KR102528139B1

KR102528139B1 - 녹차, 귀리 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102528139B1
Application number: KR1020220145176A
Authority: KR
Inventors: 윤은정; 박시준; 이현상; 김정수; 김현민
Original assignee: 주식회사 에이바이오머티리얼즈
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-05-03

Abstract

본 발명은 녹차, 귀리 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 조분쇄, 초음파 처리 및 침지 숙성 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 녹차 엑소좀 및/또는 귀리 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 항염, 보습, 여드름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

녹차, 귀리 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Camellia Sinensis Leaf exosome and Avena Sativa(Oat) Kernel exosome}

본 발명은 녹차, 귀리 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 조분쇄, 초음파 처리 및 침지 숙성 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 녹차 엑소좀 및/또는 귀리 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 항염, 보습, 여드름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품의 기능은 청결과 단순한 메이크업을 지나, 공해 물질, 스트레스, 자외선, 활성산소, 과산화물 등의 피부 노화 원인을 제거하거나 억제하며 피지 제거, 여드름 개선 등으로 확장되어 왔다. 여드름은 모피지선의 만성 염증성 질환으로 주로 사춘기에 시작한다. 여드름의 발생 원인은 아직 확실하게 밝혀진 바는 없으나 여러가지 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있으며 호르몬의 변화, 유전 경향, 화장품의 첨가물, 부신피질호르몬제인 스테로이드 함유 약물, 스트레스, 생활환경 등이 있다. 현재까지 여드름 치료는 살리실산이나 비타민 A 유도체인 레티노익산 제제, 트리클로산 등의 항생제를 사용하여 여드름 균에 대한 항균성에 집중하고 있다. 하지만 이와 같은 물질들은 피부자극을 유발하며 세균의 내성을 높이는 가능성이 있다. 본 발명자들은 여드름 균에 대해 우수한 항균효과를 나타내면서 피부 자극을 유발하지 않는 안전한 원료에 대하여 연구하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 "엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.

최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.

이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 용해도 및 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.

본 발명자들은 다양한 방법을 적용하여 우수한 피부 상태 개선 활성을 나타내는 식물 유래 엑소좀을 제조하고 이를 화장료로 이용하기 위해 노력하였으며, 그 결과 특정한 조건에서의 조분쇄, 초음파처리 및 침지 숙성 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 녹차 엑소좀 및/또는 귀리 엑소좀이 우수한 피부 개선 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-2125567호(2020.06.16) (0002) 대한민국 등록특허 제10-2265811호(2021.06.16.) (0003) 대한민국 공개특허 제10-2022-0122577호(2022.09.02)

본 발명은 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며 항염, 보습, 여드름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 녹차 엑소좀 또는 귀리 엑소좀의 정제방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합 엑소좀은 녹차 엑소좀과 귀리 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어진다.

상기 유효성분으로서의 녹차 엑소좀과 귀리 엑소좀은,

(A)녹차 또는 귀리를 조분쇄하는 단계; (B)조분쇄한 녹차 또는 귀리를 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계; (C)초음파 처리한 녹차 또는 귀리를 4~45℃, 18~24시간 침지 숙성하는 단계; (D)침지 숙성한 녹차 또는 귀리를 착즙하는 단계; (E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것이다.

더욱 바람직하게는 (A)단계에서의 조분쇄 공정은 통상의 분쇄 장치를 사용하여 약 2.0~5.0mm의 입자 크기로 분쇄하는 것이다.

또한 상기 (B) 단계에서 초음파 처리는 더욱 바람직하게는 25℃의 온도에서 30분 동안 수행하는 것임을 특징으로 하며, 상기 (C) 단계에서 침지 숙성 전처리는 4℃, 24시간 동안 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

유효성분으로서의 상기 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0%(w/w) 함유된다.

상기 화장료 조성물은 항염용, 보습용 또는 여드름 개선용임을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,

(A)녹차 또는 귀리를 조분쇄하는 단계;

(B)조분쇄한 녹차 또는 귀리를 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계;

(C)초음파 처리한 녹차 또는 귀리를 4~45℃, 18~24시간 침지 숙성하는 단계;

(D)침지 숙성한 녹차 또는 귀리를 착즙하는 단계

(E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

(F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;

(G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및

(H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 녹차 또는 귀리 엑소좀의 정제방법이 제공된다.

더욱 바람직하게는 상기 (A)단계에서의 조분쇄 공정은 통상의 분쇄 장치를 사용하여 약 2.0~5.0mm의 입자 크기로 분쇄하는 것을 특징으로 하며, 상기 (B) 단계에서 초음파 처리는 25℃의 온도에서 30분 동안 수행하는 것임을 특징으로 하며, 상기 (C) 단계에서 침지 숙성 전처리는 4℃, 24시간 동안 수행하는 것임을 특징으로 한다.

조분쇄, 초음파처리 및 침지 숙성 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 안정성이 우수하며, 우수한 항염 효과, 보습 효과 및 여드름 개선 효과를 나타내므로 피부개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 녹차 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 귀리 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 녹차 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 귀리 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-1 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-6 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의해 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 조분쇄, 처음파처리 및 침지 숙성 전처리를 통하여 녹차, 귀리로부터 피부 개선활성이 우수한 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.

녹차(Camellia Sinensis Leaf)는 차나무의 잎으로, 차나무는 아열대 상록 관목이다. 1년생 가지는 흰색이며 잔털이 있고 2년생 가지는 회갈색이며 털이 없다. 잎은 어긋나며 피침상 장타원형으로 표면은 녹색의 엽맥이 들어갔고 뒷면은 회녹색으로 맥이 튀어나와 있으며 양면에 털이 없다. 차나무의 잎은 차 생산에 사용된다. 국내에서 거의 전량이 홍차 또는 녹차용으로 소비되어 있으며 번식력이 강하고 병충해에 강해 재배상 어려움이 적다. 기후조건은 북위 40°이며, 연평균기온이 13℃이상이어야 좋다. 강우량은 1,300~1,500㎜가 적당하며, 높이는 200m 이하에서 좋은 생장을 보인다. 차잎은 카페인, 타닌, 질소, 단백질, 비타민 A와 C, 무기염류 등을 함유하고 있어 각성 작용과 이뇨, 강심, 해독, 피로회복 등 인체에 이로운 약리작용을 한다. 찻잎을 수확해 발효하거나, 볶는 과정이 달라 가공법이 상이하고 이름이 달라진다. 찻나무 잎은 녹차, 홍차, 보이차(흑차) 등으로 분류된다. 발효의 차이로 인해 찻잎에 함유된 카페인과 아미노산의 양이 다를 수 있으며 발효가 덜 될수록 카페인 함량이 높고 발효가 더 될수록 아미노산이 적은 것이 특징이다.

녹차는 전 세계에서 가장 많이 소비되는 차 중의 하나이다. 녹차에 함유된 폴리페놀은 흔히 카테킨이라고 부르는 성분으로 효과가 우수한 항산화제이다. 염증이나 암세포를 억세하는 항균작용, 중금속, 오염물질, 환경 호르몬, 알코올 등의 배출 작용을 돕고 이뇨작용, 해열작용, 노화 방지, 골다공증 예방에 좋다. 녹차에 가장 많은 카테킨은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate: EGCG)로 전체 카테킨의 65% 정도를 차지한다. 이러한 항산화제로 인해 활성산소에 의한 세포 파괴에 대항하여 산화 스트레스를 줄여주고 피부염, 피지선 염증 등 피부 문제를 해결하는 데 도움을 준다. 차나무의 종자는 화장품과 식용으로도 이용되며 종자의 착유박(搾油泊)은 비료나 가축의 사료로도 쓰이고 비누의 대용이 되기도 하는 등 그 효용가치가 막대하다.

귀리(Avena Sativa (Oat) Kernel)는 외떡잎식물 벼목 벼과 귀리(Avena) 속 식물로, 1m 이상 자랄 수 있으며 꽃은 5~6월에 핀다. 메밀이나　호밀　등과 마찬가지로 척박한 땅에서도 파종과 재배, 수확이 용이하기 때문에　동유럽이나　북유럽　등지에서 많이 재배하며, 최대 산지는　러시아다. 한반도에는 대략　고려시대　때 유입된 것으로 추정되나 곡식으로서는 수확량이 너무 적고, 사람 먹을 곡식을 심을 땅도 부족한데 가축 먹일 사료용 작물을 따로 재배할 만한 사정도 되지 못하므로 작물로는 인기가 없었다.　이런 탓에 식품용 귀리는 대부분 수입에 의존하고 있었으나 웰빙 열풍 이후 건강식품으로 각광을 받으면서 지금은 주로 전라도 지역에서 월동작물로 재배한다. 귀리는 세계 10대 슈퍼푸드 중 하나로 단백질 함량이 높고 필수 아미노산이 충분히 포함되어 있어 곡물의 왕이라는 별칭으로 불리기도 한다. 귀리에 포함된 항산화 성분은 심혈관계 건강에 도움이 되며 풍부한 섬유질은 나쁜 콜레스테롤을 줄여준다. 또 귀리에는 베타글루칸이라는 수용성 섬유질이 포함되어 있어 인슐린 감수성을 개선하고 혈당을 조절할 수 있다 제 2형 당뇨병 환자의 경우 식단에 귀리를 포함하면 혈당 수치를 관리하는데 도움이 된다. 또한 귀리에는 멜라토닌과 비타민 B가 함유되어 있으며 이들은 수면에 관여하는 호르몬인 세로토인 분비를 촉진하여 숙면에 긍정적인 영향을 준다.

본 발명 화장료 조성물의 유효성분으로서의 녹차, 귀리 유래 엑소좀은 다음과 같은 방법으로 정제된다.

(A)녹차 또는 귀리를 조분쇄하는 단계; (B)조분쇄한 녹차 또는 귀리를 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계; (C)초음파 처리한 녹차 또는 귀리를 4~45℃, 18~24시간 침지 숙성하는 단계; (D)침지 숙성한 녹차 또는 귀리를 착즙하는 단계; (E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된다.

본 발명에서는 피부개선활성이 우수한 녹차, 귀리 유래 엑소좀을 제조하기 위하여 먼저 원물을 분쇄 후 초음파 처리 및 침지 숙성 전처리를 수행한다.

식물의 경우 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비특성이 달라질 수 있으며 특히 식물이 스트레스를 받았을 때 엑소좀의 분비량에 영향을 줄 수 있다. 따라서 식물이 엑소좀을 분비하는 최적의 조건을 확인하기 위해 다양한 전처리를 통해 그 수율과 피부개선활성을 확인하였으며, 녹차, 귀리는 전처리로서 초음파처리 및 침지숙성 전처리를 수행하는 경우에 엑소좀의 분비가 증가하며, 피부개선활성이 증가한다는 것을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 (A) 단계에서 조분쇄 공정은 통상의 분쇄 장치를 사용하여 약 2.0~5.0mm의 입자 크기로 분쇄한다. 이어서 분쇄한 녹차, 귀리를 4~25℃에서 10~60분동안, 더욱 바람직하게는 25℃에서 30분 동안 초음파처리(sonication)를 수행한다((B) 단계). 이때, 발진주파수는 30~50kHz, 바람직하게는 40kHz 조건으로 설정하여 처리한다.

초음파 처리는 식물 엑소좀을 초음파 처리하였을 때 엑소좀의 크기 및 농도에 변화가 없음을 확인 후 수행하였으며, 초음파 처리 후 침지 숙성을 수행하였을 때 엑소좀의 생성량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

이어서 초음파 처리한 녹차 또는 귀리를 4~45℃, 18~24시간 침지 숙성 후 착즙한다((C), (D) 단계).

상기 (C) 단계에서 침지 숙성 전처리는 4℃, 24시간 동안 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (D) 단계에서 착즙하는 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 (E) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (F) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50 ~ -80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.

엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueous two phase partition method)을 사용하였다.

수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.

상기 (G) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량%: 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (H)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.

이와 같은 방법에 의하여 제조된 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀은 일반 녹차 추출물, 귀리 추출물과 비교하여, 그리고 전처리를 수행하지 않고 정제한 엑소좀과 비교하여 우수한 항염효과(시험예 7, 시험예 8), 보습 효과(시험예 9), 여드름 개선 효과(시험예 10, 시험예 11)를 나타내었다.

그러므로 상기 녹차, 귀리 유래 엑소좀은 항염용, 보습용, 여드름 개선용 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 이때 상기 유효성분으로서의 녹차, 귀리 유래 엑소좀 또는 그 혼합엑소좀은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다. 상기 혼합 엑소좀은 녹차 엑소좀과 귀리 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어진다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스, 립스틱 등으로 제조될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1: 녹차 엑소좀의 제조

녹차 조분쇄

녹차 100g을 통상의 분쇄 장치를 사용하여 2.0~5.0mm의 입자 크기로 분쇄하였다.

녹차 초음파처리

분쇄한 녹차를 잠길 정도의 정제수만을 첨가한 후 25℃에서 30분동안 초음파 처리를 실행하였다. 이때 초음파 처리는 물리적 충격을 최소화하기 위해 bath형 sonicator(POWERSONIC 420)를 사용하였다.

녹차 침지 숙성

초음파 처리한 녹차를 4℃에서 24시간 동안 침지 숙성을 진행하였다.

녹차 착즙

침지 숙성한 녹차를 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 착즙을 수행하였으며 수득한 녹차 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 녹차 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

엑소좀 정제를 위한 상층액 회수

녹차 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.

상층액 동결건조

엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.

수성 2상계 형성

동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG(Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran(Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.

녹차 엑소좀의 회수

상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.

추가 세척 공정

순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.

실시예 2: 귀리 엑소좀의 제조

상기 실시예 1과 동일하게 하여 귀리 유래 엑소좀을 정제하였다.

실시예 3: 녹차, 귀리 혼합 엑소좀의 제조

상기 실시예 1, 2에서 제조한 녹차 엑소좀과 귀리 엑소좀을 동일 중량비율로 혼합하여 혼합 엑소좀을 제조하였다.

실시예 4~15: 녹차, 귀리 엑소좀의 제조

식물의 경우 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비특성이 달라질 수 있다. 식물이 엑소좀을 분비하는 최적의 조건이 모두 다르기 때문에 초음파 처리 및 침지 숙성 단계에서의 온도 조건 등 환경 스트레스에 의한 엑소좀의 수율 비교를 통해 최적의 조건을 확립하기 위해 녹차와 귀리의 초음파 처리 여부 및 침지숙성 온도 조건을 달리하여 엑소좀을 정제하였다. 초음파 전처리, 침지 숙성 단계의 최적 조건을 확인하기 위해 해당 조건만을 달리하고 상기 실시예 1과 동일하게 엑소좀을 정제하였으며, 조건은 하기의 표 1에 나타내었다. 실시예 4와 실시예 10은 녹차와 귀리를 초음파 처리 및 침지 숙성 전처리 없이 바로 분쇄 후 착즙하여 수성 2상 시스템을 적용하여 정제하였다.

	원물	초음파 처리 여부	침지 숙성 온도(℃)
실시예 4	녹차	X	X
실시예 5	녹차	○	25
실시예 6	녹차	○	45
실시예 7	녹차	X	4
실시예 8	녹차	X	25
실시예 9	녹차	X	45
실시예 10	귀리	X	X
실시예 11	귀리	○	25
실시예 12	귀리	○	45
실시예 13	귀리	X	4
실시예 14	귀리	X	25
실시예 15	귀리	X	45

비교예 1: 녹차 추출물 제조

녹차 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 녹차 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

비교예 2: 귀리 추출물 제조

귀리 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 귀리 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

시험예 1: 녹차 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 녹차 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 녹차 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 2: 귀리 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 귀리 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 2는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 귀리 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 3: 녹차 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 녹차 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다.

도 3은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 녹차 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 161.6nm와 1 mL의 단위 부피당 7.50 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 4: 귀리 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 귀리 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다.

도 4는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 귀리 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 170.3nm와 1 mL의 단위 부피당 5.60 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 5: 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 수율 비교

초음파 처리 및 침지 숙성의 최적 조건을 확인하기 위해 상기 실시예 1, 2 및 4~15에 따라 정제한 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 수율을 비교하였다. 하기 표 2는 수율 비교를 나노입자추적분석(NTA) 결과로 나타낸 표이다.

번호	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
실시예 1	7.50 x 10¹⁰	161.6
실시예 2	5.60 x 10¹⁰	170.3
실시예 4	1.40 x 10⁸	160.9
실시예 5	8.98 x 10⁹	167.4
실시예 6	2.06 x 10¹⁰	160.7
실시예 7	2.27 x 10⁹	158.4
실시예 8	1.66 x 10⁹	160.0
실시예 9	4.24 x 10⁹	162.2
실시예 10	1.70 x 10⁸	170.3
실시예 11	6.90 x 10⁹	171.8
실시예 12	1.07 x 10¹⁰	169.9
실시예 13	1.02 x 10⁹	166.5
실시예 14	1.98 x 10⁹	166.7
실시예 15	3.48 x 10⁹	174.3

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 초음파 처리 후 침지 숙성 전처리를 했을 때(실시예 5, 6, 11, 12) 높은 수율을 나타내었으며, 그 중에서도 침지 숙성 온도 4℃ 조건인 실시예 1, 2에서 엑소좀의 수율이 가장 높았다. 실시예 4와 실시예 10의 결과로 보았을 때 초음파 처리 및 침지 숙성 전처리를 수행하지 않은 엑소좀의 경우 가장 낮은 수율을 보였다. 이는 전처리 조건이 엑소좀의 수율에 큰 영향을 주는 것으로 나타내며, 가장 최적의 조건은 초음파 처리를 수행 후 침지 숙성 온도 4℃임을 확인하였다.

시험예 6: 세포독성 평가

녹차 엑소좀(실시예 1, 실시예 4), 귀리 엑소좀(실시예 2, 실시예 10) 및 그 혼합엑소좀(실시예 3)과 녹차 추출물(비교예 1), 귀리 추출물(비교예 2)의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96well 플레이트에 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 1Х10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지에 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 녹차 추출물, 귀리 추출물을 농도 별로 투여하고 다시 24시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution (5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5는 상기 시료들의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀, 녹차와 귀리 혼합 엑소좀 및 녹차 추출물, 귀리 추출물을 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.

시험예 7: 녹차, 귀리 엑소좀의 항염 효능 평가(IL-1 발현 억제)

녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항염 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 IL-1 mRNA 발현 억제 시험을 진행하였다. Human Keratinocyte(HaCaT) 세포를 6x10⁵ cells/well 농도로 접종한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각 웰에 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 및 녹차 추출물, 귀리 추출물을 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 10mJ/cm² UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 serum-free DMEM 배양배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Allantoin을 0.01% 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol (Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 10분)하여 세척한다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano^® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260 nm와 280 nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT (Bionics, Korea) dNTP (Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여, 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), HPLC (J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.

IL-1 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 3에 나타내었으며, 도 6은 상기 실시예에 따라서 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-1 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀과 녹차 추출물, 귀리 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 염증 인자인 IL-1 mRNA가 감소하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Allantoin 0.01%를 처리하였을 때는 47.8% 억제율을 보였다.

유전자	Forward primer(5'→3')	Reverse primer(5'→3')
IL-1	5'-AAT CTG TAC CTG TCC TGC GTG TT-3'	5'-TGG GTA ATT TTT GGG ATC TAC ACT CT-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 8: 녹차, 귀리 엑소좀의 항염 효능 평가(IL-6 발현 억제)

녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항염 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 IL-6 mRNA 발현 억제 시험을 진행하였다. 실험 방법은 위 시험예 7과 동일하며 IL-6 유전자의 PCR primer 서열을 아래 표 4에 나타내었다. 도 7은 상기 실시예에 따라서 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항염 효능을 IL-6 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀과 녹차 추출물, 귀리 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 염증 인자인 IL-6 mRNA가 감소하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Allantoin 0.01%를 처리하였을 때는 46.3% 억제율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
IL-6	5'-AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG G-3'	5'-TCT GGC TTG TTC CTC ACT ACT-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 9: 녹차, 귀리 엑소좀의 보습 효능 평가(AQP3 발현)

녹차, 귀리 유래 엑소좀의 보습 효능을 확인하기 위해 추출물과 비교하여 AQP3 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium(Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 무혈청배지로 교체하였다. 각 웰에 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 및 녹차 추출물, 귀리 추출물을 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 15mJ/cm² UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Hyaluronic acid 0.005% 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 30분)한다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 30분)한다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol (Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000rpm, 4℃, 10분)하여 세척한다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano^® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260 nm와 280 nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT(Bionics, Korea) dNTP(Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA), HPLC(J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.

AQP3 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 5에 나타내었으며, 도 8은 상기 실시예에 따라서 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀과 녹차 추출물, 귀리 추출물을 처리하였을 때 세포의 수분 이동에 관여하는 보습 인자이며 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3 mRNA가 농도 의존적으로 증가하였으며 추출물 대비 엑소좀 처리 농도 범위에서 발현율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였을 때는 136.4% 발현율을 보였다.

유전자	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
AQP3	5'-CCT TTG GCT TTG CTG CAC TC-3'	5'-ACG GGG TTG TTG TAA GGG TCA-3'
GAPDH	5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'	5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'

시험예 10: 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항여드름 효능 평가(여드름균에 대한 항균력 측정)

녹차, 귀리 유래 엑소좀의 항여드름 효능을 확인하기 위해 여드름균에 대한 최소저해농도를 확인하였다. 항여드름균 활성 측정을 위한 균주로는 Propionibacterium acnes KCTC 3314를 사용하였으며 균주의 배지로는 Reinforced clostridial medium(RCM)을 사용하였다. 먼저 72시간 동안 배양한 균주를 1.0x10⁶ cfu/ml로 희석하여 각 well에 접종한 후 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 녹차 추출물, 귀리 추출물을 처리하고 37℃ 에서 Anaerobic 상태로 3일간 배양 후 균이 증식되지 않는 최소 농도를 최소저해농도(MIC, Minimum inhibitory concentration)로 정하였으며 그 결과를 하기의 표 6에 나타내었다. 이때, 최소저해농도는 값이 작을수록 항균효과가 높다는 것을 의미한다.

순번	시료명	최소저해농도(%)
1	실시예 1	0.524
2	실시예 2	0.419
3	실시예 3	0.215
4	실시예 4	1.024
5	실시예 10	1.280
6	비교예 1	1.600
7	비교예 2	1.280

시험 결과, 추출물에 비해 녹차, 귀리 유래 엑소좀을 처리하였을 때 여드름 균주에 대한 강한 항균력을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 녹차와 귀리 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 가장 높은 항균력을 나타내는 것을 확인하였다. 양성 대조군으로 사용한 salicylic acid의 경우 MIC가 0.1%로 확인되었다.

제형예 1~3: 크림의 제조

하기 표 7의 조성으로 상기 실시예에 따라서 정제된 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 비교예 1의 녹차 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 1로 하고, 비교예 2의 귀리 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 2로 하였다.

성분	제형예 1	제형예 2	제형예 3	비교제형예 1	비교제형예 2
성분	함량(중량 %)
녹차 엑소좀(실시예 1)	5	-	-	-	-
귀리 엑소좀(실시예 2)	-	5	-	-	-
녹차+귀리 엑소좀(실시예 3)	-	-	5	-	-
녹차 추출물(비교예 1)	-	-	-	5	-
귀리 추출물(비교예 2)	-	-	-	-	5
글리세린	10	10	10	10	10
부틸렌글라이콜	5	5	5	5	5
글리세릴올리에이트	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8
세테아릴올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
솔비탄올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
세틸에틸헥사노에이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
비즈왁스	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
1,2-헥산다이올	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
디메치콘	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
세티아릴알코올	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
미네랄 오일	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
비에이치티	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
토코페릴아세테이트	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
판테놀	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
에칠헥실메톡시신나메이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
향	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

시험예 11: 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 여드름 개선 평가

녹차 엑소좀(실시예 1), 귀리 엑소좀(실시예 2) 및 그 혼합 엑소좀(실시예 3)의 여드름 개선 효능을 확인하기 위해 만 18세~30세의 남녀 20명을 대상으로 상기 제형예에서 제조된 크림을 약 3주간 얼굴에 사용하게 하였으며 사용자의 의견에 따라 개선 정도를 평가하였다.

표 8은 상기 실시예에 따라서 정제된 녹차, 귀리 유래 엑소좀의 여드름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가한 결과를 나타낸 표이다.

	여드름 개선효과
	우수	약간	없음
제형예 1	4	9	7
제형예 2	4	11	5
제형예 3	7	12	1
비교제형예1	1	6	13
비교제형예2	0	4	16

상기 표 8의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀과 녹차, 귀리 혼합 엑소좀이 포함된 크림에서 우수한 여드름 개선 효과를 나타내었다.

Claims

녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 있어서,
상기 유효성분으로서의 녹차 엑소좀과 귀리 엑소좀은,
(A)녹차 또는 귀리를 조분쇄하는 단계; (B)조분쇄한 녹차 또는 귀리를 4~25℃에서 10~60분동안 초음파 처리(sonication)하는 단계; (C)초음파 처리한 녹차 또는 귀리를 4~45℃, 18~24시간 침지 숙성하는 단계; (D)침지 숙성한 녹차 또는 귀리를 착즙하는 단계; (E)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (F)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (G)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (H)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (B) 단계에서의 초음파 처리는 25℃에서 30분 동안 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (C) 단계에서의 침지 숙성 처리는 4℃의 온도에서 24시간 동안 수행하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 녹차 엑소좀, 귀리 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 여드름 개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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