KR102348419B1

KR102348419B1 - 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102348419B1
Application number: KR1020210082824A
Authority: KR
Inventors: 이희철; 정유미; 김준형; 김미지
Original assignee: 주식회사 참존
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-01-10

Abstract

본 발명은 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 사과, 딸기 및 엘더베리를 알칼리 이온수로 저온 침출한 후 발효시켜 제조되는 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 주름개선, 미백, 피부 장벽강화 및 보습 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing ferment complex extracts of Pyrus Malu, Fragaria Ananassa and Sambucus Nigra}

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며, 이에 따라 피부 미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다. 표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부 표면은 피지선에서 분비되는 땀샘에서 나오는 수분이 자연적으로 잘 혼합된 피지막이 각질층을 덮고 있어서, 매끄럽고 윤기 있으며 촉촉한 상태로 유지된다. 그러나 신진 대사 작용의 이상으로 인해 피부 각질층의 수분함량이 떨어지게 되면 피부에서 각질이 떨어져 나가게 되고 이 물질의 침투가 용이하게 되어 각종 염증 및 알레르기가 유발되기 쉬워진다. 특히 노화가 진행됨에 따라 피부의 신진대사가 원활하지 못하므로 피부에 대한 각종 염증 및 알레르기는 가중되게 된다. 또한 건조한 실내 환경, 공해, 자외선, 오용된 화장품이나 세제류 등에 의한 피부 자극에 의해 피부가 민감해져 가는 사람들이 증가하고 있다. 외부자극에 의해 민감해진 피부는 홍반과 같이 가벼운 증상에 그치는 경우도 있지만, 가려움, 따가움 등과 같이 몹시 심하고 불쾌한 염증 반응을 나타내는 경우도 있다. 이러한 인자들에 의하여 피부 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠어지면서 갈라지게 된다. 수분 손실이 되면 각질이 탈락되면서 외부에 노출되기 용이하게 되면서 자극에 대한 염증 및 피부질환이 유발된다. 건조한 피부는 면역기능이 약화되어 가려움증 및 아토피 피부염 등의 알러지가 유발되기 쉬워진다. 그러므로 피부의 수분 손실을 방지하는 것은 중요하다.

최근 노화의 원인으로 밝혀진 활성산소종은 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화현상을 촉진한다. 그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며, MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다. MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-macroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(alpha hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

희고 고운 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람의 한결같은 소망이다. 일반적으로 사람의 피부 모발 및 눈 등의 색은 멜라닌 카로틴 및 헤모글로빈 등에 의해 결정된다. 사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트 (melanocyte)의 활동성 혈관의 분포 피부의 두께 및 카로티노이드 및 빌리루빈 등인 체내외의 색소 함유 유무와 같은 여러 요인들에 의해 결정되며 그 중 멜라노 사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색색소가 가장 중요하다. 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인 호르몬 분비 및 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인이 영향을 미친다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있지만 멜라닌이 과잉 생산됨으로써 기미 또는 주근깨 등을 형성할 뿐 아니라 피부 노화를 촉진하며 피부암 유발에도 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

멜라닌의 주요한 기능은 이러한 유해라디칼을 제거하여 이에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 것이다. 따라서 멜라닌의 양이 많다는 것은 물리적 또는 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호할 수 있는 효과적인 대응 체계를 가지고 있다는 것을 의미한다. 이러한 멜라닌의 생성을 촉진하는 요인으로는 햇빛 자외선 뿐만 아니라 에스트로겐 또는 프로스타글란딘 등이 있다.

멜라닌의 생합성은 표피 기저층에 존재하는 멜라노싸이트 (melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)에서 타이로시네이즈(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1), DCT(dopachrome tautomerase) 등 특이적인 효소의 연속적 산화 반응에 의해서 일어 나는데 그 중 멜라닌 합성의 주요 효소인 타이로시네이즈 활성 저해 실험이 멜라닌 중합체 억제제 개발의 초기 단계에서 채택되고 있다. 그러나 타이로시네이즈에 의한 산화 반응 이외에 피부 속 멜라닌의 생성 경로에 영향을 미치는 인자 중에는 중 Advanced glycation end products(AGEs) 반응 혹은 non-enzymatic glycation 반응이 있다. 당화 반응(glycation)은 당과 단백질의 비효소적인 반응으로 환원당의 카르보닐기(carbonyl)와 단백질의 유리 아미노기인 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)과 반응하여 초기 당화 생성물인 시프 염기(schiff base)를 형성하고 이렇게 형성된 화합물들이 계속적으로 재배열 교차 결합 등의 일련 반응을 통하여 갈색의 화합물(Browning)인 비가역적 최종당화산물(Advanced glycation end products, AGEs)을 생성하는 반응이다.

이는 단백질의 유리 아미노기인 lysine이나 arginine과 환원당의 carbonyl기가 반응하여 초기 glycation 생성물인 shiff base를 형성하고 이때 형성된 화합물들이 계속적으로 축합, 재전위, 산화, 분열, 고리화 등의 일련의 복잡한 반응을 통하여 황갈색의 화합물(melanoidine)을 만드는 반응이다. 이러한 AGEs의 생성 및 축적과정이 진행되면 피부에는 멜라닌 색소의 생성과 축적이 일어난다. 이러한 멜라닌의 생성은 기저층의 멜라닌세포(melanocyte)내 멜라닌소체(melanosome)라는 소기관에서 합성된다. AGEs가 생성될 때 수용체인 receptor for AGE(RAGE)가 receptor site에 작용한다. AGE는 RAGE와 결합한 후에 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자인 Microphthalmia-associated transcription factor(MITF)을 촉진하여, 멜라닌 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 효소 티로시나제(tyrosinase)의 발현을 촉진한다. 최종적으로 멜라닌이 합성된다. 합성된 멜라닌색소는 멜라닌세포의 수지상돌기(dendrite)를 통하여 인접세포인 각질세포(keratinocyte)로 전달되며, 전달된 멜라닌색소는 각질세포를 통하여 피부 내 여러 부위에 분포하게 된다.

기미 주근깨 또는 색소 침착 등과 같은 피부 색소 이상 침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜 주기 위해서 이전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체 타이로시나제 저해 활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합 사용하여 왔는데, 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 제형 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용하는 제품이지만 다양한 기능성 물질들을 포함하며 유효한 효과뿐만 아니라 피부 자극의 원인이 되기도 한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 최근 화학 물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 개발되고 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 여러 소재로부터 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보호능을 평가 확인하고, 이에 따라 피부자극을 유발하지 않으면서 우수한 피부개선활성을 나타내는 새로운 화장료 조성물을 개발하고자 하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-0983326호(2010.09.14) (0002) 대한민국 공개특허 제10-2013-0085012호(2013.07.26)

본 발명은 알칼리 이온수로 저온 침출한 후 발효시켜 제조되는 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 주름개선, 미백, 피부 장벽강화 및 보습 활성을 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 알칼리 이온수로 저온 침출한 후 발효시켜 제조되는 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합물을 알칼리 이온수로 3~5℃의 저온에서 침출한 후, 백국균(Aspergillus kawachii)으로 발효시켜 제조되는 것임을 특징으로 한다.

상기 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합물은 사과, 딸기 및 엘더베리가 각각 1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합되어 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량%, 더욱 바람직하게는 1∼5 중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용, 미백용, 피부 장벽강화용 또는 보습용으로 사용된다.

알칼리 이온수로 저온 침출한 후, 백국균으로 발효하여 제조되는 본 발명의 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 그 상승작용에 의하여 우수한 주름개선, 미백, 피부 장벽강화 및 보습 효과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

알칼리 이온수(alkaline ionized water)는 통상 pH 8.5 이상의 알카리 상태의 물을 의미하며, 물의 전기분해 방식 또는 필터방식으로 생성된다. 전기분해 방식은 물을 전기분해하여 (-)극에 알카리수, (+)극에 산성수를 생성한 후 알카리수만을 회수하여 제조하는 것이며, 필터방식은 물을 수소보다 이온화 경향이 큰 마그네슘, 칼슘과 같은 알칼리토금속 세라믹이 충진된 필터를 통과시켜 생성하는 것이다. 본 발명에서는 사과, 딸기 및 엘더베리의 저온 추출 용매로써 알칼리 이온수를 사용한다. 알칼리 이온수는 pH 8.5 ~ 9.8, 산화환원전위(ORP, Oxidation Reduction Potential) -450 ~ -700mV인 것을 사용하는 경우에 환원력이 우수하여 사과, 딸기 및 엘더베리 유효성분 추출에 유리하므로 더욱 바람직하다.

사과는 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 낙엽교목의 식물인 사과나무(Pyrus Malus)의 열매로서 8월~9월에 열매가 성숙되며 이과는 편구형이고 지름은 3~10cm이며 양끝이 오목하게 들어가고 과피는 황색 바탕에 붉은빛이 돈다. 사과 주성분은 당분이며 대부분 과당과 포도당으로 흡수가 잘 된다. 유기산중에 사과산이 90%이상 존재하고 구연산, 주석산, 펙틴, 아미노산 등을 포함한다.

딸기(Fragaria Ananassa)는 장미과에 속하는 다년생 식물 또는 그 열매이다. 딸기 열매에는 폴리페놀 화합물 중 플로레틴(phloretin), 플라보노이드(flavonid)류로 퀘르세틴-7-자일로사이드(quercetin-7-xyloside), 프라가린(fragarin), 프로시아니딘 B3(procyanidin B3), 1-O-p-쿠마로일글루코스(1-O-p-coumaroylglucose), 2-헵탄올(2-heptanol), 엘라직산(ellagic acid) 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

엘더(Sambucus nigra L.)는 서양딱총나무라고도 한다. 높이 7m까지 자란다. 유럽, 아시아, 북아프리카에 자생하는 허브의 한 종류이다. 줄기와 오래 된 가지의 껍질은 회갈색으로 금이 나 있고 새로 난 가지의 껍질은 갈색으로 회색 점이 많이 있다. 가지 속에 들어 있는 속(髓)은 흰색으로 연하다. 잎은 마주나며 타원형으로 끝이 뾰족하고 불규칙하게 톱니가 나 있다. 연한 녹색의 작은 잎으로 이루어지며 드문드문 털이 나 있다. 턱잎은 실처럼 생겼으며 일찍 떨어진다. 6∼7월에 가지 끝에서 크림색 꽃이 촘촘히 모여 우산 모양을 이루며 산방꽃차례로 달린다. 열매인 엘더베리는 검은색으로 즙이 많고 씨앗은 갈색의 타원형이다. 뿌리에서부터 열매까지 전체적으로 약용한다.

본 발명은 사과, 딸기 및 엘더베리를 알칼리 이온수로 저온 침출한 후, 백국균으로 발효시켜 제조되는 혼합발효추출물이 피부 개선활성을 증대시켜 우수한 피부 주름개선, 미백, 피부장벽강화 및 보습효과를 나타낸다는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 알칼리 이온수로 저온 침출한 후 발효시켜 제조되는 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합발효추출물은 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합물을 알칼리 이온수로 3~5℃의 저온에서 침출한 후, 백국균(Aspergillus kawachii)으로 발효시켜 제조되는 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 다음과 같이 제조된다.

건조 후 분쇄된 사과, 딸기 및 엘더베리를 각각 1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합한 후, 알칼리 이온수를 가하여 3~5℃의 저온에서 24~48시간 침출한다. 여과한 후 그 여액을 농축하고 동결 건조하여 알칼리 이온수 침출 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합추출물을 제조한다.

이때, 사과, 딸기 및 엘더베리를 각각 1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합하며, 더욱 바람직하게는 각각 1~2:1:1~3의 중량비로 혼합하여 추출한다.

상기 제조된 혼합추출물을 멸균한 후, 발효균주로서 백국균(Aspergillus kawachii)을 접종하고 20 ~ 25℃에서 3-5일 발효시킨다. 발효 완료 후 여과하고 그 여액을 동결건조하여 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 제조한다.

상기 멸균 방법으로는 크게 열, 자외선, 방사선 또는 고주파 등을 이용하는 물리적 방법과 약액 또는 가스를 이용하는 화학적 방법이 있으며, 사과, 딸기 및 엘더베리의 유효성분을 최대한으로 손상시키지 않으면서 멸균하는 방법이 선택될 수 있다.

발효란, 미생물이 가지고 있는 효소를 이용하여, 복잡한 유기화합물이 분해되어 간단한 유기물로 되는 일련의 과정을 말한다. 이때, 발효균주로서 백국균(Aspergillus kawachii)을 사용하는 경우에 유산균, 효모균 또는 다른 aspergillus 균들을 사용하는 경우에 비하여 더 우수한 피부개선활성을 나타내므로 더욱 바람직하다.

이와 같이 알칼리 이온수로 침출한 후, 백국균으로 발효시켜 제조되는 본 발명의 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 우수한 엘라스테이즈 활성 저해 효과(시험예 2), 콜라겐 생합성 촉진효과(시험예 3), MMP-1 생성 억제효과(시험예 4), 티로시네이즈 발현 억제 효과(시험예 5), 멜라닌 생성 저해 효과(시험예 6, 7), 피부장벽강화효과(시험예 8), 피부재생효과(시험예 9), 보습효과(시험예 10)를 나타내었다. 이때, 사과, 딸기 및 엘더베리를 각각 2:1:3의 중량비로 혼합하여 제조된 혼합발효추출물에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

유효성분으로서의 상기 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.001~10 중량%의 양으로 함유되며, 더욱 바람직하게는 1∼5 중량%의 양으로 함유될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제조예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 제조예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

제조예 1 ~ 3: 사과, 딸기 및 엘더베리 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 사과, 딸기 및 엘더베리 각 100g에 추출용매로서 정제수를 5배 중량으로 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

제조예 4 ~ 6: 알칼리 이온수 저온 침출 사과, 딸기 및 엘더베리 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 사과, 딸기 및 엘더베리 각 100g에 추출용매로서 10배 중량의 알칼리 이온수(미네랄알칼리에이수, 한국알칼리수(주))를 사용하여 3~5℃에서 각각 24시간 저온 침출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter): 30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

제조예 7 ~ 9: 알칼리 이온수 저온 침출 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합추출물의 제조

건조 후 분쇄된 사과, 딸기 및 엘더베리를 하기 표 1의 중량비로 혼합(100g)한 후, 추출용매로서 알칼리 이온수 10배 중량을 넣고 3~5℃에서 24시간 침출하였다. 위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter): 30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

중량비	사과	딸기	엘더베리
제조예 7	1	1	1
제조예 8	2	1	2
제조예 9	2	1	3

실시예 1 ~ 3: 알칼리 이온수 저온 침출 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물의 제조

상기 제조예 7 ~ 9에서 제조한 알칼리 이온수 저온 침출 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합추출물을 멸균하였다. 상기 멸균 단계를 거친 알칼리 이온수 저온 침출 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합 추출물에 발효균주로서 백국균을 접종하여 20 ~ 25℃에서 5일간 발효시켜 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 제조하였다.

비교예 1 ~ 3: 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물의 제조

건조 후 분쇄된 사과, 딸기 및 엘더베리를 하기 표 2의 중량비로 혼합(100g)한 후, 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

제조된 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합추출물을 멸균하였다. 상기 멸균 단계를 거친 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합 추출물에 발효 균주로서 백국균을 접종하여 20 ~ 25℃에서 5일간 발효시켜 혼합발효추출물을 제조하였다.

중량비	사과	딸기	엘더베리
비교예 1	1	1	1
비교예 2	2	1	2
비교예 3	2	1	3

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포 농도로 접종하여, 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예, 실시예 및 비교예에서 제조한 추출물을 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl] - 2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후(3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

세포 생존율(%)	시료사용농도(%)
세포 생존율(%)	0	0.1	0.5	1.0
제조예 1	100	100	100	100
제조예 2	100	100	100	100
제조예 3	100	100	100	100
제조예 4	100	100	100	100
제조예 5	100	100	100	100
제조예 6	100	100	100	100
제조예 7	100	100	100	100
제조예 8	100	100	100	100
제조예 9	100	100	100	100
실시예 1	100	100	100	100
실시예 2	100	100	100	100
실시예 3	100	100	100	100
비교예 1	100	100	100	100
비교예 2	100	100	100	100
비교예 3	100	100	100	100

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이 적용한 시료 모두 1%농도에서 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 엘라스타제 활성 저해 시험

엘라스타제 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 구매하여 사용하였다. Buffer 용액에 각 시료를 희석하여 농도별로 녹인다. 실험은 투명한 96-웰 플레이트에서 진행하였으며, 각 웰의 최종 볼륨은 200㎕으로 하였다. Tris buffer 60㎕, 각 시료 100㎕, 기질(N-Succinyl-Ala3-NA) 20㎕를 96 well에 넣는다. 효소(Elastase)를 20㎕씩 각 well에 넣는다. 25℃에서 15분간 반응 시킨 뒤 410nm에서 흡광도를 측정하여 엘라스타제 활성 저해 효과를 측정하였다.

상기 제조예, 실시예 및 비교예의 추출물의 농도가 0.1, 0.5, 1.0% 되는 용액을 시료로 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 adenosine을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다. 저해효과는 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

엘라스타제 활성 저해율(%) = (1-B/A) × 100(%)

A: 대조군에서의 엘라스타제 흡광도

B: 실험군의 엘라스타제 흡광도

저해율(%)	시료사용농도(%)
저해율(%)	0.1	0.5	1.0
제조예 1	12.3	18.5	22.5
제조예 2	11.2	17.4	23.5
제조예 3	13.4	16.5	21.4
제조예 4	13.7	18.3	23.4
제조예 5	14.1	21.2	25.4
제조예 6	15.6	20.4	26.1
제조예 7	16.2	26.3	30.5
제조예 8	17.4	27.5	32.5
제조예 9	16.5	29.5	33.5
실시예 1	49.6	59.8	65.3
실시예 2	51.2	63.2	68.8
실시예 3	53.1	65.6	72.3
비교예 1	33.2	42.5	51.2
비교예 2	29.5	30.2	48.6
비교예 3	26.8	33.5	46.8
Adenosine (0.04%)	74.2

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 알칼리 이온수 저온 침출 후 백국균으로 발효하여 제조된 실시예 1~3의 시료에서 제조예 및 비교예의 시료에 비하여 더욱 우수한 엘라스타제 활성 저해효과를 나타내었다.

시험예 3: 콜라겐 생합성 촉진효과시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 제조예, 실시예 및 비교예의 추출물을 농도가 0.1, 0.5, 1.0% 가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래식에 따라 계산하였으며 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A × 100

A: 대조군에서의 procollagen 발현 량

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 량

상기 시험결과 하기의 표 5와 같은 결과를 얻었다.

발현율(%)	시료사용농도(%)
발현율(%)	0.1	0.5	1.0
실시예 1	29.55	48.27	67.89
제조예 1	25.3	46.5	55.6
제조예 2	28.9	50.2	68.8
제조예 3	33.5	51.2	70.2
제조예 4	36.8	49.5	72.5
제조예 5	37.5	53.2	75.6
제조예 6	34.2	59.6	80.2
실시예 1	56.54	80.2	110.6
실시예 2	60.2	85.6	120.8
실시예 3	99.5	120.3	170.5
비교예 1	49.6	64.5	74.5
비교예 2	52.3	65.2	71.5
비교예 3	51.4	59.6	69.5
Adenosine (0.04%)	185.25

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 사과, 딸기 및 엘더베리를 단독으로 적용한 경우보다 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합추출물의 시료에서 콜라겐 생합성 촉진 효과가 높았으며, 알칼리 이온수 저온 침출 후 백국균으로 발효하여 제조된 실시예의 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물의 경우 보다 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

시험예 4: MMP-1 생성 억제 효과

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 0.1, 0.5, 1.0% 가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다.

MMP-1 생성억제율(%)=(1-실험군의 MMP-1의 양/대조군의 MMP-1의 양)×100

생성억제율(%)	시료사용농도(%)
생성억제율(%)	0.1	0.5	1.0
제조예 1	13.5	21.2	34.5
제조예 2	13.5	19.2	32.5
제조예 3	15.2	22.5	33.2
제조예 4	15.8	21.3	40.3
제조예 5	16.9	26.5	41.2
제조예 6	17.5	21.2	44.5
제조예 7	19.2	28.9	49.5
제조예 8	20.1	31.2	51.2
제조예 9	21.5	33.2	53.2
실시예 1	33.5	56.2	65.2
실시예 2	40.2	51.2	71.2
실시예 3	45.6	73.2	89.1
비교예 1	29.5	30.5	46.5
비교예 2	28.6	29.8	49.8
비교예 3	24.5	35.6	52.3
TGF-β	95.6

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 실시예 1~3의 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물에서 우수한 억제효과를 나타내었으며, 실시예 3은 대조군 TGF-β와 유사한 정도의 MMP-1 생성억제 효과를 나타내었다.

시험예 6: 티로시네이즈 발현 감소 확인

세포를 24-well plates에 1×10⁵ cells/mL로 분주 한 뒤 24 시간 동안 배양 하였다. 24 시간 후 FBS와 항생제가 첨가 되지 않은 배지에 시료를 농도별로 제조하여 세포에 처리 하였고 24 시간 동안 더 배양하였다. 시료 처리 배지를 제거한 뒤 pH 6.8의 phosphate-buffersaline(PBS)으로 세척하였고, 1% Triton X-100가 함유 된 PBS를 wells에 첨가한 뒤 cell scraper로 wells에 붙어 있는 세포를 떼어내어 1.5 mL 튜브에 모아 -70℃에 급속 냉동 시킨 후 해동 시켰으며 이와 같은 방법을 3번 반복하여 세포 막을 파괴하였다. 원심 분리 한 후 상층액을 tyrosinase 활성 측정을 위한 효소원과 단백질 측정을 위한 시료로 사용하였다. Bio-Rad protein kit로 단백질 정량을 하였으며, tyrosinase 활성측정은10 mM L-dopa 200㎕와 0.1 M PBS(pH 6.8) 500㎕, tyrosinase 효소원(세포로부터 얻은 상층액) 300 ㎕를 첨가한 후 35℃에서 1시간 incubation 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

티로시네이즈 발현 저해율(%) = (A-B)/A × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 흡광도

B : 시료를 첨가한 웰의 흡광도

티로시네이즈 발현 저해율(%)
시료사용농도(%)	0.1	0.5	1.0
대조군 Arbutin (2%)	80.4
제조예 1	10.2	15.6	28.2
제조예 2	11.3	18.2	47.2
제조예 3	12.3	15.2	48.5
제조예 4	15.6	19.2	49.4
제조예 5	16.8	21.2	50.2
제조예 6	17.2	25.3	55.6
제조예 7	18.6	19.5	56.5
제조예 8	17.6	21.2	55.3
제조예 9	19.2	25.6	28.9
실시예 1	20.3	26.5	69.5
실시예 2	22.5	59.6	71.2
실시예 3	30.5	63.5	79.5
비교예 1	15.6	22.5	49.5
비교예 2	13.5	23.6	46.5
비교예 3	19.8	25.8	51.6

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 상기 실시예의 시료에서 제조예 및 비교예에 비하여 우수한 티로시네이즈 발현 저해 효과가 나타났다.

시험예 6: 멜라닌 합성 감소 확인

B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도에 근거하여 이들의 미백 효과를 판단하였다. 본 실험 예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다 이 세포의 인공 배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가 하였다. 본 실험 예에서 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 6323) 로부터 분양 받아 사용 하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 well plate에 각 well당 2×10⁶ cells/mL 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 0.1%(wt/v) 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 37℃에서 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. 여기서, 시료의 농도를 맞추기 위해 사용된 용매는 PBS를 이용하였다. 72시간 배양 후 세포를 간 배양 수 세포를 trypsin-EDTA 500㎕를 처리하여 떼어 낸 수 세포 수를 측정 한 다음 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan :Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이티드, pH 6.8, 1% Tripton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파괴하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분) 하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH (10% DMSO)를 120㎕를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 리더로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 아래 식에 의하여 계산 하였으며 그 결과는 표 8과 같다

멜라닌 생성 저해율(%) = (A-B)/A × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

멜라닌 생성 저해율(%)
시료사용농도(%)	0.1	0.5	1.0
대조군 Arbutin(2%)	81.2
제조예 1	15.4	20.1	29.1
제조예 2	14.8	21.4	29.7
제조예 3	15.9	20.8	29.4
제조예 4	19.4	24.3	30.4
제조예 5	23.4	27.4	34.5
제조예 6	26.1	32.9	36.7
제조예 7	25.6	31.2	39.8
제조예 8	27.6	33.5	39.5
제조예 9	26.5	34.5	41.2
실시예 1	25.1	31.7	52.3
실시예 2	26.2	34.4	50.6
실시예 3	55.5	68.4	75.7
비교예 1	22.5	35.6	42.3
비교예 2	23.5	36.8	42.5
비교예 3	29.5	37.5	43.5

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이 B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과 특히 실시예 3에서 제조예 및 비교예에 비하여 더 우수한 멜라닌 생성 저해 효과가 있음을 확인하였다.

시험예 7: 미백 관련 유전자 분석

멜라닌 생성세포(B16F1)에서 멜라닌 생성에 관여하는 Tyrosinase(TYR), Melanocyte inducing transcription factor(MITF), Tyrosine relative protein 1(TYRP1) 및 Dopachrome Tautomerase(DCT) 유전자 분석을 진행하였다. B16F10 세포를 24 well plate에 각각 4×10⁵의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 시료를 0.1, 0.5, 1.0% 농도별로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 24시간 동안 처리 한 뒤, α-MSH(100 nM)로 멜라닌 생성을 유도하여 24시간동안 배양을 하고 PBS로 2회 세척 후 세포를 수확하였다.

이후 Trizol reagent를 각 well에 100 μl씩 분주하여 세포를 lysis한 후 chloroform 200 μl를 분주하여 3분간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 13,200 rpm 에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol 200 μl이 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 70% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 500 μl씩 분주하여 13,200 rpm에서 5분간 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하고 실온에서 건조시켰다. DEPC를 20 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 첨가하여 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. 추출한 RNA는 High-Capacity RNA-to-cDNA™ Kit cDNA(Applied Biosystems™)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. 실험은 제조사의 매뉴얼에 따라 진행하였다.

이후 표 9의 primer sequences를 사용하여 Tyrosinase(TYR) 유전자를 증폭한 후 전기 영동하여 발현량을 확인하였다.

TYR	Forward	5'- GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT - 3‘
TYR	Reverse	5'- TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC - 3

TYR 발현율(%)	시료사용농도(%)
TYR 발현율(%)	0.1	0.5	1.0
대조군 Arbutin(2%)	18.2
제조예 1	56.3	52.3	49.6
제조예 2	55.2	53.2	48.2
제조예 3	49.2	45.2	44.2
제조예 4	45.2	46.2	43.2
제조예 5	51.2	49.2	42.2
제조예 6	55.3	44.2	35.2
제조예 7	56.3	49.8	41.3
제조예 8	58.9	47.5	42.3
제조예 9	57.8	46.8	41.2
실시예 1	52.3	48.2	35.2
실시예 2	49.2	45.2	32.5
실시예 3	25.3	20.2	18.8
비교예 1	50.3	45.6	39.5
비교예 2	49.6	44.5	35.6
비교예 3	48.5	41.4	37.5

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 실시예 3의 시료의 경우, 제조예 및 비교예의 시료에 비하여 우수한 Tyrosinase(TYR)의 유전자 발현 감소 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 8: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과 확인

제조예, 실시예 및 비교예의 시료를 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 11에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

발현 증가율은 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과는 표 12에 나타내었다.

TGase-1 발현증가율(%)=(시료 TGase-1 발현양/대조군 TGase-1 발현양)×100

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
TGase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
TGase-1	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

	처리농도(w/v%)	TGase-1 발현 증가율(%)
Control	0.1	100
제조예 1	0.1	30
제조예 2	0.1	35
제조예 3	0.1	32
제조예 4	0.1	30
제조예 5	0.1	39
제조예 6	0.1	40
제조예 7	0.1	50
제조예 8	0.1	55
제조예 9	0.1	60
실시예 1	0.1	90
실시예 2	0.1	100
실시예 3	0.1	110
비교예 1	0.1	55
비교예 2	0.1	61
비교예 3	0.1	58

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 실시예 1 내지 3의 경우, 제조예 및 비교예의 시료에 비하여 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현효과를 나타내었으며, 실시예 3이 다른 실시예들에 비하여 상승작용에 의하여 더욱 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 9: 피부재생 효과

피부 상처 치유 효과를 확인 하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성 세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 cell culture dish에 세포를 배양한다. 6 well plate에 5×10⁵ cells/well의 세포를 분주 후 제조예, 실시예 및 비교예의 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 18시간 배양하였다. 세포 재생율을 아래 식에 의하여 산출하였고 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다. 그 결과는 표 13에 나타내었다

세포재생율(%)= 시료 세포재생율/ 대조군 세포재생율 × 100

시료	처리농도(㎍/㎖)	세포재생율(%)
Dexamethason	500	85
제조예 1	1000	40
제조예 2	1000	22
제조예 3	1000	29
제조예 4	1000	30
제조예 5	1000	33
제조예 6	1000	31
제조예 7	1000	46
제조예 8	1000	40
제조예 9	1000	55
실시예 1	1000	81
실시예 2	1000	86
실시예 3	1000	95
비교예 1	1000	56
비교예 2	1000	61
비교예 3	1000	62

관찰결과, 실시예 1 내지 3의 혼합발효추출물에서 제조예 및 비교예의 추출물에 비하여 우수한 피부 세포재생율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 10: 피부보습 효과

Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과 확인

상기 제조예, 비교예 및 실시예의 시료를 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 HAS-3의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 14에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인하였다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
HAS-3	Forward : ACTGCCTTCAAGGCCCTTGG
HAS-3	Reverse : AATGTTCCAGATGCGGCCAC

HAS-3 발현증가율은 다음 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과는 표 15에 나타내었다.

HAS-3 발현증가율(%) = (시료 HAS-3 발현양/ 대조군 HAS-3 발현양) × 100

	처리농도(w/v%)	HAS-3 증가율(%)
Control	0.1	90
제조예 1	0.1	35
제조예 2	0.1	20
제조예 3	0.1	22
제조예 4	0.1	26
제조예 5	0.1	28
제조예 6	0.1	24
제조예 7	0.1	30
제조예 8	0.1	35
제조예 9	0.1	36
실시예 1	0.1	80
실시예 2	0.1	85
실시예 3	0.1	96
비교예 1	0.1	46
비교예 2	0.1	42
비교예 3	0.1	49

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 실시예 1 내지 3은 제조예 및 비교예에 비하여 높은 HAS-3 증가율을 나타내어 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 함유하는 세럼의 제조

알칼리 이온수 저온 침출 후 배국균으로 발효하여 제조된 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물(실시예 3)을 함유한 세럼을 하기의 표 16의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물(실시예 3)	1.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

실시예 5: 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 함유하는 크림의 제조

알칼리 이온수 저온 침출 후 백구균으로 발효하여 제조된 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물(실시예 3)을 함유한 크림을 하기의 표 17의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물(실시예 3)	1.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

시험예 11: 제형안정도 확인

상기 실시예 4, 5에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인하였다. 결과는 표 18에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(변색, 변취 및 분리)
온도조건	실시예 4	실시예 5
실온(25℃)	0	0
냉장(4℃)	0	0
항온(50℃)	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표에서 나타낸 바와 같이 실시예 4, 5 제형 모두 25℃, 4℃ 및 0℃ 온도 조건하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인 되었다.

Claims

사과, 딸기 및 엘더베리가 각각 1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합되어 이루어지는 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합물을 알칼리 이온수로 3~5℃의 저온에서 침출한 후, 백국균(Aspergillus kawachii)으로 발효시켜 제조되는 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 사과, 딸기 및 엘더베리 혼합발효추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 장벽강화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.