KR102462080B1

KR102462080B1 - 하스카프를 포함하는 천연물 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102462080B1
Application number: KR1020220040388A
Authority: KR
Inventors: 김을수; 장수창; 배순민; 이소라; 이동현; 김다애; 이대우
Original assignee: (주)바이오코스텍; (주)더마랩
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-11-03

Abstract

본 발명은 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀의 혼합추출물을 유산균으로 발효하여 제조되는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보습 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

하스카프를 포함하는 천연물 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic compositions containing fermented extracts of herb mixture}

본 발명은 하스카프를 포함하는 천연물 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀의 혼합추출물을 유산균으로 발효하여 제조되는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보습 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 이와 같은 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부 미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부지질 중에서도 피부장벽기능을 담당하는 주된 지질은 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되면서 생성되는 지질로서, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes) 사이의 공간을 채우고 있어서 세포간의 결합력을 부여하는 역할도 하고 있는데, 이러한 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되어 있고, 이들은 각각 지질층 지질 전체의 약 40~65%, 10% 및 25%를 차지한다. 또한 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재하는 조성을 가진다.

최근 노화의 원인으로 밝혀진 활성산소종은 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화현상을 촉진한다. 그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며, MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다. MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α₂-macroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 여러 소재로부터 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보습을 평가 확인하고 이에 따라 새로운 화장료 조성물을 개발하고자 하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 공개특허 제10-2009-0055956호(2009.06.03) (0002) 대한민국 공개특허 제10-2020-0079140호(2020.07.02) (0003) 대한민국 공개특허 제10-2011-0057954호(2011.06.01)

본 발명은 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 함유하여 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보습 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합발효추출물은 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀이 각각 1~2:1~3:1~2:1~3의 중량비로, 더욱 바람직하게는 1~2:2~3:1~2:1의 중량비로 혼합되어 추출된 것이다.

상기 혼합발효추출물은 유산균 발효추출물인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 유산균은 락토바실러스 속 유산균(Lactobacillus sp.)이며, 더욱 바람직하게는 상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 사케이(Latilactobacillus sakei) 이다.

상기 혼합발효추출물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 피부 피부장벽강화용, 피부재생용 및 피부보습용인 것을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,

(A) 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀을 각각 1~2:1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;

(B) 상기 혼합물을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계;

(C) 상기 추출물에 유산균을 접종하여 25~35℃에서 48~72시간 동안 발효시키는 단계; 및

(D) 여과 후 농축하는 단계를 포함하는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물의 제조방법이 제공된다.

바람직하게는 상기 (C) 단계는 상기 추출물을 편백나무 용기에 넣고 락토바실러스 사케이를 접종하여 25~35℃에서 48~72시간 동안 발효시키는 것으로 이루어지는 것이다.

본 발명의 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물은 천연성분을 함유하여 안전하며 그 상승작용에 의하여 우수한 피부 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보습 개선 효과를 나타내므로 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따르면, 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명 화장료 조성물에 유효성분으로서 함유되는 하스카프(Lonicera caerulea)는 댕댕이나무(Lonicera caerulea) 열매이며 북러시아, 중국 및 일본에서 민간요법에 사용되어왔으나, 북아메리카, 유럽 및 한국에서는 식용 열매로서 거의 알려지지 않았다. 댕댕이나무(Lonicera caerulea)는 꼭두서니목 인동과의 쌍떡잎식물로 높이가 1.5m에 달하는 낙엽 관목으로서 가지가 많이 갈라지고 작은 가지의 마디에 방패 모양의 포엽이 있고 나무줄기의 속부분은 흰색이다. 잎은 마주나며 바소꼴이거나 타원형이고, 양끝이 뭉뚝하거나 날카로우며 톱니가 없고 가장자리 및 표면에 짧은 털이 나고 뒷면에 융모가 많다. 꽃은 대개 꽃자루가 짧고 잎겨드랑이에 달리며, 꽃부리는 깔때기 모양으로 엷은 황백색이며 여름에 핀다. 꽃받침은 거치처럼 5개로 갈라지며, 화관은 황백색이고 원통상 종형이며 길이 1.2 내 지 1.5cm로서 털이 약간 있는 형태이다. 또한, 수술은 암술대보다 짧고 털이 없으며, 자방은 2개가 합쳐진다. 상기 댕댕이나무는 시베리아, 사할린, 중국 북부, 티베트, 북한 등지에 분포하고 있는 냉대성 식물로 알려져 있다.

으름덩굴(Akebia quinata)은 으름이라고도 한다. 산과 들에서 자란다. 길이 약 5m이다. 가지는 털이 없고 갈색이다. 잎은 묵은 가지에서는 무리지어 나고 새가지에서는 어긋나며 손바닥 모양의 겹잎이다. 작은잎은 5개씩이고 넓은 달걀 모양이거나 타원형이며 가장자리가 밋밋하고 끝이 약간 오목하다. 꽃은 암수한그루로서 4~5월에 자줏빛을 띤 갈색으로 피며 잎겨드랑이에 총상꽃차례로 달린다. 꽃잎은 없고 3개의 꽃받침조각이 꽃잎같이 보인다. 수꽃은 작고 6개의 수술과 암꽃의 흔적이 있으며, 암꽃은 크고 3~6개의 심피가 있다. 꽃받침은 3장, 열매는 장과(漿果)로서 긴 타원형이고 10월에 자줏빛을 띤 갈색으로 익는다. 길이 6~10㎝이고 복봉선(腹縫線)으로 벌어진다. 번식은 종자나 포기나누기·꺾꽂이 등으로 한다. 관상용으로 심으며 과육(果肉)은 먹을 수 있고, 덩굴은 바구니를 만든다. 한방에서는 뿌리와 줄기가 소염·이뇨·통경 작용에 효능이 있으므로 약재로 쓴다. 한국(황해도 이남)·일본·중국 등지에 분포한다. 작은잎이 6~9개인 것을 여덟잎으름(var. polyphylla)이라고 하지만 중간형이 있다. 본 발명에서는 으름덩굴의 잎, 줄기, 열매, 뿌리 또는 전초가, 바람직하게는 잎 또는 줄기가 사용된다.

속새(Equisetum hyemale)는 관다발식물 속새목 속새과의 상록 양치식물이며 습한 그늘에서 자란다. 높이 30~60㎝이고 짙은 녹색이며, 땅속줄기가 옆으로 뻗으면서 모여 난다. 뚜렷한 마디와 능선이 있고 잎은 퇴화하여 잎집같다. 잎집에 톱니처럼 생긴 것이 잎이며 10~18개씩이다. 잎집의 밑부분과 톱니는 갈색 또는 검은빛을 띄운다. 포자낭 이삭은 원줄기 끝에 달리고 원뿔 모양이며 녹갈색에서 황색으로 변한다. 능선에 규산염이 축적되어 딱딱하므로 나무의 면을 갉아내는 데 쓴다. 한방에서는 전초를 장출혈과 지혈제로 사용한다. 본 발명에서는 속새의 전초가 사용된다.

긴병꽃풀(Glechoma hederacea) 쌍떡잎식물 합판화군 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀이며 산지의 습한 양지에서 자란다. 줄기는 모나고 퍼진 털이 있으며 처음에는 곧게 서나, 자라면서 옆으로 50cm 정도 뻗는다. 잎은 마주나고 긴 잎자루가 있으며, 둥근 신장형(腎臟形)으로 가장자리에 둔한 톱니가 있다. 4~5월에 연한 자주색 꽃이 줄기 위 잎겨드랑이에 돌려난다. 화관은 입술꼴로 윗입술꽃잎은 약간 오목하고 아랫입술꽃잎은 3갈래로 갈라지며 안쪽에 자주색 반점이 있다. 수술은 4개이며 2개가 길다. 꽃받침은 통 모양이고 끝이 바늘 모양이며 5갈래로 갈라진다. 열매는 분과(分果)로 꽃받침 안에 들어 있고 타원형이다. 본 발명에서는 긴병꽃풀의 전초가 사용된다.

본 발명 화장료 조성물의 유효성분으로서의 상기 혼합발효추출물은 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀이 각각 1~2:1~3:1~2:1~3의 중량비로, 더욱 바람직하게는 1~2:2~3:1~2:1의 중량비로 혼합되어 추출된 것이다.

상기 혼합발효추출물은 유산균을 발효균주로 하여 발효시켜 제조된다. 바람직하게는 상기 유산균은 락토바실러스 속 유산균(Lactobacillus sp.)이다.

더욱 바람직하게는 상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나이며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 사케이(Latilactobacillus sakei) 이다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 혼합발효추출물은 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀의 혼합물을 또는 그 혼합추출물을 편백나무 용기에 넣고 락토바실러스 사케이를 접종하고 발효 숙성시켜 제조한다. 일반 용기를 사용하는 경우에 비하여 편백나무 소재의 용기에 넣고 발효 숙성시키는 경우에 더욱 우수한 피부장벽강화, 피부재생 및 피부 보습활성을 나타내므로 바람직하다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A) 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀을 각각 1~2:1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;

먼저, 본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀을 각각 1~2:1~3:1~2:1~3의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조한다. 이때, 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀을 각각 1~2:2~3:1~2:1의 중량비율로 혼합하는 경우에 더욱 우수한 활성을 나타내므로 더욱 바람직하며, 각각 2:3:2:1의 중량비율로 혼합하여 추출하는 경우에 보다 우수한 활성을 나타내므로 가장 바람직하다.

이어서 상기 혼합물을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하여 혼합추출물을 제조한다.

제조된 상기 혼합추출물에 유산균을 발효 균주로 사용하여 혼합발효추출물을 제조한다. 이때, 발효 균주로 사용되는 유산균은 락토바실러스 속 균주, 그 중에서도 락토바실러스 사케이를 사용하는 경우에 더욱 우수한 활성을 나타내었다.

본 발명의 더욱 바람직한 일 구체예에 따르면, 이 발효단계(상기 (C) 단계)는 상기 혼합추출물을 편백나무 용기에 넣고 락토바실러스 사케이를 접종하여 25~35℃에서 48~72시간 동안 발효 숙성시키는 것으로 이루어진다.

이와 같이 제조되는 상기 혼합발효추출물은 우수한 피부장벽강화 효과(시험예 2, 3), 피부재생 효과(시험예 4) 및 피부보습 효과(시험예 5, 6)를 나타내었다.

그러므로 상기 혼합발효추출물은 피부 피부장벽강화용, 피부재생용 및 피부보습용인 화장료로 유용하게 사용될 수 있다. 유효성분으로서의 상기 혼합발효추출물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물 외에 피부장벽강화, 피부재생 및 피부보습, 피부 탄력 증진 효과를 나타내는 다른 유효 성분이나 첨가제를 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제조예, 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 하스카프 추출물의 제조

건조된 하스카프 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말 100g을 얻었다.

제조예 2: 으름덩굴 추출물의 제조

건조된 으름덩굴 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

제조예 3: 속새 추출물의 제조

건조된 속새 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

제조예 4: 긴병꽃풀 추출물의 제조

건조된 긴병꽃풀 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

제조예 5~7: 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합추출물의 제조

아래의 표 1의 중량비로 혼합한 후, 정제수로 세척한 뒤 건조시킨 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합물 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합물을 추출한 후, 추출액을 300메쉬 여과지로 여과하고 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말을 얻었다.

중량비	하스카프	으름덩굴	속새	긴병꽃풀
제조예 5	1	1	1	1
제조예 6	1	2	1	1
제조예 7	2	3	2	1

실시예 1~3: 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물의 제조

상기 제조예 5~7에서 제조된 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합추출물을 멸균하였다. 상기 멸균 단계를 거친 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합추출물과 정제수를 편백나무 소재의 용기에 넣고, 락토바실러스 사케이(Latilactobacillus sakei)를 1×10⁶ CFU/㎖의 농도로 접종하여 25~35℃에서 72시간 동안 발효하였다. 발효액을 여과 후 농축 건조하여 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 제조하였다.

시험예 1: 세포 생존율 측정 시험

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인 하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO_2,37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

구분	세포 생존율(%)
구분	0.1 %	0.5 %	1 %	5.0 %
제조예 1	100	101	100	100
제조예 2	100	101	100	100
제조예 3	101	100	100	100
제조예 4	100	101	100	100
제조예 5	101	100	100	100
제조예 6	101	101	100	101
제조예 7	100	101	100	100
실시예 1	100	100	101	101
실시예 2	101	100	101	100
실시예 3	100	101	101	100
대조군Adenosine	100	100	101	101

구분	세포 생존율(%)
구분	0.001 %	0.005 %	0.01 %	0.05 %
대조군 Hyaluronic Acid	100	100	101	101

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 제조예 1 내지 7 및 실시예 1 내지 3 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

시험예 2: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과

제조예 1 내지 7 및 실시예 1 내지 3 시료를 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 3에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

TGase-1 발현증가율(%)=(시료 TGase-1 발현양/대조군 TGase-1 발현양)×100

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
TGase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
TGase-1	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

그 결과는 각각 표 4에 나타내었다.

	처리농도(w/v%)	TGase-1 발현 증가율(%)
Control	0.1	100
제조예 1	0.1	45
제조예 2	0.1	34
제조예 3	0.1	39
제조예 4	0.1	44
제조예 5	0.1	49
제조예 6	0.1	55
제조예 7	0.1	50
실시예 1	0.1	94
실시예 2	0.1	100
실시예 3	0.1	105

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 실시예 1 내지 3의 경우, 제조예 1 내지 7에 비하여 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현효과를 나타내었으며, 실시예 2, 실시예 3에서 더욱 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 제조예 5~7의 혼합추출물이 제조예 1 내지 4의 각각의 추출물에 비하여는 더 우수한 Transglutaminase-1의 유전자 발현효과를 나타내는 것을 통해 각 성분의 혼합에 따른 상승작용이 있음을 확인할 수 있었다.

시험예 3: Filaggrin 발현증가 효과 확인

각질형성세포(HACAT)를 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 상기 실시예 및 제조예의 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 필라그린(Filaggrin)의 발현 증가율을 확인하였다. Filaggrin 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다.

Filaggrin 발현증가율(%)=(시료 Filaggrin 발현양/대조군 Filaggrin 발현양)××100

시료명	처리농도(w/v%)	Filaggrin 발현증가율(%)
제조예 1	0.1	35
제조예 2	0.1	20
제조예 3	0.1	22
제조예 4	0.1	28
제조예 5	0.1	24
제조예 6	0.1	25
제조예 7	0.1	31
실시예 1	0.1	76
실시예 2	0.1	81
실시예 3	0.1	87
히알루론산	0.1	96

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이 동일 농도 처리 시, 유산균 발효에 의하여 제조된 실시예 1 내지 3의 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물은 제조예 1 내지 4의 각각의 추출물이나, 제조예 5~7의 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합추출물보다 우수한 Filaggrin 발현효과를 나타내었으며, 히알루론산과 비교해도 동등하거나 우수한 효과를 나타내었다. 특히, 실시예 3에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 4: 피부재생 효과

피부 상처 치유 효과를 확인 하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성 세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 5% CO₂ incubator에서 cell culture dish에 세포를 배양한다. 6 well plate에 5×10⁵cells/well의 세포를 분주 후 제조예 1 내지 7 및 실시예 1 내지 3의 시료를 처리하여 37℃ 5% CO₂ incubator에서 18시간 배양하였다. 세포 재생율을 아래 식에 의하여 산출하였고 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다. 그 결과는 각각 표 6에 나타내었다

세포 재생율(%)= 시료 세포 재생율/ 대조군 세포 재생율××100

시료	처리농도(㎍/㎖)	세포 재생율(%)
Dexamethason	500	85
제조예 1	1000	39
제조예 2	1000	33
제조예 3	1000	41
제조예 4	1000	37
제조예 5	1000	44
제조예 6	1000	38
제조예 7	1000	50
실시예 1	1000	81
실시예 2	1000	86
실시예 3	1000	95

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 혼합발효추출물에서 제조예 1 내지 7의 추출물에 비하여 높은 피부 세포재생율을 나타냄을 알 수 있었다. 실시예 2, 3에서 보다 우수한 피부재생효과를 나타내었다.

시험예 5: 피부보습 효과

Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과

제조예 1 내지 7 및 실시예 1 내지 3의 시료를 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 HAS-3의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 7에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
HAS-3	Forward : ACTGCCTTCAAGGCCCTTGG
HAS-3	Reverse : AATGTTCCAGATGCGGCCAC

그 결과는 표 8에 나타내었다.

	처리농도(w/v%)	HAS-3 증가율(%)
Control	0.1	90
제조예 1	0.1	28
제조예 2	0.1	24
제조예 3	0.1	25
제조예 4	0.1	30
제조예 5	0.1	29
제조예 6	0.1	38
제조예 7	0.1	41
실시예 1	0.1	80
실시예 2	0.1	85
실시예 3	0.1	92

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 실시예 1 내지 3은 제조예 1 내지 7에 비하여 높은 HAS-3 증가율을 나타내어 보습효과가 우수함을 확인하였다.

시험예 6: 히알루로니다제의 활성 억제 효과 확인

히알루로니다제 활성억제 효과를 측정하였다. 모르간 엘손(Morgan-Elson)법을 응용한 방법으로서, 히알루로니다제의 최종 효소 활성을 400NF unit/㎖, HA의 최종농도를 0.4㎎/㎖로 하고 활성제인 Compound 48/80 완충(buffer) 용액(0.1㎎/㎖)을 사용하여 불활성형 히알루로니다제의 활성화 단계의 저해작용을 중심으로 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 시료는 완충용액(buffer)에 용해하여 시료 용액으로 하고 대조군은 시료 용액 대신에 완충 용액을 사용하였다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다. 히알루로니다아제의 활성 저해율(%)은 아래의 수학식으로 계산하였다.

히알루로니다제 활성 저해율(%)= [(A-B)/A]×100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소 활성

B: 시료를 첨가한 웰의 효소 활성

구분	히알루로니다제 활성 저해율(%)
구분	0.1%	0.5 %	1 %
제조예 1	23.5	30.2	41.2
제조예 2	31.5	36.5	55.8
제조예 3	29.1	35.6	59.6
제조예 4	30.1	37.6	51.4
제조예 5	30.2	34.6	42.6
제조예 6	28.4	33.4	46.2
제조예 7	27.1	31.6	51.4
실시예 1	52.3	62.3	65.2
실시예 2	55.3	68.9	72.3
실시예 3	70.8	72.5	78.6
Hyaluronic Acid	73.2	73.2	75.6

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이 상기 실시예 1~3의 혼합발효추출물에서 더욱 우수한 히알루로니다제 활성 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

제형 실시예 1: 스킨로션의 제조

하기 표 10의 조성에 따라, 하기의 방법으로 본 발명 실시예의 혼합발효추출물을 함유하는 스킨로션 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	혼합발효추출물(실시예 3)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 10에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제형 실시예 2: 영양로션의 제조

하기 표 11의 조성에 따라, 하기의 방법으로 본 발명 실시예의 혼합발효추출물을 함유하는 영양로션 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	혼합발효추출물(실시예 3)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 11에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서, 80~85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80~85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

시험예 7: 제형안정도 확인

상기 제형 실시예 1~2에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인하였다. 결과는 표 12에 나타내었다.

	온도조건	1주	2주	3주	4주	5주	6주	7주	8주	9주	10주	11주	12주
제형 실시예 1	실온(25℃)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	냉장(4℃)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	항온(50℃)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
제형 실시예 2	실온(25℃)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	냉장(4℃)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	항온(50℃)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

< 제형안정등급>

0: 변화없음, 1: 미세한변화, 2: 변화, 3: 극심한변화

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

Claims

하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀을 각각 1~2:2~3:1~2:1의 중량비율로 혼합하여 추출한 후, 유산균으로 발효시켜 제조되는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합발효추출물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 장벽강화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 재생용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
(A) 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀을 각각 1~2:2~3:1~2:1의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
(B) 상기 혼합물을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세 린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계;
(C) 상기 추출물을 편백나무 용기에 넣고 락토바실러스 사케이를 접종하여 25~35℃에서 48~72시간 동안 발효시키는 단계;
(D) 여과 후 농축하는 단계를 포함하는 하스카프, 으름덩굴, 속새 및 긴병꽃풀 혼합발효추출물의 제조방법.
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