KR102579898B1 - 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN COMPRISING POTATO DERIVED EXOSOMES}

본 발명은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경과 접촉하여 자극에 대한 신체를 보호하는 가장 기초적인 방어기관이며, 외적인 아름다움을 표현하는 중요한 기관이다.

외적인 아름다움이 젊음과 건강을 상징하는 판단의 기준일 뿐 아니라 자신감을 표출하여 업무능력에 영향을 주는 경쟁력으로 자리잡고 있기 때문에, 현대사회에서 피부를 관리하는 경향이 증가하고 있다.

그러나 나이가 들어감에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되고, 외적으로는 오존층 파괴와 같은 환경오염으로 인한 자외선, 자유 라디칼 및 활성산소의 증가로 인하여 발생하는 물리적, 화학적 자극 및 스트레스로 인한 피부의 정상기능이 약화되고 노화가 촉진되며 혈색이 나빠지고 피부가 주름지게 된다.

이러한 현상을 방지하고 톤이 밝은 피부를 유지하기 위해서, 기존에 알려진 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 산화로 인한 피부노화를 방지함으로써 피부를 개선시키고자 하는 노력이 이루어지고 있다.

화장품 업계는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 식용 작물을 사용한 다수의 제품을 개발하고 있다. 식용 작물은 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 점차 증가하고 있다.

그러나, 통상의 방법으로 수득된 식용 작물 유래의 추출물을 함유하는 화장료 제품은 피부 개선 효과 등 기능성이 충분히 구현되지 아니하며, 피부 장벽 통과가 어려운 문제가 있었다. 따라서, 우수한 기능성과 함께 피부 투과성 및 피부 개선 효과가 우수한 식용 작물 유래 화장료 조성물의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다.

Perocheau D, Touramanidou L, Gurung S, Gissen P, Baruteau J. Clinical applications for exosomes: Are we there yet? Br J Pharmacol. 2021 Jun;178(12):2375-2392. Xiong M, Zhang Q, Hu W, Zhao C, Lv W, Yi Y, Wang Y, Tang H, Wu M, Wu Y. The novel mechanisms and applications of exosomes in dermatology and cutaneous medical aesthetics. Pharmacol Res. 2021 Apr;166:105490.

본 발명의 목적은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 “감자(Solanum tuberosum)”는 가짓과(Solanaceae)에 속하는 다년생 식물으로서, 마령서(馬鈴薯), 하지감자, 북감저(北甘藷)라고도 불리는 것이다. 페루, 칠레 등의 안데스 산맥 원산으로, 온대지방에서 널리 재배한다. 높이는 60∼100cm이고 독특한 냄새가 난다.

본 발명에서, 상기 “엑소좀”은 이중 지질막으로 이루어진 30~150nm의 크기를 갖는 나노 소포체로, DNA, RNA 및 단백질 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있으며, 세포막으로부터 분비되어 세포와 세포 사이의 커뮤니케이션에 중요한 기능을 한다. 엑소좀은 리소좀(lysosome)에서 유래된 다소포체(Multi Vesicular Body, MVB)를 통해 세포 표면까지 이동되어 배출될 수 있다.

본 발명에서, 상기 “감자 유래 엑소좀” 또는 “감자 엑소좀”은 감자로부터 분리한 엑소좀을 의미한다.

본 발명에서, 상기 "피부 개선"은 피부 상태 악화와 관련된 증상의 정도를 감소시키는 것을 말한다.

구체적으로, 상기 “피부 개선”은 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부결 개선, 피부톤 개선, 피부 밝기 개선, 피부 재생 또는 피부 보습일 수 있다.

상기 "피부 탄력 개선"은 콜라겐 합성을 촉진하는 등 피부 지방조직의 부피를 증가시켜 늘어진 피부조직을 수축시키는 효과와 더불어 피부의 탱탱함을 유지 혹은 증가시키는 것을 의미한다.

상기 "피부 주름"은 피부가 노쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에서, 상기 "피부주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 의미한다.

상기 "피부톤"은 피부의 색깔이 강하거나 약한 정도의 상태를 의미하며, "피부톤 개선"은 일정하지 않은 피부톤을 일정하게 하는 것을 의미한다.

상기 “피부 밝기 개선"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소한 피부의 명도를 증가시키거나, 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 것을 포함한다.

상기 "피부 재생"은 피부 외부 및 내부 원인에 의해 손상된 피부 세포 또는 조직이 회복되는 것을 말한다. 외부 원인으로는 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 내부 원인으로는 질병, 스트레스 등을 들 수 있다.

상기 "피부 보습"은 피부의 수분이 감소되는 것을 저해 또는 억제하거나 피부의 수분 함유량을 증가시켜 피부 표면을 매끄럽게 하며, 윤기를 부여하는 것을 말한다.

피부는 외피(epidermis), 진피(dermis)와 피하(hypodermis)로 구성되며, 진피 구성 성분 중 가장 많은 부분을 차지하는 것은 콜라겐(collagen)으로 80 % 이상을 차지하며 피부의 구조적 안정성을 제공한다. 건강한 젊은 피부에 비하여, 지속적인 자외선 노출에 의한 광노화 피해가 축적될 경우 진피 콜라겐 분해가 발생하고, 외피가 수축되며 주름 형성으로 이어질 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는, 감자 엑소좀이 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포주의 성장을 촉진하고(도 6), 콜라겐 분해 효소인 MMPs의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 16).

따라서, 감자 유래 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물은 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부결 개선, 피부톤 개선, 피부 밝기 개선, 피부 재생, 피부 미백 및 피부 보습 효과로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로, 상기 “피부 개선”은 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 회복시키는 것일 수 있다.

자외선은 가시광선보다 파장이 짧고, X선보다 파장이 긴 전자기파이다. 자외선은 피부에 산화 스트레스 자극해 노화 현상을 유도하는데, 이를 '광노화(photoaging)'라고 하며, 햇빛에 자주 노출되는 부위인 얼굴, 목, 손등, 팔, 다리 등의 피부에서 잘 관찰된다. 자외선에 노출될 경우, 피부 세포의 기질 중 가장 큰 구성성분인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)의 파괴가 증가하며, 피부 구성 요소의 불균형이 초래되는 것으로 알려져 있다.

본 발명 일 실시예에서는, 감자 엑소좀이 자외선에 노출되기 전/후에 처리될 경우, 세포의 성장이 증가하는 것을 확인하였다(도 8). 또한, 콜라겐의 합성을 유의하게 증가시키며(도 10), 단백질 분해 효소인 MMPs 의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 14).

따라서, 감자 유래 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물은 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 회복시키는 효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로 상기 “피부 개선”은 피부 염증을 예방 또는 개선시키는 것일 수 있다. 피부는 자외선에 노출되는 등의 원인으로 염증 반응이 유발될 수 있다. 본 발명 일 실시예에서는, 감자 유래 엑소좀이 IL6, TNF alpha와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 것을 확인하였고(도 15 및 도 17), 또한, 자외선에 의해 증가된 염증성 사이토카인의 발현도 감소시키는 것을 확인하였다(도 9). 따라서, 감자 유래 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물은 피부 염증을 예방 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로, 상기 “감자 유래 엑소좀”은 MMP1, MMP2, MMP9, IL6 및 TNF alpha로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다(도 14 내지 도 17).

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 감자 유래 엑소좀을 포함하는 피부 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 “감자”, “엑소좀”, “감자 유래 엑소좀”, “감자 엑소좀” 및 “피부 개선”은 전술한 바와 같다.

식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 제제류로 제조될 수 있다.

상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.

본 발명의 감자 유래 엑소좀은 항노화, 항염증 및 항산화 효과를 가져 피부 개선 효과가 우수하다. 특히, 본 발명의 감자 엑소좀은 피부 투과성이 우수하여 피부 개선용 화장료 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 식물로부터 엑소좀을 분리하는 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 동적광산란법(DLS)을 통한 감자 엑소좀의 크기 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 감자 엑소좀의 제타 포텐셜(zeta-potential) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 감자 엑소좀을 투과 전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 감자 엑소좀의 세포 투과성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 5A는 감자 엑소좀의 세포 투과성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 5B는 형광 표지된 감자 엑소좀의 세포 투과성을 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하여 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 감자 엑소좀 또는 아스코르브산을 처리하여 HaCaT 세포주의 성장을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 감자 엑소좀의 항산화 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 7A는 감자 엑소좀의 H₂O₂에 대한 항산화 효능을 나타낸 것이다. 도 7B는 감자 엑소좀의 DPPH법을 이용한 항산화 효능을 나타낸 것이다.
도 8은 감자 엑소좀을 HaCaT 세포주에 자외선 조사 전/후 처리시 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 감자 엑소좀의 자외선 노출 전/후 감자 엑소좀 처리에 따른 유전자 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 9A는 감자 엑소좀의 HaCaT 세포주에서 MMP1 및 염증 유발 유전자(IL6, TNF alpha)의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 9B는 감자 엑소좀을 자외선 노출 전/후 처리시 유전자 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 감자 엑소좀을 HaCaT 세포주에 처리 후 세포 배양액에서 수용성 콜라겐 합성 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 감자 유래 엑소좀, 단백질(비교예 1) 및 유기용매 추출물(비교예 2)의 피부 세포 성장 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 11A 및 도 11B는 감자 유래 엑소좀(실시예 1), 감자로부터 회수된 동량의 단백질(비교예 1) 및 동량의 단백질로부터 분리된 알코올 추출물(비교예 2)을 HaCaT 세포 주에 농도를 달리하여 처리하고 세포 성장률을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HaCaT세포주에 자외선 조사 전/후 감자 엑소좀(실시예 1), 감자 유래 동량 단백질(비교예 1) 및 동량의 단백질로부터 유래된 알코올 추출물(비교예 2)을 첨가하고, 자외선 피해 예방 및 복구 효능을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 12A는 HaCaT 세포주에 대해 감자 엑소좀(실시예 1)을 자외선 조사 전/후에 처리할 경우 처리하지 않은 세포주 대비 상대적인 세포 생존률을 나타낸 그래프이다. 도 12B는 HaCaT 세포주에 대해 감자 유래 동량 단백질(비교예 1) 및 동량의 단백질로부터 유래된 알코올 추출물(비교예 2)을 자외선 조사 전/후에 처리할 경우 처리하지 않은 세포주 대비 상대적인 세포 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 13은 감자 유래 단백질, 알코올 추출물 및 대장균 유래 엑소좀의 광노화 예방 및 회복 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 13A는 HaCaT세포주에 자외선 조사 전 세균 DH5α 배양액에서 분리된 엑소좀(비교예 3)을 처리할 경우의 HaCaT 세포주 성장률 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 13B는 HaCaT에 자외선 조사 후 세균 DH5α 배양액에서 분리된 엑소좀(비교예 3)을 처리할 경우의 HaCaT 세포주 성장률 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도13C는 HaCaT에 자외선 조사 전 감자 추출물(비교예 1), 감자 알코올 추출물(비교예 2)을 처리할 경우 HaCaT 세포주 성장률 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도13D는 HaCaT에 자외선 조사 후 감자 추출물(비교예 1), 감자 알코올 추출물(비교예 2)을 처리할 경우 HaCaT 세포주 성장률 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 감자 유래 엑소좀, 감자 유래 단백질, 알코올 추출물 및 대장균 유래 엑소좀의 항노화 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 14A는 HaCaT 세포주에서 감자 단백질 추출물(비교예 1), 대장균 엑소좀(비교예 3)의 항노화 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 14B는 감자 알코올 추출물(비교예 2), 감자 엑소좀(실시예 1)의 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 14C는 HaCaT 세포주에 대한 자외선 조사 전/후의 감자 단백질 추출물(비교예 1), 대장균 엑소좀(비교예 3)의 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 14D는 HaCaT 세포주에 대한 자외선 조사 전/후에 감자 알코올 추출물(비교얘 2), 감자 엑소좀(실시예 1)의 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 감자 유래 엑소좀, 감자 유래 단백질, 알코올 추출물 및 대장균 유래 엑소좀의 항염증 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 15A는 HaCaT 세포주에서 감자 단백질 추출물(비교예 1), 대장균 엑소좀(비교예 3)의 항염증 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 15B는 감자 알코올 추출물(비교예 2), 감자 엑소좀(실시예 1)의 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 15C는 HaCaT 세포주에 대한 자외선 조사 전/후의 감자 단백질 추출물(비교예 1), 대장균 엑소좀(비교예 3)의 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 15D는 HaCaT 세포주에 대한 자외선 조사 전/후에 감자 알코올 추출물(비교예 2), 감자 엑소좀(실시예 1)의 유전자 발현 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 다양한 식용 작물 유래 엑소좀의 항노화 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 16A는 다양한 식용 작물들의 항노화 효능 스크리닝을 위하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도16B는 RT-PCR의 밴드 강도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 식용 작물 유래 엑소좀의 항염증 효능을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 17A는 다양한 식용 작물들의 항염증 효능 스크리닝을 위하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도17B는 RT-PCR의 밴드 강도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감자 유래 엑소좀(Potato Exosome, ExoP)

감자를 세척 후 껍질을 제거하고 녹즙기를 이용해 착즙하였다. 착즙액은 5,000~9,000 g, 4℃에서 30~120 분, 10,000~20,000 g, 4℃에서 60~300 분 및 30,000~40,000 g, 4℃에서 60~300 분 동안 순차적으로 원심분리하여 상층액을 회수하고 0.8 μm 필터에 여과하였다. 이어서, 여과액을 100,000~180,000 g, 4℃에서 2~24 시간 동안 초고속 원심분리하여 상층액은 제거하고, 엑소좀을 포함하는 침전된 펠렛(pellet)을 취하여 PBS(인산 완충액, pH 6.5~7.5)에 용해하였다(도 1).

비교예 1. 감자 유래 단백질(Ext)

감자를 세척 후 분쇄하였다. 전분을 침전시킨 후, 10,000 g, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하여 비 용해 물질을 제거하고 감자 유래 단백질을 분리하였다. 얻어진 감자 단백질은 BCA 방법으로 단백질 정량하였다.

비교예 2. 감자 단백질의 알코올 추출물(Alcohol Extract, AE)

에탄올(99%)과 비교예 1에서 분리된 감자 유래 단백질(1 mg/ml)을 2:1의 비율로 혼합해 섞어주었다. 100~200 rpm, 실온에서 20분간 강하게 흔들어 준 후, 1000 g, 4℃에서 10시간 동안 원심분리하여 비 용해 화합물을 제거하였다. 상층액을 2ml 튜브에 옮긴 후, 필름으로 입구를 막고 증발 유입구를 도입한 뒤, 37 ℃, 120 rpm 조건에서 밤새 알코올을 증발시켜 감자 단백질의 알코올 추출물을 분리하였다. 잔여 화합물에 PBS 첨가로 부피를 조절하여, 알코올 추출 전의 감자 추출물과 동일 농도를 유지하였다.

비교예 3. 대장균(DH5a) 유래 엑소좀(ExoBAC)

단일 콜로니 대장균(DH5a)을 10 ml를 LB 액체 배지에서 37 ℃, 150 rpm으로 밤새 배양 후, 500 ml의 새 LB 액체 배지에 첨가하고, 배양을 계속하였다. 대장균(DH5α)이 OD 600 nm에서의 값이 1.5-1.7에 도달할 때, 균주 배양액을 회수하고 10,000 ~ 15,000 g, 4 ℃에서 원심분리하여 상층액만 회수하였다. 8 μm 필터를 통과한 상층액은 100,000~150,000 g, 4 ℃ 에서 초고속 원심분리한 후, PBS (인산 완충용액, pH 6.5~7.5)를 이용해 엑소좀을 용해하고 BCA 방법으로 단백질 정량하였다.

비교예 4. 배 유래 엑소좀

배(pear)로부터 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하였다.

비교예 5. 무 유래 엑소좀

무(radish)로부터 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하였다.

비교예 6. 오렌지 유래 엑소좀

오렌지(citrus)로부터 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하였다.

실험예 1. 감자 엑소좀의 물리적 특성 확인

1-1. 감자 엑소좀 크기 측정

감자 엑소좀(실시예 1)을 최종 농도가 0.1 mg/ml가 되도록 PBS(Phosphate Buffered Saline, pH 6.5~7.5)에 희석시킨 후, 입도 & 제타 분석기(ELS-1000ZS Particle Size & Zeta potential Analyzer, Otsuka Electronics, Japan)를 이용한 동적광산란(Dynamic light scattering) 측정을 통하여 엑소좀의 크기를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 감자 엑소좀은 평균 지름이 60 nm으로 일반적인 엑소좀 크기를 나타낸다.

1-2. 감자 엑소좀 제타 포텐셜 측정

감자 엑소좀(실시예 1)을 최종 농도가 0.1 mg/ml가 되도록 PBS(Phosphate Buffered Saline, pH 6.5~7.5)에 희석시킨 후, 입도 & 제타 분석기(ELS-1000ZS Particle Size & Zeta potential Analyzer, Otsuka Electronics, Japan)를 이용하여 제타 전위(zeta potential)를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 감자 엑소좀은 제타 포텐셜(zeta potential)이 -19 mV로 일반적인 엑소좀의 제타 포텐셜을 나타내었다. 이는, 본 발명에서 분리된 감자 엑소좀이 응집이나 침전이 없는 상대적인 안정성을 가짐을 의미한다.

1-3. 투과 전자 현미경을 이용한 감자 엑소좀 촬영

감자 엑소좀(실시예 1) 형태 관찰을 위해 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM) 촬영을 하였다. 감자 엑소좀 샘플은 2 % 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 10 초간 염색 후 적외선 램프(infrared lamp)로 10 분 동안 건조 과정을 거치고 투과 전자 현미경 (JEM-1011, JEOL, Japan)을 이용하여 촬영하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 투과 전자 현미경 촬영을 하였을 때 약 100 nm 미만 크기의 이중막 형태의 타원형 엑소좀이 관측되어, 본 발명의 감자 엑소좀은 일반적인 엑소좀 크기와 형태를 나타냄을 확인하였다.

실험예 2. 감자 엑소좀의 세포 투과성 확인

2-1. 공초점 현미경 촬영

감자 엑소좀(실시예 1) 300 μg과 1 μl의 ExoGlow™-Protein EV Labeling Kit (Green) (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)를 4시간 동안 혼합 반응시키고, Exoquick(System Biosciences, Inc.)을 이용하여 형광 표지된 엑소좀만 분리하였다. 1x10⁵ 셀/웰 농도의 HaCaT 세포주에 50, 100 μg의 형광 표지된 엑소좀을 첨가하고 24 시간 후 공초점 현미경(LSM980, Carl Zeiss)을 이용하여 세포주 촬영을 하였다.

그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 세포 자체나 형광 염색물질만을 처리한 세포(음성 대조군)에서는 형광이 감지되지 않는 반면, 형광 표지된 감자 엑소좀(50, 100 μg/ml)을 처리한 세포에서는 형광이 인식됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 감자 엑소좀이 외부의 도움없이 자체적으로 HaCaT 세포주를 투과할 수 있음을 나타내는 것이다.

2-2. 유세포 분석

감자 엑소좀(실시예 1) 300 μg과 1 μl의 ExoGlow™EV Labeling Kit (Green) (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)를 4시간 동안 혼합 반응시키고, Exoquick(System Biosciences, Inc.)을 이용하여 형광 표지된 엑소좀만 분리하였다.

HaCaT 세포주를 12 웰 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰 농도로 분주하고 10 % FBS, 각 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 4시간 동안 부착 배양 후, 형광 표지된 감자 엑소좀을 100, 200 μg/ml로 처리하여 배양하였다. 각 실험은 2회씩 반복 실행하였다. 24시간 배양 이후 각 웰당 1 ml DPBS로 2회 세척하고, 세포 회수 후, 300 μl staining buffer에 재현탁시켰다.

엑소좀의 세포 투과성은 형광 표지 된 감자 엑소좀이 유입된 세포 비율을 유세포 분석기계 FACS CantoII (Becton Dickinson and Company)로 측정하고 BD FACSDIva 8.0 software 프로그램을 이용해 비교 분석하였다. 대조군은 형광 표지 된 감자엑소좀이 처리되지 않은 HaCaT 세포주를 사용하였다.

그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, 대조군이나 형광 물질만을 처리한 세포주 대비, 형광 표지된 감자 엑소좀을 처리한 경우 세포 내에서 강한 형광을 나타내어, 본 발명의 감자 엑소좀이 세포내로 투과되었음을 보였다.

실험예 3. 감자 엑소좀의 피부 세포 독성 확인

감자 엑소좀(실시예 1)이 인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포 성장에 미치는 영향을 WST-1 어세이(WST-1 assay)를 이용하여 측정하였다. 양성 대조군(Positive control)으로는 아스코르브산(ascorbic acid, 비타민 C)을 사용하였다.

구체적으로, HaCaT(인체 피부 유래 각질형성세포) 세포주를 96 웰 플레이트에 5X10³ 세포/웰의 농도로 분주한 후 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Thermo Fischer, USA) 배지에서 37℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. HaCaT 배양액에 실시예 1(25, 50, 100, 150, 200 μg/ml)과 아스코르브산(1, 3, 5, 100 μg/ml)을 동일한 양으로 처리하였다. 첨가 후 24, 48시간이 지났을 때 WST-1을 첨가하여 포르마잔(formazan) 형성을 450 nm 파장에서 읽어 정량하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 아스코르브산을 100 μg/ml 농도로 48시간 처리 시 처리하지 않은 경우 대비 HaCaT 세포주 성장이 90 % 수준으로 감소하여 세포 성장이 억제되었다. 한편, 저농도(1, 3, 5 μg/ml)의 아스코르브산을 처리하였을 때는 아스코르브산을 처리하지 않은 경우 대비 HaCaT 세포 수의 변화가 없는 것으로 관찰되어, 아스코르브산을 100 μg/ml, 48시간 처리 시 세포 성장이 감소된 것은 세포 밀도 및 환경적 영향으로 인한 세포사멸이 아니라, 고농도 아스코르브산의 독성으로 인해 세포 성장이 억제된 것이다.

반면, 실시예 1은 25, 50, 100, 150, 200 μg/ml 모든 농도에서 24 시간, 48 시간 처리한 경우 세포 성장이 억제되지 않아 세포 독성을 보이지 않았다. 이는, 본 발명의 감자 엑소좀은 높은 농도로 장기간 사용하더라도 피부 세포에 독성을 나타내지 않음을 나타내는 것이다.

실험예 4. 감자 엑소좀의 항산화 효능 확인

4-1. 세포 성장 비교

HaCaT 세포주에 대표적인 산화제인 H₂O₂를 단독으로 처리하거나 H₂O₂ 처리 30 분 전에 감자 엑소좀(실시예 1)을 첨가하고 배양하여 WST-1 어세이를 이용한 세포 성장 변화를 조사하였다. WST-1 어세이는 실험예 3을 참고한다.

그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포주에 H₂O₂ 처리 전에 감자 엑소좀을 첨가할 경우, H₂O₂에 의한 세포 사멸이 방지되는 효과를 보여주었다. 이는, 감자 엑소좀이 산화적 스트레스로 인한 피부 세포 사멸을 방지하는 효과가 있음을 나타내는 것이다.

4-2. DPPH 어세이

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)와 1, 2, 4 mg/ml 농도의 감자 엑소좀(실시예 1)을 혼합하고 파장 517 nm에서 흡광도를 측정하여, 감자 엑소좀이 직접적으로 DPPH 활성을 억제하는지 조사하였다. 대조군으로는 대표적인 항산화 물질인 아스코르브산(ascorbic acid)을 이용하였다. 산화 억제율은 아래의 식 1을 통해 계산하였다.

[식 1]

산화 억제율(Inhibition, %) =(샘플 흡광도-대조군 흡광도)/(대조군 흡광도)

그 결과, 도 7B에 나타난 바와 같이, 실시예 1을 DPPH와 반응시켰을 경우, 농도 의존적으로 DPPH를 환원시키는 능력, 즉 산화 억제능력을 나타내었다. 이는, 감자 엑소좀이 우수한 항산화 능력이 있음을 나타내는 것이다.

실험예 5. 감자 엑소좀의 광손상(photodamage) 예방 및 회복 효능 확인

HaCaT 세포주에 자외선(UVB, 15 mJ/cm²) 조사(irradiation) 전/후 50 μg/ml 농도의 감자 엑소좀(실시예 1)을 처리하여, 광손상(photodamage)에 대한 감자 엑소좀의 효능을 WST-1 어세이를 이용한 세포 성장 변화를 통해 확인하였다. WST-1 어세이는 실험예 3을 참고한다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 자외선 노출은 HaCaT 세포주 성장을 50 % 정도 억제시키는 반면, 실시예 1이 미리 전처리된 HaCaT 세포주의 성장은 실시예 1을 처리하지 않은 경우 대비 40 % 정도 증가되어, 실시예 1이 자외선에 의한 피부 세포 손상을 방지함을 확인하였다. 또한, 이미 자외선에 노출된 HaCaT 세포주에 실시예 1을 첨가할 경우, 세포주의 성장이 증가하여, 자외선으로 인한 세포 손상 후 회복 효과가 있음을 보여주었다.

이는, 감자 엑소좀이 자외선에 의한 피부 손상을 예방하는 동시에 회복시키는 효과를 가짐을 보여주며, 광노화를 예방 및 개선하는 효능이 있음을 나타내는 것이다.

실험예 6. 자외선 노출 전/후 감자 엑소좀 처리에 따른 유전자 발현 변화 확인

6-1. HaCaT 세포주 배양 및 RT-PCR(역전자 중합효소 연쇄반응)

HaCaT(인체 피부 유래 각질형성세포) 세포주를 96 웰 플레이트에 5X10³ 세포/웰의 농도로 분주한 후 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Thermo Fischer, USA) 배지에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다.

상기 배양된 HaCaT 세포주에서 RNeasy Mini Kits(Qiagen)를 이용하여 총(total) RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 Nanodrop(Denovix)을 이용하여 정량하였다. 1 μg의 추출된 총 RNA와 4 μg의 oligo-dT 프라이머를 총 13.4 μl 볼륨에 혼합하고 65 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, Superscript II (400 U) (Invitrogen, Carlsbad, CA) 효소 400 U(유닛)을 첨가한 이후 42 ℃에서 추가로 90 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

상기 cDNA를 PCR Premix(AccuPower PCR PreMix, 바이오니아)를 이용하여 PCR을 실행하였으며, 아래 표 1의 각 유전자별 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 5 분 동안 1회 반응시킨 후, 95 ℃ 1 분, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분 반응을 한 주기로 하여 25 내지 33 싸이클 수행하고, 4 ℃에서 저장하였다. PCR 반응에는 MiniAmp Plus(Thermo Fisher, USA) 기기를 이용하였다.

서열번호	프라이머 종류	서열 (5' - 3')
1	GAPDH Forward	ATTCCATGGCACCGTCAAGG
2	GAPDH Reverse	TGATGGCATGGACTGTGGTC
3	IL6 Forward	CCAGTACCCCCAGGAGAAGA
4	IL6 Reverse	CAGCTCTGGCTTGTTCCTCA
5	TNF alpha Forward	GTGACAAGCCTGTAGCCCAT
6	TNF alpha Reverse	CTGAGTCGGTCACCCTTCTC
7	MMP1 Forward	GGTGTGAGTCCAAACAAGGTG
8	MMP1 Reverse	CCTTGCCTATCCAGGGTGAC
9	MMP2 Forward	GCCCCCAAAACGGACAAAG
10	MMP2 Reverse	CCAGACTTGGAAGGCACGAG
11	MMP9 Forward	TCTATGGTCCTCGCCCTGAA
12	MMP9 Reverse	GCTCCTCAAAGACCGAGTCC
13	GSTA4 Forward	GAGGGGACACTGGATCTGCT
14	GSTA4 Reverse	GGAGGCTTCTTCTTGCTGCC

6-2. 자외선 노출 후 감자 엑소좀 처리에 따른 유전자 발현 변화

배양된 HaCaT 세포주에 자외선(15 mJ/cm²)을 조사(irradiation)하고, 감자 유래 엑소좀(실시예 1)을 25, 50 μg/ml 농도로 처리한 다음, HaCaT 세포주에서 RNA를 분리하여 RT-PCR(reverse transcription PCR)을 통하여 MMP1, IL6 및 TNF alpha 유전자 발현 변화 양상을 분석하였다.

그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포 주에 자외선을 처리할 경우, 콜라겐 분해효소 MMP1과 염증 유발인자 TNF alpha의 발현이 현저히 증가하였으며, 또 다른 염증인자인 IL6의 발현도 증가하였다. 자외선에 노출된 HaCaT 세포주에, 감자 엑소좀을 농도를 달리하여 처리한 결과, MMP1과 IL6는 농도 의존적으로 발현이 감소하였으며, 특히, TNF alpha는 비교적 낮은 25 μg/ml 농도만을 처리한 경우에서도 완전한 발현 억제효과를 보여, 감자 유래 엑소좀이 낮은 농도에서도 피부에 대한 자외선 손상을 최소화할 수 있음을 보여준다.

6-3. 자외선 노출 전/후 감자 엑소좀 처리에 따른 유전자 발현 변화

HaCaT 세포주에서 감자 유래 엑소좀(실시예 1) 50 μg/ml를 자외선 조사 전/후에 처리하고 유전자 발현 양상을 분석하였다.

그 결과, 도 9B에 나타난 바와 같이, 감자 엑소좀을 미리 전 처리한 HaCaT 세포주에 자외선을 조사할 경우, 엑소좀을 처리하지 않은 경우에 비해, 콜라겐 분해 효소 유전자(MMP1, MMP2, MMP9)와 염증 유도 싸이토카인 유전자(IL6, TNF alpha)의 발현이 상당히 억제됨을 보여, 본 발명에 따른 감자 유래 엑소좀이 자외선에 의한 광 노화 현상을 예방할 수 있음을 나타내는 것이다.

또한, HaCaT 세포주에 자외선을 미리 조사하고 그 이후에 감자 엑소좀(50 ㎍/㎖)을 처리할 경우에도, 콜라겐 분해 효소 유전자(MMP1, MMP2, MMP9)와 염증 유도 싸이토카인 유전자(IL6, TNF alpha)의 발현이 모두 감소되어 자외선 손상으로 인한 피부를 회복시키는 능력이 있음을 보인다.

아울러, 자외선 조사와 감자 엑소좀 처리 선후 관계에 상관없이 감자 엑소좀은 GSTA4의 발현을 감자 엑소좀을 처리하지 않은 경우에 비해 증가시켰다(도 7B). GSTA4는 그 자체가 세포내 방어용도의 항산화 효소를 만드는 유전자이고, 외부 산화 공격 등에 의해 발현이 증가하는 유전자로, 자외선 조사가 이루어지면 세포주는 이에 대한 방어로 GSTA4 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 감자 엑소좀은 GSTA4의 발현을 추가로 증가시켜, 자외선 및 그로 인한 활성산소의 공격으로부터 세포 사멸을 막고 세포 생존율을 높이는데 기여함을 나타내는 것이다.

실험예 7. 감자 엑소좀의 콜라겐 합성에 미치는 영향 측정

HaCaT 세포주를 96 웰 플레이트에 5X10³ 세포/웰의 농도로 분주한 후 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 이후, 감자 엑소좀(실시예 1)을 50, 100 및 150 μg/ml 농도로 처리하고, 24시간이 지난 다음 자외선(UVB, 15mJ/cm²)을 조사하고 추가로 24시간동안 배양하였다.

세포 배양액에 분비된 수용성 콜라겐은 Soluble Collagen Assay kit (abcam, ab240150)를 이용하여 측정하였다. 세포 배양액을 회수하여, 10,000 g, 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리하였다. 이후, 20μl의 상층액에 80μl collagen assay buffer를 첨가하여, 37 ℃에서 60 분 동안 반응시키고, 75 μl의 working solution을 첨가 후 5 분간 반응시켰다. 그 다음, 25μl의 developer working solution 첨가 후, 차광 상태에서 15분간 흔들어 배양하였다. 최종적인 수용성 콜라겐 합성 효능은 형광 플레이트 리더기에서 Ex/Em=376/468 nm의 파장에서 분석하였으며, 96 웰 플레이트에 well 당 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2 μg의 콜라겐에 80 μl의 Collagen Assay Buffer를 분주하여 준비된 스탠다드 커브를 이용해 계산하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포주에 자외선을 조사할 경우, 세포에서 합성되어 배양액으로 배출된 수용성 콜라겐의 양이 감소하였다. 그러나, 실시예 1을 처리한 경우, 수용성 콜라겐의 양이 통계적으로 유의하게 증가하였다. 이는, 감자 엑소좀이 세포 투과, MMP 유전자 억제 등의 기전을 통해 수용성 콜라겐의 합성을 증가시키는 것으로 사료되며, 본 발명의 감자 유도 엑소좀이 콜라겐 합성 증가를 통한 항노화 효과가 있음을 나타내는 것이다.

실험예 8. 감자 유래 엑소좀, 단백질 및 유기용매 추출물의 피부 세포 성장 효능 비교

감자 엑소좀의 항노화 효과가 감자 유래 단백질이나 이의 유기용매 추출물과 구별되는 것임을 확인하였다. 감자 엑소좀(실시예 1), 감자 유래 단백질(비교예 1) 및 감자 단백질의 알코올 추출물(비교예 2) 동일한 양을 HaCaT 세포주에 각각 25 μg/ml 및 50 μg/ml 농도로 처리하고, 48 시간 후에 WST-1 어세이를 통하여 세포 성장률을 비교하였다. WST-1 어세이는 실험예 3의 방법을 참조한다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군 세포주와 비교할 때 실시예 1은 통계적으로 유의하게 세포 성장을 촉진하는 반면(p<0.005), 비교예 1은 아무런 차이를 보이지 못했으며, 비교예 2는 오히려 통계적으로 유의하게 세포 성장을 억제시켰다. 이는, 본 발명의 순수하게 분리된 감자 엑소좀은 동량의 감자 유래 단백질이나, 동량의 감자 단백질에서 유도되는 알코올 추출물과는 다른 특이적인 세포 성장 촉진 효능을 보임을 나타내는 것이다.

실험예 9. 감자 유래 엑소좀, 단백질 및 유기용매 추출물의 광노화 예방 및 회복 효능 비교

감자 엑소좀의 자외선에 의한 세포 손상 예방 및 회복 효과가 감자 유래 단백질이나 이의 유기용매 추출물과 구별되는 것임을 확인하기 위하여, 감자 유래 단백질(비교예 1)과 감자 단백질의 알코올 추출물(비교예 2)도 동일한 세포 성장 효능을 보이는지 비교분석하였다. WST-1 어세이는 실험예 3을 참조한다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 실시예 1이 HaCaT 세포주에 자외선 조사되기 전에 첨가될 경우, 자외선에 의한 세포사멸이 통계적으로 유의하게 감소하였으며, 자외선 조사 후에 첨가될 경우에도 통계적으로 유의한 손상회복 능력을 보였다.

이와 같이 실시예 1이 통계적 유의성을 띄고 자외선으로 인한 세포 손상을 예방 및 회복시키는데 비해, 비교예 1 및 비교예 2는 피부 세포에서 자외선에 대한 어떠한 예방이나 복구 효능을 제공하지 못하였다.

따라서 감자 엑소좀은 자외선 조사에 의한 손상으로부터 HaCaT 세포주를 보호, 광노화를 예방함과 동시에 광손상의 회복 및 치료 효능을 보인다. 반면, 감자 단백질 추출물 및 감자 단백질 알코올 추출물은 HaCaT 세포주를 자외선 손상로부터 예방하지도 못하며 이미 진행된 광손상을 회복하는 능력도 보이지 못한다. 이와 같은 결과는 자외선에 의한 세포 손상의 예방 및 회복 효과는 감자 엑소좀의 특이적인 효과임을 나타내는 것이다.

실험예 10. 감자 유래 단백질, 알코올 추출물 및 대장균 유래 엑소좀의 광노화 예방 및 회복 효능 비교

감자 엑소좀에 의한 광손상 예방 및 회복 효능이 다른 엑소좀이나 감자 유래 다른 성분에서 나타나는 것인지 확인하였다. 대조군으로 감자 유래 단백질(비교예 1), 감자 단백질의 알코올 추출물(비교예 2) 및 대장균 유래 엑소좀(비교예 3)을 이용하였다. WST-1 어세이는 실험예 3을 참조한다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 자외선 조사 전 비교예 3을 처리한 경우 세포 성장률에 차이가 없어, 비교예 3은 HaCaT 세포주에서 광손상으로부터 피해를 예방하는 효능을 제공하지 못하였다(도 13A). 또한, 자외선 조사 후 비교예 3을 처리한 경우에도 세포 성장률의 차이가 없어, 광손상으로부터 회복 효과도 보이지 못하였다(도 13B). 아울러, 비교예 1 및 비교예 2도 실험예 7에서 동량의 감자 엑소좀이 보였던 광손상 예방(도 13C) 및 회복(도 13D)을 보이지 못하였다.

따라서, 감자 엑소좀의 자외선에 의한 광손상 예방 및 회복 능력이 단지 엑소좀이란 물질이기 때문에 일어나는 것이거나, 감자 유래 물질이기 때문에 일어나는 것이 아닌, 감자 유래 엑소좀의 매우 특이적인 효능임을 나타내는 것이다.

실험예 11. 감자 유래 엑소좀, 감자 유래 단백질, 알코올 추출물 및 대장균 유래 엑소좀의 항노화 효능 비교

감자 유래 엑소좀(실시예 1), 감자 유래 단백질(비교예 1), 감자 단백질의 알코올 추출물(비교예 2) 및 대장균 유래 엑소좀(비교예 3)을 HaCaT 세포주에 같은 양 처리하고 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 항노화 유전자 발현 변화를 조사하였다. 실험예 4의 방법을 참고한다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 1이 처리된 경우 MMP1, MMP2 및 MMP9 발현을 억제하는데 비해(도 14B), 비교예 1, 2 및 3은 이들 유전자 발현에 전혀 영향을 미치지 못하였다(도 14A 및 14B).

또한, 실시예 1이 HaCaT 세포주에 자외선(UV) 조사 전 또는 후에 처리될 경우 MMP1, MMP2 및 MMP9 발현을 억제하거나 최소화하는데 비해(도 14D), 비교예 1, 2 및 3은 이들 유전자 발현을 전혀 감소시키지 못하고, 오히려 증가시키는 경향도 보였다(도 14C 및 14D). 따라서, 본 발명의 감자 유래 엑소좀(실시예 1)은 피부에 항노화 효능을 보이는 것을 확인하였다.

실험예 12. 감자 유래 엑소좀, 감자 유래 단백질, 알코올 추출물 및 대장균 유래 엑소좀의 항염증 효과 비교

감자 유래 엑소좀(실시예 1), 감자 유래 단백질(비교예 1), 감자 단백질의 알코올 추출물(비교예 2) 및 대장균 유래 엑소좀(비교예 3)을 HaCaT 세포주에 같은 양 처리하고 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 항염증 유전자 발현 변화를 조사하였다. 실험예 4의 방법을 참고한다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 실시예 1이 처리된 경우 IL6 및 TNF alpha 발현을 억제하는데 비해(도 15B), 비교예 1, 2 및 3은 이들 유전자 발현에 전혀 영향을 미치지 못하였다(도 15A 및 15B).

또한, 실시예 1이 HaCaT 세포주에 자외선(UVB, 15mJ/cm²) 조사 전 또는 후에 처리될 경우 IL6 및 TNF alpha 발현을 억제하거나 최소화하는데 비해(도 15D), 비교예 1, 2 및 3은 이들 유전자 발현을 전혀 감소시키지 못하고, 오히려 증가시키는 경향도 보였다(도 15C 및 15D).

따라서, 본 발명의 감자 유래 엑소좀(실시예 1)은 피부에 항염증 효능을 보이는 특이적인 물질임을 나타내는 것이다.

실험예 13. 다양한 식용 작물 유래 엑소좀의 항노화 효능 비교

다양한 식용 작물 유래 엑소좀의 항노화 효능을 비교하기 위해 HaCaT 세포주에 감자 유래 엑소좀(실시예 1), 배 유래 엑소좀(비교예 4), 무 유래 엑소좀(비교예 5) 및 오렌지 유래 엑소좀(비교예 6)을 각각 50 μg/ml 농도로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 이 후, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 항노화 유전자 발현 변화를 비교하였다. 실험예 4의 방법을 참고한다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 모든 식용 작물 엑소좀은 GAPDH의 발현에 영향이 미치지 않았으며, 실시예 1은 MMP1 발현을 83.1 % 억제하고, MMP2 및 MMP9 발현을 각각 91, 74 % 억제시켜, 비교예 4, 5 및 6 보다 MMPs 억제 효과가 우수하였다.

이는, 감자 유래 엑소좀은 다양한 작용식물들 중 가장 우수한 항노화 효능이 있음을 나타내는 것이다.

실험예 14. 다양한 식용 작물 유래 엑소좀의 항염증 효능 비교

다양한 식용 작물 유래 엑소좀의 항염증 효능을 비교하기 위해 HaCaT 세포주에 감자 유래 엑소좀(실시예 1), 배 유래 엑소좀(비교예 4), 무 유래 엑소좀(비교예 5) 및 오렌지 유래 엑소좀(비교예 6)을 각각 50 μg/ml 농도로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 이 후, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 항염증 유전자 발현 변화를 비교하였다. 실험예 4의 방법을 참고한다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 모든 식용 작물 엑소좀은 GAPDH의 발현에 영향이 미치지 않았으며, 실시예 1은 IL6 및 TNF alpha 발현을 각각 74, 77 % 억제시켜, 비교예 4, 5 및 6 보다 IL6 및 TNF alpha 억제 효과가 우수하였다.

이는, 감자 유래 엑소좀은 다양한 작용식물들 중 가장 우수한 항염증 효능이 있음을 나타내는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 감자 유래 엑소좀을 포함하는 in vitro에서의 단백질 활성 억제용 조성물로, 상기 단백질은 MMP2 및 MMP9 중 선택되는 것인, in vitro에서의 단백질 활성 억제용 조성물.
   
2. 감자 유래 엑소좀을 포함하는 in vitro에서의 사이토카인 억제용 조성물로, 상기 사이토카인은 IL6 및 TNF alpha로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, in vitro에서의 사이토카인 억제용 조성물.
   
3. 감자 유래 엑소좀을 포함하는 in vitro에서의 GSTA4 유전자의 발현 증가용 조성물.
   
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