KR101522369B1 - 저백피 및 솔나물 추출물을 함유하는 항노화 및 미백용 화장료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저백피 및 솔나물 추출물을 함유하는 항노화 및 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 저백피 및 솔나물 복합추출물은 콜라겐 및 TIMP-1의 발현, 트로포엘라스틴의 발현, MMP-1의 발현 억제, 티로시나제 및 MITF의 유전자 발현 억제 효과가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항노화 및 미백용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

저백피 및 솔나물 추출물을 함유하는 항노화 및 미백용 화장료조성물{Cosmetic composition containing Ailanthi Radicis Cortex extract and Galium verum extract for anti-aging and whitening}

본 발명은 저백피(Ailanthi Radicis Cortex) 및 솔나물(Galium verum) 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 저백피 및 솔나물의 복합 추출물을 함유하여 우수한 항노화 활성 및 미백 활성을 나타내는 항노화 및 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타난다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 염증반응이 일어나고 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다(Parrado et al., 1999). 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Wang et al., 1999). 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며[4], MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다(Fisher et al., 1996). MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-macroglobulin이나 TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다(Fisher et al., 1999). 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며(Seo et al., 2001), 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다(Tsuji et al., 2001).

멜라닌은 피부와 머리카락의 색상을 결정하는 주요한 인자이며 자외선으로부터 피부세포를 보호하기 위한 역할을 하며, 태양 광선으로부터 들어오는 자외선을 차단하는 색소이다. 이러한 멜라닌의 생성은 기저층의 멜라닌세포(melanocyte)내 멜라닌소체(melanosome)라는 소기관에서 합성된다(Hearing, 1999). 합성된 멜라닌색소는 멜라닌세포의 수지상돌기 (dendrite)를 통하여 인접세포인 각질세포(keratinocyte)로 전달되며, 전달된 멜라닌색소는 각질세포를 통하여 피부 내 여러 부위에 분포하게 된다(Lowell, 1991). 그러나 멜라닌이 비정상적으로 소량 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 일광, 호르몬 변화, 염증 또는 약제 등 여러 가지 환경적 요인에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되거나 색소가 침착되면 기미, 주근깨를 형성하며, 광노화로 깊은 주름살과 잔주름살 생성, 색소 탈색, 피부건조, 탄력성 감소 등의 변화가 나타난다(Lim et al., 2010; Park et al., 1998). 이와 같은 병변으로부터 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 그러므로 이러한 색소 침착 현상을 방지하고 미백효과를 얻기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일 부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다. 이 멜라닌 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 효소가 바로 티로시나제(tyrosinase)이며 멜라노좀(melanosome) 내의 티로신(tyrosine)을 산화시켜 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)를 만드는 티노신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)로 DOPA를 산화시켜 도파크롬(dopachrome)을 만드는 DOPA 옥시다제(oxidase)로 작용하여 최종적으로 멜라닌 폴리머(melanin polymer)를 합성하게 된다. 따라서 피부 미백제의 개발에 있어서 티로시나제(tyrosinase)활성 억제 실험은 유용한 일차 평가법으로 인정되고 있다(Pavel and Muskiet 1980; Prota 1990).

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 미백 기능성화장품의 경우 닥나무추출물, 알부틴(arbutin), 에칠아스코빌에텔, 유용성 감초추출물, 아스코빌글루코사이드와 마그네슘아스코빌포스페이트가 있다. 그리고 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 천연소재로부터 항노화 및 미백 효능을 평가 확인하고 이에 따라 피부 안전성이 확보된 새로운 천연 항노화 및 미백 화장료 조성물을 개발하고자 하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

[1] "저백피 추출물을 함유하는 화장료 조성물."(공개번호:10-2008-0029364)

[1] Antonicelli F, Bellon G, Debelle L and Hornebeck W. 2007. Elastin-elastases and inflamm-aging. Curr. Top. Dev. Biol. 79, 99. [2] Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J and Kang S. 1996. Molecular basis of sun-induced premature ageing and retinoid antagonism. Nature 379, 335-339. [3] Fisher GJ, Talwar HS, Lin J, Voorhees JJ. 1999. Molecular mechanisms of photoaging in human skin in vivo and their prevention by all-trans retinoic acid. Photochem. Photobiol. 69, 154-157. [4] Hearing VJ. 1999. Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organization. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 4, 24-28. [5] Isenburg JC, Simionescu DT and. Vyavahare NR. 2004. Elastin stabilization in cardiovascular implants: improved resistance to enzymatic degradation by treatment with tannic acid. Biomaterials. 25, 3293. [6] Lim SW, Ryoo HC, and Lee SH. 2002. Understanding of skin aging and its prevention and care. The J. Skin Barrier Res. 4, 71-80. [7] Lowell AG. 1991. Physiology, biochemistry and molecular biology of the skin(2nd ed.) Oxford University Press Inc. New York, USA. p.891. [8] Park JM, Lee JY, Park TS, Hyun ST, Kim HH, Cho YJ, Kwon OJ, Son AR, Kim DS, and An BJ. 2008. Astudy on the cosmeceutical activities of prunus sargentii R. J.Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 51, 70-78. [9] Parrado JM, Bougria A, Ayala A, Castano A and Machado. 1999. Effects of aging on the various steps of pro-tein synthesis: fragmentation of elongation factors. Free Radic. Biol. Med. 26, 362-370. [10] Pavel S. and Muskiet FA. 1980. Euemlanin (precursor) metabolites as markers for pigmented malignant melanoma, a preliminaryreport. Cancer Detect Prev. 6, 311-318. [11] Prota G. 1990. Recent advances in the chemistry of melanogenesis in mammals. J. Invest. Dermatol. 75, 122-128. [12] Seite S, Zucchi H, Septier D, Igondjo-Tchen S, Senni K and Godeau G. 2006. Elastin changes during chronological and photo-ageing: the important role of lysozyme. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 20, 980. [13] Seo JY, Lee SH, Youn CS, Choi HR, Rhie GE, Cho KH, Kim KH, Park KC, Eun HC and Chung JH. 2001. Ultraviolet radiation increases tropoelastin mRNA expression in the epidermis of human skin in vivo, J. Invest. Dermatol. 116, 915. [14] Tsuji N, Moriwaki S, Suzuki Y, Takema Y and Imokawa G. 2001. The role of elastases secreted by fibroblasts in wrinkle formation: implication through selective inhibition of elastase activity, Photochem. Photobiol. 74, 283. [15] Wang Y, Johnson AR, Ye QZ, Dyer RD. 1999. Catalytic activities and substrate specificity of the human membrane type 4 matrix metalloproteinase catalytic domain. J. Biol. Chem. 274, 33043-33049. [16] Zhao c, Shao J, Cao D, Zhang Y and Li x. 2009. Chemical constituents of Galium verum. China Journal of Chinese Materia Medica. 21

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서 저백피 및 솔나물 추출물을 함유하여 항노화 및 미백 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 저백피 및 솔나물 추출물을 함유하는 항노화 및 미백용 화장료 조성물이 제공된다. 상기 저백피 및 솔나물 추출물은, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하여 제조되는 것이다.

상기 저백피 및 솔나물 추출물은 바람직하게는 저백피 및 솔나물이 각각 1 ~ 4:1의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이며, 더욱 바람직하게는 저백피 및 솔나물이 각각 4:1의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다.

상기 저백피 및 솔나물 추출물은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량% 포함되는 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 저백피 및 솔나물 복합추출물은 콜라겐 생성 및 TIMP-1의 발현, 트로포엘라스틴의 발현, MMP-1의 발현 억제, 티로시나제(Tyrosinase) 및 MITF의 유전자 발현 억제 효과가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항노화 및 미백용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 저백피 및 솔나물 추출물의 Collagen mRNA 유전자 발현에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 저백피 및 솔나물 추출물의 TIMP-1 mRNA 유전자 발현에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 저백피 및 솔나물 추출물의 Tropoelastin mRNA 유전자 발현에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 저백피 및 솔나물 추출물의 MMP-1 mRNA 유전자 발현억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 저백피 및 솔나물 추출물의 MITF mRNA 유전자 발현억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 저백피 및 솔나물 추출물의 Tyrosinase mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 저백피 및 솔나물 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 및 미백용 화장료에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 추출물의 원료인 저백피(Ailanthi Radicis Cortex)는 소태나무과(Simarubaceae)의 가죽나무(Ailanthus altissima Swingle)의 소지(小枝), 수피 또는 근피(根皮)를 건조한 것으로 저근백피라고도 한다. 중국의 낙엽교목의 하나인 가죽나무의 근피를 “저근피”, 수피를 “춘백피”라고 한다. 가죽나무는 중국이 원산지이며 한국, 일본, 사할린, 몽골, 유럽 등지에 주로 분포한다. 한방 및 민간요법에서는 이질, 치질, 혈변, 위궤양 등에 사용된다. 저백피의 성상은 고르지 않은 모양으로 관상-반관상이며, 길이 3-10㎝, 너비 1-5㎝, 두께 2-5㎜이다. 바깥 면은 회백색-엷은 갈색으로 엉성하며, 때로는 코르크층이 떨어져서 황백색을 나타내기도 한다. 안쪽은 엷은 황색-엷은 갈색으로 매끄럽고 점 모양의 혹, 또는 작은 혹이 많이 배열되어 있으며, 때로는 파열되어서 작은 구멍을 이룬 것도 있다. 질(質)은 단단하면서도 연하며, 꺾은 면은 매끈하지 않으며 섬유상이다. 꺾을 때에 강한 냄새가 있으며, 맛은 매우 쓰다. 저백피의 화학적 구성성분은 스코폴레틴, 카볼린류, 시토스테롤, 글루코사이드류 등이 있으며, isoquercitrin, canthin-6-one, canthin-6-and-3-oxide, quassin 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

솔나물(Galium verum var. asiaticum)은 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하며 우리나라 전국에 넓게 분포하고 있다. 높이 50-80cm까지 자라며 잎은 선형으로 6-10개가 둘러나고 꽃은 6-8월에 노란 색으로 줄기 끝에 조밀하게 원추화서를 이룬다 어린 잎은 식용한다. 전초를 봉자채라 하며 약용한다. 약효로는 청열, 해독, 행혈, 지양의 효능이 있다. 솔나물의 화학적 구성성분은 (+)-pinoresinol 4,4'-O-bis-beta-D-glucopyranoside, epipinoresinol, (+)-medioresinol, isorhamnetin, diosmetin, quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside, ursolic acid, ursolic aldehyde and rubifolic acid 의 compounds가 확인되었다(Zhao et al., 2009).

본 발명에서 사용되는 저백피 및 솔나물은 오프라인 또는 인터넷 마켓에서 구입할 수 있다.

본 발명에서 저백피 및 솔나물은 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나 가루로 만들어 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 물, 에탄올 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합)중에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출하여 제조하는 것이 유효성분 추출에 가장 바람직하다.

본 발명의 저백피 및 솔나물 추출물은 통상의 기술자에게 알려진 공지된 추출법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 본 발명에서의 저백피 및 솔나물 건조물을 세절하고, 그 건조 중량의 1~80배 부피량의 물, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜에서 선택된 추출용매를 부가하여 95℃에서 3시간 중탕시켜 유효성분을 추출한 후, 추출용매를 감압농축기로 농축하여 수득된다.

본 발명의 저백피 및 솔나물 추출물은 추출 용매로 추출한 추출액을 감압 농축한 농축액, 농축액을 동결 건조한 분말 또는 농축액을 분무 건조하여 건조한 분말일 수 있다.

상기 화장료조성물의 유효성분으로서의 저백피 및 솔나물 추출물은 저백피 및 솔나물이 각각 1 ~ 4:1의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다. 더욱 바람직하게는 저백피 및 솔나물이 각각 4:1의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다. 상기 범위로 혼합되어 추출되는 경우에 항노화활성 및 미백활성이 특히 우수하게 나타났다. 상기 저백피 및 솔나물 추출물은 저백피, 솔나물 각각의 추출물을 제조한 후, 상기 비율로 혼합된 것일 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서 저백피 및 솔나물 추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.001 ~ 10 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01∼5 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 저백피 및 솔나물 추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 저백피 및 솔나물 추출물 이외에 주름개선에 대한 피부노화 방지 및 멜라닌생성 억제를 통해 미백 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

실시예 1: 추출물의 제조

분쇄화된 저백피 12.5g에 혼합용매로서 정제수 689g, 프로필렌글라이콜 300g을 사용하여 95℃에서 3시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 2 내지 37: 추출물의 제조

하기 표 1과 같이 원료 및 추출 용매를 달리하여 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다. 상기 실시예 1의 혼합용매에 있어서, 프로필렌글라이콜 대신에 하기 표 1의 용매를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하였다.

구분	원료	추출 용매
실시예 2	저백피	에틸아세테이트
실시예 3	저백피	아세톤
실시예 4	저백피	글리세린
실시예 5	저백피	에틸렌글리콜
실시예 6	저백피	프로필렌글리콜
실시예 7	저백피	부틸렌글리콜
실시예 8	솔나물	에틸아세테이트
실시예 9	솔나물	아세톤
실시예 10	솔나물	글리세린
실시예 11	솔나물	에틸렌글리콜
실시예 12	솔나물	프로필렌글리콜
실시예 13	솔나물	부틸렌글리콜
실시예 14	저백피, 솔나물 혼합(1:1)	에틸아세테이트
실시예 15	저백피, 솔나물 혼합(1:1)	아세톤
실시예 16	저백피, 솔나물 혼합(1:1)	글리세린
실시예 17	저백피, 솔나물 혼합(1:1)	에틸렌글리콜
실시예 18	저백피, 솔나물 혼합(1:1)	프로필렌글리콜
실시예 19	저백피, 솔나물 혼합(1:1)	부틸렌글리콜
실시예 20	저백피, 솔나물 혼합(2:1)	에틸아세테이트
실시예 21	저백피, 솔나물 혼합(2:1)	아세톤
실시예 22	저백피, 솔나물 혼합(2:1)	글리세린
실시예 23	저백피, 솔나물 혼합(2:1)	에틸렌글리콜
실시예 24	저백피, 솔나물 혼합(2:1)	프로필렌글리콜
실시예 25	저백피, 솔나물 혼합(2:1)	부틸렌글리콜
실시예 26	저백피, 솔나물 혼합(3:1)	에틸아세테이트
실시예 27	저백피, 솔나물 혼합(3:1)	아세톤
실시예 28	저백피, 솔나물 혼합(3:1)	글리세린
실시예 29	저백피, 솔나물 혼합(3:1)	에틸렌글리콜
실시예 30	저백피, 솔나물 혼합(3:1)	프로필렌글리콜
실시예 31	저백피, 솔나물 혼합(3:1)	부틸렌글리콜
실시예 32	저백피, 솔나물 혼합(4:1)	에틸아세테이트
실시예 33	저백피, 솔나물 혼합(4:1)	아세톤
실시예 34	저백피, 솔나물 혼합(4:1)	글리세린
실시예 35	저백피, 솔나물 혼합(4:1)	에틸렌글리콜
실시예 36	저백피, 솔나물 혼합(4:1)	프로필렌글리콜
실시예 37	저백피, 솔나물 혼합(4:1)	부틸렌글리콜

저백피 및 솔나물 추출물을 가지고 항노화 및 미백 효과를 확인 하고자 추출물을 농축 후 동결 건조하여 세포 내 효능평가 샘플을 농도별로 준비하였다. 그리고 in vitro에서 콜라게나제(Collagenase), Timp-1, 트로포엘라스틴(Tropoelastin)의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과를 확인했으며, 추가적으로 미백 효과를 확인 하고자 in vitro에서 티로시나제(Tyrosinase) 및 MITF의 유전자 발현 억제 효과를 확인 하였다.

시험예 1 : 세포독성 시험

세포 배양

저백피 및 솔나물 추출물의 항노화에 작용하는 유전자 발현을 확인하기 위하여 콜라게나제(Collagenase)와 Timp-1는 HaCaT(Human keratinocyte cell line)에서, MMP-1와 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 CCD-986Sk(Human fibroblast cell line)에서, 미백에 작용하는 유전자 발현을 확인하기 위하여 티로시나제(Tyrosinase)와 MITF는 B16F10 melanoma cells을 사용하였다. HaCaT, CCD-986Sk 및 B16F10 melanoma 세포는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA), 100U/mL의 streptomycin, 100U/mL의 penicillin 항생제(Gibco, USA)가 포함된 DMEM(Dulbeco? modified eagle? medium, Gibco, USA)배지를 사용하여 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 HaCaT, CCD-986Sk 및 B16F10 melanoma 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO_2, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20 ㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.

세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

구분	세포 생존율(%)
	0.1 %	0.5 %	1.0 %	5.0 %
실시예 1	100	100	100	101
실시예 2	100	100	101	100
실시예 3	101	100	100	101
실시예 4	100	100	101	101
실시예 5	100	100	101	100
실시예 6	100	100	100	101
실시예 7	101	100	101	100
실시예 8	101	101	101	100
실시예 9	101	100	100	101
실시예 10	100	101	100	100
실시예 11	100	100	101	100
실시예 12	101	100	101	101
실시예 13	100	101	100	100
실시예 14	101	101	100	100
실시예 15	101	100	100	100
실시예 16	101	101	100	100
실시예 17	100	100	101	100
실시예 18	101	100	101	101
실시예 19	100	100	100	101
실시예 20	101	101	101	101
실시예 21	100	100	100	100
실시예 22	100	101	101	101
실시예 23	100	100	101	100
실시예 24	101	101	101	100
실시예 25	100	101	100	101
실시예 26	101	100	101	100
실시예 27	100	101	100	100
실시예 28	101	100	101	101
실시예 29	101	101	100	100
실시예 30	100	101	100	101
실시예 31	101	100	101	100
실시예 32	100	101	100	100
실시예 33	100	100	101	101
실시예 34	101	100	101	101
실시예 35	101	101	101	101
실시예 36	101	100	100	101
실시예 37	100	100	100	101
대조군 Adenosine	100	100	100	101
대조군 Arbutin	100	101	100	101

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 실시예 1 내지 37 그리고 대조군 아데노신(Adenosine)과 알부틴(Arbutin) 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

시험예 2 : 세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과.

HaCaT와 CCD-986Sk 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존률 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

저백피 및 솔나물 complex로는 항노화 및 미백활성이 가장 우수한 것으로 확인된 저백피와 솔나물의 4:1 혼합추출물인 실시예 36의 추출물을, 저백피 추출물로는 실시예 6, 솔나물 추출물로는 실시예 12의 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 COL1A1, TIMP-1 및 Tropoelastin의 발현과 MMP-1의 발현 억제를 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 3에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30 ~ 40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
COL1A1	Forward : AGCCAGCAGATCGAGAACAT
	Reverse : TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG
TIMP-1	Forward : TGCTGGGTGGTAACTCTTTATTTCA
	Reverse : ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG
Tropoelastin	Forward : AAAGCAGCAGCAAAGTTCGG
	Reverse : ACCTGGGACAACTGGAATCC
MMP-1	Forward : AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT
	Reverse : CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA

그 결과는 각각 도 1 내지 4에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 본 발명 실시예 36의 저백피 및 솔나물 Complex는 저백피, 솔나물 단독 추출물 보다 collagen 및 TIMP-1의 발현이 증가하였고, MMP-1의 발현은 농도 의존적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 대조군인 아데노신(Adenosine)과 비교했을 때 우수하거나 비슷한 결과를 확인할 수 있었다. 또한 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 피부 탄력을 나타내는 탄력 섬유 중심의 엘라스틴을 형성하고 있는 인자로 추출물은 5%에서 대조군 Adenosine 5%와 비슷한 결과를 확인할 수 있었다.

시험예 3 : 세포 내 Tyrosinase 및 MITF의 유전자 발현 억제 효과

B16F10 melanoma 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존율 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

저백피 및 솔나물 complex로는 항노화 및 미백활성이 가장 우수한 것으로 확인된 저백피와 솔나물의 4:1 혼합추출물인 실시예 36의 추출물을, 저백피 추출물로는 실시예 6, 솔나물 추출물로는 실시예 12의 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Tyrosinase 및 MITF를 선택하여 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용 하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 4에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성후, Moloney murine leukemia virus(M-MLV) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25μL로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5 mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
MITF	Forward : AACCGACAGAAGAAGCTGGA
	Reverse : ACAAGTTCCTGGCTGCAGTT
Tyrosinase	Forward : TTATGCGATGGAACACCTGA
	Reverse : ACTGGCAAATCCTTCCAGTG

그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰 결과, 본 발명 실시예 36의 저백피 및 솔나물 Complex는 저백피, 솔나물 단독 추출물 보다 Tyrosinase 및 MITF의 mRNA 유전자 발현 억제 효과가 우수하게 나타났다. 이와 같이, 본 발명에 따른 저백피 및 솔나물 복합추출물은 항노화 및 미백활성을 나타낸다.

제형 실시예 1 : 스킨로션의 제조

하기 표 5의 조성에 따라, 하기의 방법으로 저백피 및 솔나물 혼합추출물 (실시예 36)을 함유한 스킨로션을 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	저백피 및 솔나물 혼합추출물 (실시예 36)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	미량

상기 표 5에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제형 실시예 2 : 영양로션의 제조

하기 표 6의 조성에 따라, 하기의 방법으로 저백피 및 솔나물 혼합추출물 (실시예 36)을 함유한 하이드로좀 영양로션을 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	저백피 및 솔나물 혼합추출물 (실시예 36)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 6에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서, 80~85 ℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80~85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

Claims (5)

1. 저백피 및 솔나물이 각각 4:1의 중량비로 혼합되어 추출되는 저백피 및 솔나물 추출물을 함유하는 항노화 및 미백용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 저백피 및 솔나물 추출물은, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하여 제조되는 것임을 특징으로 하는 항노화 및 미백용 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 저백피 및 솔나물 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량% 포함되는 것임을 특징으로 하는 항노화 및 미백용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 항노화 및 미백용 화장료 조성물.

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