더욱 바람직하게는 50℃의 온도에서 24시간 열풍건조하는 것이다.

식물의 경우 여러 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비량이 달라질 수 있다. 자소엽과 유칼립투스를 40~60℃의 온도에서 20~24시간 동안 열풍건조 처리하는 경우 엑소좀의 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.

이어서, 열풍건조 전처리된 자소엽 또는 유칼립투스 잎에 가수분해효소를 가하여 효소반응을 시킨다. 상기 (B) 단계에서 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 효소처리하는 공정에는 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 펙티나제(pectinase)와 같은 식물 세포벽 성분을 가수 분해할 수 있는 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소가 사용된다. 상기 효소처리 공정은 증류수를 가한 후 40~50℃, pH 4.5~5.0 조건에서 1~3시간 반응시키는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 50℃에서 2시간 수행하는 것임을 특징으로 한다. 식물의 세포벽은 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴(pectin), 리그닌(lignin) 등의 성분으로 이루어져있으며 이 성분들은 대부분 공유결합, 수소결합, 이온결합, 소수결합 등을 통하여 강하게 연결되어 있어, 외부로부터의 공격에 대해 식물 조직을 방어한다. 이러한 식물 세포벽 성분을 효소를 사용하여 가수분해하여 엑소좀 추출을 용이하게 한다.

이어서, 상기 효소 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 4~25℃에서 10~60분동안, 더욱 바람직하게는 25℃에서 30분 동안 초음파처리(sonication)를 수행한다((C) 단계). 이때, 발진주파수는 30~50kHz, 바람직하게는 40kHz 조건으로 설정하여 처리한다.

초음파 처리는 식물 엑소좀을 초음파 처리하였을 때 엑소좀에 영향을 줄 수도 있다고 판단하여 여러 조건으로 테스트를 진행 후 엑소좀의 크기 및 농도에 변화가 없음을 확인 후 수행하였으며, 초음파 처리로 인해 엑소좀의 생성량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

이어지는 상기 (D) 단계에서 초음파 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 착즙하는 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 효소처리 및 초음파처리에 의한 식물세포벽의 투과율 변화로 인해 즙이 쉽게 빠져나오기 때문에 교반 속도가 일정 이하인 스크류를 사용하는 것이 좋다.

상기 (E) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (F) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50 ~ -80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.

엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueous two phase partition method)을 사용하였다.

수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.

상기 (G)단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량%: 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (H)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.

이와 같은 방법에 의하여 제조된 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀은 우수한 보습 효과(시험예 8), 피부진정 효과(시험예 15), 항염 효과(시험예 9, 시험예 10), 피부세포재생 효과(시험예 11), 피부 주름개선 효과(시험예 12, 시험예 13, 시험예 16)를 나타내었다.

그러므로 상기 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀은 피부 보습용, 피부진정용, 피부 염증개선용, 피부 세포재생용, 피부 주름개선용 화장료 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이때 상기 유효성분으로서의 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다. 상기 혼합 엑소좀은 자소엽 엑소좀과 유칼립투스 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것이며, 더욱 바람직하게는 동일 중량비율로 혼합된 것이다.

상기의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스 등으로 제조될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1: 자소엽 엑소좀의 제조

자소엽 열풍건조 처리

자소엽 잎 생물 200g을 열풍건조기를 이용하여 50℃의 온도에서 24hr 열풍건조 처리를 실행하였다.

자소엽 효소 처리

열풍건조 처리한 자소엽에 증류수를 가하고 cellulase와 pectinase를 각각 기질 대비 1.2%, 0.1% 첨가하여 50℃의 온도와 pH 4.5~5.0 조건에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 자소엽 원물과 반응액을 모두 초음파 처리 및 착즙에 사용하였다.

자소엽 초음파 처리

효소 처리한 자소엽 원물과 반응액을 25℃에서 30분동안 초음파 처리를 실행하였다. 이때 초음파 처리는 물리적 충격을 최소화하기 위해 bath형 sonicator(POWERSONIC 420)를 사용하였다.

자소엽 착즙

초음파 처리한 자소엽을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 자소엽 착즙을 수행하였으며 수득한 자소엽 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 자소엽 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

엑소좀 정제를 위한 상층액 회수

자소엽 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.

상층액 동결건조

엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.

수성 2상계 형성

동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG(Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran(Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.

자소엽 엑소좀의 회수

상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.

추가 세척 공정

순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.

실시예 2: 유칼립투스 엑소좀의 제조

유칼립투스의 잎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일하게 하여 유칼립투스 유래 엑소좀을 정제하였다.

실시예 3: 자소엽, 유칼립투스 혼합 엑소좀의 제조

상기 실시예 1, 2에서 제조한 자소엽 엑소좀과 유칼립투스 엑소좀을 동일 중량비율로 혼합하여 제조하였다.

실시예 4~13: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 제조

식물의 경우 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비량이 달라질 수 있다. 식물이 엑소좀을 분비하는 최적의 조건이 모두 다르기 때문에 초음파 처리의 온도 및 시간 등 환경 스트레스에 의한 엑소좀의 수율 비교를 통해 최적의 조건을 확립하기 위해 자소엽과 유칼립투스의 초음파 처리 단계 조건을 달리하여 엑소좀을 정제하였다. 초음파 처리 단계에서의 온도 및 시간 조건만을 달리하고 상기 실시예 1과 동일하게 엑소좀을 정제하였으며 조건은 하기의 표 1에 나타내었다.

번호	원물	초음파 처리 온도(℃)	초음파 처리 시간(min)
실시예 4	자소엽	4	10
실시예 5	자소엽	4	30
실시예 6	자소엽	4	60
실시예 7	자소엽	25	10
실시예 8	자소엽	25	60
실시예 9	유칼립투스	4	10
실시예 10	유칼립투스	4	30
실시예 11	유칼립투스	4	60
실시예 12	유칼립투스	25	10
실시예 13	유칼립투스	25	60

비교예 1: 자소엽 추출물 제조

자소엽 잎 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 자소엽 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

비교예 2: 유칼립투스 추출물 제조

유칼립투스 잎 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 유칼립투스 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

시험예 1: 자소엽 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 자소엽 유래 엑소좀의 구조를 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 자소엽 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 180nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 2: 유칼립투스 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 유칼립투스 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 2는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 유칼립투스 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 170nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 3: 자소엽 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 자소엽 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 도 3은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 자소엽 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 183.4nm와 1 mL의 단위 부피당 7.10 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 4: 유칼립투스 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 유칼립투스 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 도 4는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 유칼립투스 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 168.7nm와 1 mL의 단위 부피당 8.40 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 5: 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 수율 비교

초음파 처리의 최적의 조건을 확인하기 위해 상기 실시예 1, 2 및 4~13에 따라 정제한 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 수율을 비교하였다. 하기 표 2는 수율 비교를 나노입자추적분석(NTA) 결과로 나타낸 표이다.

번호	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
실시예 1	7.10 x 10¹⁰	183.4
실시예 2	8.40 x 10¹⁰	168.7
실시예 4	1.30 x 10⁹	179.3
실시예 5	9.20 x 10⁹	181.3
실시예 6	2.10 x 10⁹	180.3
실시예 7	1.90 x 10¹⁰	180.7
실시예 8	2.40 x 10¹⁰	179.6
실시예 9	3.70 x 10⁹	165.3
실시예 10	2.20 x 10¹⁰	166.7
실시예 11	5.50 x 10⁹	162.0
실시예 12	6.10 x 10⁹	162.4
실시예 13	4.00 x 10⁹	165.6

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 초음파 처리를 30분 동안 수행했을 때 높은 수율을 나타내었으며 그 중에서도 온도 25℃ 조건의 실시예 1, 2에서 엑소좀의 수율이 가장 높았다. 따라서 가장 최적의 초음파 처리 조건은 25℃에서 30분임을 확인하였다.

시험예 6: 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 온도별 안정성 분석

본 발명 실시예 1, 2에 따라 정제한 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 온도별 안정성을 확인하였다. 하기 표 3은 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 12주 간 4℃, 25℃, 45℃에서 보관 후 나노입자추적분석(NTA)을 통해 입자의 크기와 농도를 나타낸 표이다.

	자소엽 엑소좀 (4℃보관)		자소엽 엑소좀 (25℃보관)		자소엽 엑소좀 (45℃보관)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	7.10 x 10¹⁰	183.4	7.10 x 10¹⁰	183.4	7.10 x 10¹⁰	183.4
2주차	7.05 x 10¹⁰	182.7	7.10 x 10¹⁰	183.7	7.06 x 10¹⁰	184.6
4주차	7.11 x 10¹⁰	180.6	7.04 x 10¹⁰	183.0	7.01 x 10¹⁰	182.7
8주차	7.10 x 10¹⁰	180.2	7.11 x 10¹⁰	179.6	7.00 x 10¹⁰	182.6
12주차	7.00 x 10¹⁰	181.7	7.02 x 10¹⁰	182.4	7.01 x 10¹⁰	181.9
	유칼립투스 엑소좀 (4℃보관)		유칼립투스 엑소좀 (25℃보관)		유칼립투스 엑소좀 (45℃보관)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	8.40 x 10¹⁰	168.7	8.40 x 10¹⁰	168.7	8.40 x 10¹⁰	168.7
2주차	8.31 x 10¹⁰	167.2	8.36 x 10¹⁰	167.3	8.38 x 10¹⁰	168.6
4주차	8.32 x 10¹⁰	165.6	8.30 x 10¹⁰	168.1	8.36 x 10¹⁰	168.0
8주차	8.26 x 10¹⁰	168.1	8.34 x 10¹⁰	167.1	8.41 x 10¹⁰	167.5
12주차	8.22 x 10¹⁰	166.5	8.31 x 10¹⁰	168.4	8.37 x 10¹⁰	167.4

온도별 12주 안정성을 분석한 결과, 실시예에 해당하는 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 크기 및 농도 변화가 4℃, 25℃, 45℃ 조건에서 모두 안정적임을 확인하였다.

시험예 7: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 세포독성 평가

자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96well 플레이트에 사람의 각질형성세포(HaCaT)를 1Х10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지와 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 농도 별로 투여하고 다시 24시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution (5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5는 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀, 자소엽과 유칼립투스 혼합 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.

시험예 8: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 보습 효능 평가(AQP3 발현)

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 보습 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 AQP3 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium(Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 무혈청배지로 교체하였다. 각 웰에 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 15mJ/cm² UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Hyaluronic acid 0.005% 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 30분)한다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 30분)한다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol(Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 10분)하여 세척한다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260 nm와 280 nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT(Bionics, Korea) dNTP(Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), HPLC (J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.

AQP3 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 4에 나타내었으며, 도 6은 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀과 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 세포의 수분 이동에 관여하는 보습 인자이며 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3 mRNA가 농도 의존적으로 증가하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 발현율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였을 때는 139.7% 발현율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
AQP3	5'-CCT TTG GCT TTG CTG CAC TC-3'	5'-ACG GGG TTG TTG TAA GGG TCA-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 9: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 항염 효능 평가(IL-1 발현 억제)

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 항염 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 IL-1 mRNA 발현 억제 시험을 진행하였다. Human Keratinocyte(HaCaT) 세포를 6x10⁵ cells/well 농도로 접종한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각 웰에 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 10mJ/cm² UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 serum-free DMEM 배양배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Allantoin을 0.01% 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol(Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 10분)하여 세척한다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260 nm와 280 nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT(Bionics, Korea) dNTP(Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA), HPLC (J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.

IL-1 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 5에 나타내었으며, 도 7은 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-1 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀과 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 염증 인자인 IL-1 mRNA가 감소하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Allantoin 0.01%를 처리하였을 때는 46.7% 억제율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
IL-1	5'-AAT CTG TAC CTG TCC TGC GTG TT-3'	5'-TGG GTA ATT TTT GGG ATC TAC ACT CT-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 10: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 항염 효능 평가(IL-6 발현 억제)

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 항염 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 IL-6 mRNA 발현 억제 시험을 진행하였다. 실험 방법은 위 시험예 9과 동일하며 IL-6 유전자의 PCR primer 서열을 아래 표 6에 나타내었다. 도 8은 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-6 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀과 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 염증 인자인 IL-6 mRNA가 감소하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Allantoin 0.01%를 처리하였을 때는 48.0% 억제율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
IL-6	5'- AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG G-3'	5'-TCT GGC TTG TTC CTC ACT ACT-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 11: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 세포재생 효능 평가

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 세포재생 효능을 확인하기 위해 wound healing assay 평가를 진행하였다. 세포는 화학적 및 물리적 자극에 의해 손상을 받게 되면 다양한 케모카인(chemokine)과 사이토카인(cytokine)을 분비함과 동시에 피부 손상 부위로 이동해 세포의 증식을 유도한다. 따라서 피부 세포의 성장 및 이동을 시험하는 wound healing assay를 통해 시료에 의한 세포 재생 유도 효과를 확인하였다. 각질형성세포(HaCaT)를 12well 플레이트에 2Х10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 200 ㎕ 파이펫 팁을 이용하여 세포를 긁어 내었다. 긁어낸 후 떨어져 나간 세포들은 PBS buffer로 반복해서 세척하고 1.5% 소혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체한 후 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하고 양성 대조군으로는 FBS 20%를 처리하였다. 그 후 18시간 동안 배양하였으며 상처가 생긴 후 0시간과 8시간에 같은 위치를 현미경으로 촬영하여 8시간 동안 줄어든 면적을 ImageJ(National Institutes of Health, USA)로 측정하여 평균값을 계산하였다.

도 9는 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이며, 자소엽, 유칼립투스 엑소좀과 자소엽, 유칼립투스 추출물을 1% 처리하였을 때의 결과를 나타내었다.

도 10은 wound gap 면적율에 대한 그래프 결과이며, 농도별 시료를 처리한 결과를 나타내었다. 시험 결과, 자소엽 유래 엑소좀, 유칼립투스 유래 엑소좀을 처리하였을 때 wound gap 면적이 감소하였으며 자소엽, 유칼립투스 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 더 높은 면적 감소율을 보였다. 이로 인해 세포의 성장 및 이동이 증가하여 세포재생에 효과가 있음을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 FBS 20%를 처리하였을 때는 89.1% 면적율을 보였다.

시험예 12: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 주름개선 효능 평가(COL1A1 발현)

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 COL1A1 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium(Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 무혈청배지로 교체하였다. 각 웰에 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 및 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 15mJ/cm² UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 TGF-β 5ng/mL 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol\ (Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 10분)하여 세척한다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260 nm와 280 nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT(Bionics, Korea) dNTP(Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA), HPLC(J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.

COL1A1 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 7에 나타내었으며, 도 11은 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 COL1A1 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀과 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 콜라겐생성인자인 COLA1A mRNA가 증가하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 발현율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 TGF-β 5ng/mL을 처리하였을 때는 145.4% 발현율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
COL1A1	5'-GAG AGC ATG ACC GAT GGA TT-3'	5'-CCT TCT TGA GGT TGC CAG TC-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 13: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 주름개선 효능 평가(MMP-1 발현 억제)

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 실험 방법은 위 시험예 12와 동일하며 MMP-1 유전자의 PCR primer 서열을 아래 표 8에 나타내었다. 도 12는 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름개선 효능을 MMP-1 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀과 자소엽 추출물, 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 콜라겐분해효소인자인 MMP-1 mRNA가 감소하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 TGF-β 5ng/mL을 처리하였을 때는 44.0% 발현율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
MMP-1	5'-GGG CTT GAA GCT GCT TAC GA-3'	ACA GCC CAG TAC TTA TTC CCT TTG-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

제형예 1~3: 크림의 제조

하기 표 9의 조성으로 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽 유래 엑소좀, 유칼립투스 유래 엑소좀을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 비교예 1의 자소엽 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 1로 하고 비교예 2의 유칼립투스 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 2로 하였다.

성분	제형예 1	제형예 2	제형예 3	비교제형예 1	비교제형예 2
성분	함량(중량 %)
자소엽 엑소좀(실시예 1)	6	-	-	-	-
유칼립투스 엑소좀(실시예 2)	-	6	-	-	-
혼합 엑소좀(실시예 3)	-	-	6	-	-
자소엽 추출물(비교예 1)	-	-	-	6	-
유칼립투스 추출물(비교예 2)	-	-	-	-	6
글리세린	10	10	10	10	10
부틸렌글라이콜	5	5	5	5	5
글리세릴올리에이트	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8
세테아릴올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
솔비탄올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
세틸에틸헥사노에이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
비즈왁스	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
1,2-헥산다이올	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
디메치콘	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
세티아릴알코올	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
미네랄 오일	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
비에이치티	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
토코페릴아세테이트	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
판테놀	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
에칠헥실메톡시신나메이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
향	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

시험예 14: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 제형 성상 안정성 분석

상기 제형예 1~3에 따라서 제조된 크림의 성상안정성 시험을 진행하였다. 제조된 크림을 12주 간 Cycling Chamber에서 24시간 간격으로 4℃ ↔ 45℃의 온도 변화를 주면서 그 성상의 변화를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

주차	제형예 1	제형예 2	제형예 3
초기	-	-	-
2주차	-	-	-
4주차	-	-	-
8주차	-	-	-
12주차	-	+	-

(-; 변화없음, +; 약간 색의 변화, ++; 색변화 또는 약간의 침전, +++; 색변화와 침전 발생)

자소엽 엑소좀(실시예 1), 유칼립투스 엑소좀(실시예 2), 자소엽, 유칼립투스 혼합 엑소좀(실시예 3)을 함유한 크림 제형의 안정성을 관찰한 결과, 성상안정성이 유지되는 것을 확인하였다.

시험예 15: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 피부진정 효능 평가

피부 알레르기 증상이 없는 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 세 그룹으로 나누어 테입 스트리핑 법(테이프를 붙였다 떼 피부에 자극을 주는 방법)을 통한 피부진정 효능을 평가하였다. 테이프를 사용하여 하박 내측에 피부 자극 및 홍반을 유발한 후 상기 제형예에서 제조한 크림을 일정량 도포하여 3시간 후에 자극이 진정되는 정도를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

	피부진정 효과
	-	+	++	+++	++++
제형예 1	13	6	1	0	0
제형예 2	14	6	0	0	0
제형예 3	16	4	0	0	0
비교제형예 1	6	7	3	3	1
비교제형예 2	4	5	7	4	0

(-; 홍반없음, +; 매우 경미한 홍반, ++; 희미한 홍반, +++; 뚜렷한 홍반, ++++; 심한 홍반)

상기 표 11의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀, 자소엽, 유칼립투스 혼합 엑소좀이 포함된 크림에서 우수한 피부진정 효과를 나타내었다.

시험예 16: 자소엽, 유칼립투스 엑소좀의 주름개선 평가

자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름 개선 효능을 확인하기 위해 30 ~ 50대의 성인 여성 20명을 대상으로 상기 제형예에서 제조된 크림을 얼굴 양쪽면에 바르고, LED 광원장치로 633nm의 적색광을 6주간 누적 시간 24시간 조사한 후, 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

표 12는 상기 실시예에 따라서 정제된 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀의 주름개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가한 결과를 나타낸 표이다.

	주름개선효과
	우수	약간	없음
제형예 1	9	5	6
제형예 2	9	4	7
제형예 3	11	7	2
비교제형예 1	2	4	14
비교제형예 2	3	4	13

상기 표 12의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀, 자소엽, 유칼립투스 혼합 엑소좀이 포함된 크림에서 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다.

Claims

자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자소엽 엑소좀 또는 유칼립투스 엑소좀은,
(A)자소엽 또는 유칼립투스 잎을 40~60℃, 20~24시간 열풍건조 처리하는 단계; (B)열풍건조 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎에 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 펙티나제(pectinase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 가하고 40~50℃, pH 4.5~5.0 조건에서 1~3시간 반응시키는 효소처리 단계; (C)효소 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계; (D)초음파 처리한 자소엽 또는 유칼립투스 잎을 착즙하는 단계; (E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 열풍건조 처리는 50℃의 온도에서 24시간 동안 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 초음파 처리는 25℃의 온도에서 30분 동안 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 자소엽 엑소좀, 유칼립투스 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 혼합 엑소좀은 자소엽 엑소좀과 유칼립투스 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 진정용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 염증개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 세포재생용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.