KR101901451B1 - 천연 공융 용매로 추출한 꽃 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 공융 용매로 추출한 꽃 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 개나리꽃(Forsythia Koreana), 유채꽃(Brassica Napus), 수선화(Narcissus), 서양민들레꽃(Taraxacum officinale), 양지꽃(Potentilla Fragarioides), 목련꽃(Magnolia Kobus), 모란(Paeonia Suffruticosa), 매화(Prunus mume), 동백나무꽃(Camellia Japonica), 세룰라타벚나무꽃(Prunus serrulata) 및 푸르메리아 루브라꽃(Plumeria Rubra)으로 이루어지는 꽃 혼합물을 천연 공융 용매를 이용하여 추출하고, 이를 다시 효소 처리하여 피부보습, 항균, 진정, 피부재생 및 주름개선 활성이 우수한 꽃 혼합추출물을 제조하는 방법 및 이 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

천연 공융 용매로 추출한 꽃 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing flower extracts prepared by a method based on natural deep eutectic Solvents}

본 발명은 천연 공융 용매로 추출한 꽃 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 개나리꽃(Forsythia Koreana), 유채꽃(Brassica Napus), 수선화(Narcissus), 서양민들레꽃(Taraxacum officinale), 양지꽃(Potentilla Fragarioides), 목련꽃(Magnolia Kobus), 모란(Paeonia Suffruticosa), 매화(Prunus mume), 동백나무꽃(Camellia Japonica), 세룰라타벚나무꽃(Prunus serrulata) 및 푸르메리아 루브라꽃(Plumeria Rubra)으로 이루어지는 꽃 혼합물을 천연 공융 용매를 이용하여 추출하고, 이를 다시 효소 처리하여 얻은 꽃 혼합추출물을 함유하여 우수한 피부보습, 항균, 진정, 피부재생 및 주름개선 활성을 나타내는 화장료 조성물을 제조하는 기술에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 이와 같은 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부 미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부지질 중에서도 피부장벽기능을 담당하는 주된 지질은 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되면서 생성되는 지질로서, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes) 사이의 공간을 채우고 있어서 세포간의 결합력을 부여하는 역할도 하고 있는데, 이러한 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되어 있고 이들은 각각 지질층 지질 전체의 약 40~65%, 10% 및 25%를 차지한다. 또한 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재하는 조성을 가진다.

세라마이드는 스핑고신에 지방산이 연결되어 있는 구조를 가지고 있는 스핑고지질의 일종이다. 세라마이드는 피부각질층을 구성하는 각질세포간지질 중 약 40% 이상을 차지하며, 수분증발을 억제하는 방어벽 역할과 각질층의 정연한 구조를 유지하게 하는 기능을 가지고 있다. 피부 각질층은 각화된 세포가 벽돌모양의 다층구조로 구성되어 있으며 이러한 각화세포는 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리 지방산에 의해 견고히 결합되어 있어 피부 장벽기능 및 피부보습에 도움이 된다.

피부는 외부의 세균 침입 및 손상으로부터 보호하는 방어역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분 손실을 방지 하는 것 인데 표피에서 재생 능력을 보이는 것으로 알려진 것에는 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포 keratinocyte stem cell)가 있으며 피부 표면에 존재하는 표피 세포들은 바깥 표피 쪽으로 분화되어 나가면서 지질을 생산하고 분비하여 단백질로 각질화된(cornified) 원형질막에 이중층으로 된 조직을 형성한다. 외피 세포는 끊임없이 벗겨지고 다시 자라나는 이 과정이 반복된다. 외부로부터 피부 손상이 일어났을 경우 상처 치유 과정이 일어나는데 표피와 진피의 손상으로 기저막에 노출되어 있으면서 표피가 손실된 상처는 상처 표면에 선홍색을 띤다. 새로운 결체 조직을 형성하는 것으로 새로운 혈관 생성과 콜라겐 합성 과정이 있다. 섬유아세포는 콜라겐 합성 및 기타 결체 조직 형성에서 가장 중요한 세포 이므로 상처 복구 과정에서도 중요한 역할을 한다. 섬유아세포는 혈소판 대식 세포 등에 의해 염증기에 생성된 산물과 성장인자 등에 반응하여 움직이고 증식하며 염증기 후반부의 상처에 나타나기 시작한다. 노화가 진행되면서 피부 손상을 회복시키는 섬유아세포의 증식이 줄어들게 되고 콜라겐 등의 합성능이 떨어지면서 재생 능력이 낮아져 이로 인해 상처 부위의 회복이 느려지게 된다. 따라서 활성 생성 억제, 이로 인해 발생하는 염증 반응 억제 및 상처로부터 피부 재생을 촉진시켜 피부를 보호하여야 한다.

최근 노화의 원인으로 밝혀진 활성산소종은 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화현상을 촉진한다. 그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며, MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다. MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-acroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

오래 전부터 일반적으로 액상 추출에는 유기용매가 사용되었다. 유기용매는 값이 싸고 추출효율이 좋은 장점을 가지고 있으나 실험자의 건강에 유해하고 환경오염 문제를 야기시킬 수 있는 단점이 있다. 최근 이러한 유기용매의 단점을 극복하고자 여러 가지 청정용매(green solvents)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이에 따라 유기용매의 대안으로 이온성 액체나 공융 용매(Deep Eutectic Solvents)의 사용이 제시되어 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

이온성 액체(ionic liquids)는 거대 헤테로 고리 양이온과 다양한 무기 음이온의 결합으로 이루어진 염으로, 낮은 융점을 가져 상온에서 액체로 존재한다. 이온성 액체는 끓는점이 낮고, 낮은 증기압, 비휘발성, 낮은 융해점, 높은 이온 전도성 등을 갖기 때문에 추출과 분리 분야에 적용되어 왔다. 그러나 한편으로는 이러한 이온성 액체가 인체에 유해한 독성을 갖고 있으며 생분해성이 낮고 미량의 불순물에 의해서도 이온성 액체의 물리적 특성이 영향을 받을 수 있으며, 이온성 액체 합성 시 음이온의 완전한 교환을 위해 많은 염과 용매를 사용하기 때문에 환경친화적인 용매에 부적합하며 가격이 높다는 단점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 공융용매(Deep Eutectic solvent, DES)가 개발되었다. 이러한 DES는 가격이 싸며, 독성이 없어 인체에 무해하고 밀도, 점도, 이온 전도도 등 많은 물리화학적 특성이 이온성 액체와 유사하기 때문에 새로운 청정용매로 많은 연구가 진행되고 있다.

본 발명자들은 상기 공융 용매 중에서도 천연 화합물에 의해 이루어지는 공융 용매인 천연 공융 용매(Natural Deep Eutectic Solvents, NADES)를 이용하는 천연물 추출에 관하여 연구하여 피부 안전성이 확보된 새로운 천연 화장료를 개발하고자 하였으며, 상기 용매를 사용하며 본 발명의 꽃 혼합추출물을 제조하는 경우 그 활성이 증대되어 우수한 피부보습, 항균, 진정, 재생 및 주름개선 효능을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 공개특허 10-2015-0070610(2015.06.25.) (0002) 대한민국 공개특허 10-2013-0120597(2013.11.05.)

본 발명은 천연 공융 용매를 사용하여 피부 안전성이 확보되면서, 피부개선활성이 증대되는 꽃 혼합추출물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조되어 우수한 피부보습, 항균, 진정, 재생 및 주름개선 효과를 나타내는 꽃 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, A)건조된 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타벚나무꽃 및 푸르메리아 루브라꽃을 혼합하여 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하는 단계; B)상기 단계에서 제조된 추출물을 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융 용매 및 용매로 다시 추출하는 단계; C)상기 B)단계에서 제조된 추출물에 β-글루코시다아제 효소를 가하여 효소반응시키는 단계; 및 D)상기 효소반응 완료 후 여과하는 단계를 포함하는 꽃 혼합추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 A)단계에서 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타벚나무꽃 및 푸르메리아 루브라꽃은 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합하여 추출되는 것이며, 더욱 바람직하게는 1:2~3:2~3:2~3:1:1:1:1:2~3:1:1로 혼합되어 추출되는 것이며, 가장 바람직하게는 1:3:3:3:1:1:1:1:3:1:1의 비로 혼합하여 추출되는 것이다.

상기 A)단계에서 추출은 30% 에탄올을 추출용매로 하여 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 B)단계에서 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융 용매는 용매인 물과 0.5~2:10의 중량비율로 혼합하여 사용되는 것이며, 더욱 바람직하게는 비테인(Betaine) 5중량%, 사카로즈(Saccharose) 5중량% 및 물 90중량%의 비율로 사용되는 것이다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 제조방법에 의하여 제조되는 꽃 혼합추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 피부장벽강화용, 보습용, 항균용, 피부진정용, 피부 재생 또는 주름개선용인 것을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따라 제조되는 꽃 혼합추출물은 피부장벽 강화, 피부보습, 항균, 진정, 재생 및 주름개선 활성이 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피부장벽강화, 보습, 항균, 진정, 재생 및 주름개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 꽃 혼합추출물의 피부장벽 강화 시험에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 꽃 혼합추출물의 보습 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3 내지 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 꽃 혼합추출물의 주름개선 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명 화장료 조성물에 함유되는 추출물 원료인 개나리(Forsythia Koreana)는 물푸레나무과(Oleaceae)의 낙엽성 소교목으로 잎은 장타원형 또는 주걱모양으로 꽃은 노란색이며 4월경에 피고 열매는 난상 타원형이며 9월에 성숙한다. 이 나무의 열매를 연교라 하여 약재로 사용하며, 연교는 항균작용, 항염증 및 혈압강하작용 및 피부미백, 항산화 효과, collagen 합성 및 MMP-1의 합성을 저해하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

유채(Brassica napus)는 십자화과에 속하며 캐나다, 아르헨티나, 인도 등에서 다량 재배되고 있는 유종실 작물이며, 국내에서는 제주도 전역과 중남부 지역에서 재배되고 있는 중요한 자원이다. 특히 유채는 일부분을 산업에 직 간접적으로 활용할 수 있는 에너지 작물이며 주로 종실로부터 기름을 짜서 이용하는 유지 작물 중 하나이다.

수선화(Narcissus)는 수선화속 식물의 총칭이다. 유럽, 지중해, 북아프리카, 중동에서 한국. 중국에 이르기까지 널리 분포하여, 약 30종이 있다. 알뿌리는 비늘줄기로 둘레가 8cm인 소형에서 20cm에 이르는 대형인 것까지 있다. 줄기는 품종에 따라 10-50cm로 크기에 차이가 있다. 잎은 줄모양이고 길이 12-50cm이며 너비 0.5-3cm이다. 꽃은 꽃줄기 끝에 홀로 또는 산형꽃차례로 피며, 지름 1.5cm 정도의 소륜에서 12cm에 이르는 대륜까지 있다. 꽃덮이조각은 가로로 퍼지며 덧꽃부리는 나팔모양 또는 컵모양이다. 꽃색은 노랑·흰색·다홍·담흥색 등이다. 꽃피는 시기는 겨울철에서 5월 무렵까지이다.

서양민들레(Taraxacum officinale)는 민들레속에 속하는 여러해살이풀이다. 전 세계의 기후가 온화한 지역에서 발견할 수 있으며 길가나 공원, 아파트 단지, 잔디밭 등 습기 있는 흙이 있는 곳에 자란다. 유럽 원산의 귀화 식물로, 유럽, 아시아, 아메리카 대륙에서는 대표적인 잡초로 간주하지만, 의약 성분을 추출하거나 식용으로도 쓰인다.

양지꽃(Potentilla fragarioides)은 장미과에 속하는 여러해살이풀이다. 주로 양지바른 산지나 초원, 때로는 높은 산에서도 자라며 한국 각지에 분포하고 있다. 줄기는 주로 뿌리 부분에서 나오며, 각각 5-7개의 작은 잎(소엽)을 가지고 있는데, 이 중 끝에 붙는 3개의 작은 잎은 특히 작다. 꽃은 지름이 2-3cm 정도로 5개의 노란 꽃잎을 가지며, 바깥쪽에는 5개씩의 꽃받침과 부꽃받침조각을 가지고 있는데, 이들은 모두 녹색이다. 한편, 많은 수의 수술과 암술이 있다. 열매는 수과로 달걀 모양이며, 약간의 주름이 있다.

목련(Magnolia Kobus)은 세계적으로 널리 분포하는 낙엽교목으로 크고 아름다운 흰색꽃이 핀다. 꽃눈이 붓을 닮아서 목필이라고도 하고, 꽃봉오리가 피려고 할 때 끝이 북녘을 향한다고 해서 북향화라고 한다.

모란(Paeonia suffruticosa)은 작약과의 잎지는 떨기나무이다. 그 꽃을 이르는 말이기도 하며, 중국 북서부가 원산이다. 5월에 새가지 끝에 흰색 또는 빨간 자줏빛이 도는 꽃이 1개 핀다. 꽃의 지름은 10-17cm이며 5-8장의 꽃잎이 달린다. 꽃잎은 거꿀달걀꼴로 가장자리에 불규칙한 톱니가 있다. 수술은 많고 암술은 3-5개이며, 씨방은 밑부분이 꽃턱으로 둘러싸여 있다. 뿌리의 껍질은 목단피라 하여 한방에서는 소염. 진통제로서 총수염, 월경통, 부스럼등의 치료에 사용한다. 또한 tyrosinase 활성 억제작용으로 미백효능과 항산화 효능을 가진 것으로 알려져 있다.

매실나무(Prunus mume)는 장미과에 속하는 나무로, 매화나무라고도 한다. 우리나라 남부지방에서 3월부터 잎보다 먼저 연한 붉은 색을 띤 흰빛 꽃을 피우며 향기가 난다. 보통 한 눈에 1~3개의 꽃이 달리며 꽃 색은 백색, 담홍색, 홍색 등 품종에 따라 여러가지이다. 매화꽃은 건위제, 해독제, 거담제, 진정제, 눈병과 피부질환에 효능이 있으며 항산화 활성이 우수한 것으로 알려져 있다.

동백나무(Camellia japonica)는 동백나무과에 속하는 상록교목으로 주로 남해안과 도서지역, 서쪽으로는 대청도와 동쪽으로는 울릉도까지 분포하며 특히 전남지역이 전국 식재 면적의 67% 차지하고 있다. 일본에서는 건조시킨 동백 꽃봉오리를 민간에서 토혈증, 지혈제등으로 사용했으며, 진경작용, 알코올 흡수억제, 피부 미백 작용등의 생리 활성이 보고되어 있다. 또한 동백나무잎은 여드름균인 P.acne의 항균활성으로 여드름 피부 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

세룰라타 벚나무(Prunus serrulata)는 장미목 장미과의 식물이다. 북반구에 널리 분포되어 있고, 유럽에서 서시베리아에 걸쳐서 3종, 일본에 200종, 동아시에 3종, 중국에 33종의 벗나무가 분포되어 있다. 4~5월에 분홍색 또는 백색의 벚꽃이 피며, 지금은 3cm 정도이다. 예로부터 꽃은 소금물에 침지 건조하여 차로 이용되었으며, 위장과 폐 기능 향상은 물론 항균, 항산화, 항염증 등에 관한 효능이 알려져 있다.

푸르메리아 루브라(Plumeria Rubra)는 협죽도과의 상록 관목식물로 멕시코, 콜롬비아, 베네수엘라 같은 중앙아메리카가 원산지이며, 하와이나 말레이시아에서는 꽃을 목걸이로 많이 사용하고 잎과 꽃봉오리는 약재로 사용하고 있다. 7~8월경에 5개의 하얀색 또는 노란색이나 분홍빛 꽃잎이 프로펠러형으로 피게 되며 가운데 부분은 색이 진하며 향기가 진하다. 푸르메리아는 Plumeride라는 흰색의 배당체를 함유하고 있고, 국부마취와 항견련작용을 한다고 알려져 있으며, 잎과 줄기에 들어있는 fulvo plumerine은 결핵균의 성장을 억제하고, 이뇨작용과 사하작용 효능으로 보고되었다.

본 발명에서 사용되는 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타 벚나무꽃, 푸르메리아 루브라꽃은 오프라인 또는 인터넷 마켓에서 구입할 수 있다.

본 발명에 따르면, A)건조된 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타 벚나무꽃 및 푸르메리아 루브라꽃을 혼합하여 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하는 단계; B)상기 단계에서 제조된 추출물을 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융 용매 및 용매로 다시 추출하는 단계; C)상기 B)단계에서 제조된 추출물에 β-글루코시다아제 효소를 가하여 효소반응시키는 단계; 및 D)상기 효소반응 완료 후 여과하는 단계를 포함하는 꽃 혼합추출물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 추출물의 제조에 있어서 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타 벚나무꽃, 푸르메리아 루브라꽃은 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나 가루로 만들어 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 물, 에탄올 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합)중에서 선택된 하나 이상의 용매가 사용될 수 있다.

이 때 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타 벚나무꽃 및 푸르메리아 루브라꽃은 건조중량비로 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합하여 추출되는 것이며, 더욱 바람직하게는 1:2~3:2~3:2~3:1:1:1:1:2~3:1:1로 혼합되어 추출되는 것이며, 가장 바람직하게는 1:3:3:3:1:1:1:1:3:1:1의 비로 혼합하여 추출되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 건조 후 세절하고 상기 비율로 혼합한 꽃 혼합물을 그 건조 중량의 1~80배 부피량의 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 부틸렌글라이콜 및 프로필렌글라이콜로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 추출용매로 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하고 50~55℃에서 감압 농축하여 추출물을 제조한다. 30% 에탄올을 추출용매로 하여 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하는 것이 더욱 바람직하다.

이와 같이 용매추출물을 제조 후, 다시 천연 공융 용매를 사용하여 추출한다. 공융 용매(DES, Deep Eutectic Solvents)는 염과 HBD가 수소결합으로 공융되어 있는 상태이며, 염과 HBD(hydrogen bond donors, 수소결합 주개)를 일정한 비율로 혼합하여 제조된다. 특정 생리활성 강화 추출물의 제조에 있어서, DES 종류의 선택은 매우 중요하다. 확산, 용해도, 점도, 표면장력, 극성, 고상과 액상 사이에서 일어나는 물리화학적 상호작용은 추출 수율에 많은 영향을 주기 때문이다. 본 발명에서는 염으로서 비테인(Betaine)을 사용하였다. 비테인(Trimethylglycine)은 천연 화합물로 Glycine의 N원자에 3개의 메틸기가 부착되어 있는 quarternary ammonium compound이다. 또한 HBD(수소결합주개)로는 사카로즈(Saccharose)를 사용하였다. 사카로즈(C₁₂H₂₂O₁₁)는 수크로스(sucrose) 또는 자당(蔗糖)으로도 불리며, 사탕수수나 사탕무 등에서 얻을 수 있다.

공융 용매를 직접 추출용매로 사용할 수 있지만, 점도가 높으므로 추출 효율을 높이기 위해 다른 용매와 혼합하여 사용한다. 본 발명에서 바람직하게는 물을 용매로 사용한다. 이때, 공융 용매는 용매인 물과 0.5~2:10의 중량비율로 혼합하여 사용하며, 더욱 바람직하게는 비테인(Betaine) 5중량%, 사카로즈(Saccharose) 5중량% 및 물 90중량%의 비율로 혼합 사용한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 용매추출물을 물 90중량%, Betaine 5중량%, Saccharose 5중량%로 이루어진 혼합용매에 넣어 40~45℃에서 3~4시간동안 추출한다.

이어서, 유효성분을 더욱 효율적으로 추출하기 위하여 상기 추출물을 다시 효소 처리한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 β-글루코시다아제 효소를 사용한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 공융 용매를 사용하여 추출한 추출물에 β-글루코시다아제 효소를 넣어 50~55℃에서 100rpm 정도로 교반하면서 4~5시간 동안 반응시킨다. 반응이 완료되면 90℃로 5분 정도 가온하여 효소반응을 정지시킨 후, 여과하고 감압농축기로 농축하여 꽃 혼합추출물을 제조한다.

본 발명에 있어서, 상기 꽃 혼합추출물은 각각의 추출물을 제조한 후 혼합하거나, 원료를 혼합한 후 추출하여 제조될 수 있다. 또한 상기 꽃 혼합추출물은 감압 농축한 농축액, 농축액을 동결 건조한 분말 또는 농축액을 분무 건조하여 건조한 분말일 수 있다.

위와 같이 일정한 비율로 혼합된 꽃 혼합물을 용매추출한 후, 공융 용매를 사용하여 다시 추출하고, 이어서 효소반응시켜 제조되는 본 발명의 꽃 혼합추출물은 그 상승작용에 의하여 각각의 추출물에 비하여, 그리고 일반적인 용매추출물에 비하여 우수한 피부장벽 강화 효과(시험예 2), 피부보습 효과(시험예 3), 항균효과(시험예 4), 피부진정효과(시험예 6), 피부재생효과(시험예 7) 및 피부 주름 및 탄력 개선효과(시험예 8 내지 10)를 나타내었다.

상기 꽃 혼합추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.001~10 중량%의 양으로 함유되며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01∼5 중량%의 양으로 함유될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 꽃 혼합추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 상기 꽃 혼합추출물 이외에 피부보습, 항균, 진정, 재생 및 주름개선 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

제조예 1: 천연 공융 용매를 이용한 개나리꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 개나리(Forsythia Koreana) 꽃 100.0g에 10배 중량의 추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하였으며 함께 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 30g의 추출물을 얻었다. 이 후 30g의 추출물을 NADES 공법으로 추출하기 위해 물 90%, Betaine 5%, Saccharose 5% 용매에 45℃에서 3시간동안 중탕 추출하였다. 이 후 β-글루코시다아제 효소 3g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 3g의 개나리꽃 추출물을 얻었다.

제조예 2: 천연 공융 용매를 이용한 유채꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 유채꽃(Brassica Napus)을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 유채꽃 추출물을 얻었다.

제조예 3: 천연 공융 용매를 이용한 수선화 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 수선화(Narcissus)를 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 수선화 추출물을 얻었다.

제조예 4: 천연 공융 용매를 이용한 서양민들레꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 서양민들레(Taraxacum Officinale)를 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 서양민들레꽃 추출물을 얻었다.

제조예 5: 천연 공융 용매를 이용한 양지꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 양지꽃(Potentilla Fragarioides)을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 양지꽃 추출물을 얻었다.

제조예 6: 천연 공융 용매를 이용한 목련꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 목련(Magnolia kobus) 꽃을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 목련꽃 추출물을 얻었다.

제조예 7: 천연 공융 용매를 이용한 모란꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 모란(Paeonia Suffruticosa) 꽃을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 모란꽃 추출물을 얻었다.

제조예 8: 천연 공융 용매를 이용한 매실나무꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 매실나무(Prunus Mume) 꽃을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 매실나무꽃 추출물을 얻었다.

제조예 9: 천연 공융 용매를 이용한 동백나무꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 동백나무(Camellia Japonica) 꽃을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 동백나무꽃 추출물을 얻었다.

제조예 10: 천연 공융 용매를 이용한 세룰라타 벚나무꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 세룰라타 벚나무(Prunus Serrulata)꽃을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 세룰라타 벚나무꽃 추출물을 얻었다.

제조예 11: 천연 공융 용매를 이용한 푸르메리아 루브라꽃 추출물의 제조

건조 후 분쇄된 푸르메리아 루브라(Plumeria Rubra)꽃을 추출원물로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 추출하여 푸르메리아 루브라꽃 추출물을 얻었다.

실시예 1 내지 17: 천연 공융 용매를 이용한 꽃 혼합추출물의 제조

하기 표 1의 중량비로 각 성분을 혼합하여 분쇄한 건조 꽃 혼합물 100.0g을 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 추출하여 꽃 혼합추출물을 제조하였다.

성분(중량비)	실시예
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
개나리꽃	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
유채꽃	1	2	3	2	3	2	3	3	3	2	2	3	2	3	3	2	2
수선화	1	2	2	3	3	3	2	2	3	3	2	2	3	3	3	2	2
서양민들레꽃	1	2	2	2	3	3	3	3	2	3	2	2	2	3	2	3	3
양지꽃	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
목련꽃	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
모란	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
매실나무꽃	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
동백나무꽃	1	2	3	2	3	3	2	3	3	2	3	2	3	2	2	2	3
세룰라타벚나무꽃	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
푸르메리아루브라꽃	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

비교예 1 내지 5: 꽃 혼합추출물의 제조

하기 표 2의 중량비로 각 성분을 혼합하여 분쇄한 건조 꽃 혼합물 100.0g에 10배 중량의 추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하였으며 함께 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 30g의 추출물을 얻었다. 이 후 β-글루코시다아제 효소 3g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 꽃 혼합추출물을 얻었다.

성분(중량비)	비교예
	1	2	3	4	5
개나리꽃	1	1	1	1	1
유채꽃	1	2	3	2	3
수선화	1	2	2	3	3
서양민들레꽃	1	2	2	2	3
양지꽃	1	1	1	1	1
목련꽃	1	1	1	1	1
모란	1	1	1	1	1
매실나무꽃	1	1	1	1	1
동백나무꽃	1	2	3	2	3
세룰라타벚나무꽃	1	1	1	1	1
푸르메리아루브라꽃	1	1	1	1	1

효능을 확인 하고자 각각의 추출물은 농축 후 동결 건조하여 샘플을 준비하였다.

시험예 1: 세포 생존율 측정 시험

세포 배양

트랜스글루타미네이즈-1(transglutaminase-1, Tgase-1)은 각질형성세포가 각질 생성 또는 각질 분화시에 증가하는 대표적인 각질분화인자이다. 각질형성세포의 Tgase-1 발현량이 증가하면, 각질형성촉진에 따른 피부장벽이 강화되는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 실시예의 꽃 혼합추출물의 효능을 확인하기 위해 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과는 각질형성세포 HaCaT Cell을 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과는 CCD-986Sk 세포를 사용하였다. 또한 세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과도 HaCaT와 CCD-986Sk 세포를 사용하였다.

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인 하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO₂, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3시간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

구분	세포 생존율(%)
	0.1 %	0.5 %	1 %	5.0 %
실시예 1	101	100	100	101
실시예 2	101	101	100	100
실시예 3	101	100	101	100
실시예 4	100	100	100	100
실시예 5	101	101	100	100
실시예 6	100	100	101	101
실시예 7	101	100	101	100
실시예 8	100	100	101	100
실시예 9	100	100	100	101
실시예 10	101	101	100	100
실시예 11	100	100	101	100
실시예 12	100	100	100	100
실시예 13	101	100	100	100
실시예 14	101	100	101	100
실시예 15	101	101	100	100
실시예 16	100	100	101	101
실시예 17	101	100	101	100

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 실시예의 꽃 혼합추출물은 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

시험예 2: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과

제조예, 실시예 및 비교예의 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 4에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
Tgase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

그 결과를 도 1에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 용매 추출후 다시 공융 용매로 추출하고, 이를 효소반응시켜 제조되는 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예 1 내지 11의 각각의 꽃 추출물이나, 용매추출 후 효소반응시켜 제조되는 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물에 비하여 큰 Transglutaminase-1의 유전자 발현량을 나타내어 피부장벽강화 효과가 우수함을 확인 할 수 있었다.

시험예 3: 피부보습 효과

Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과

제조예, 실시예 및 비교예의 꽃 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
HAS-3	Forward : ACTGCCTTCAAGGCCCTTGG
	Reverse : AATGTTCCAGATGCGGCCAC

그 결과를 도 2에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 용매 추출후 다시 공융 용매로 추출하고, 이를 효소반응시켜 제조되는 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예 1 내지 11의 각각의 꽃 추출물이나, 용매추출 후 효소반응시켜 제조되는 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물에 비하여 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: Paper Disc 항균력 확인 시험

비교 시험 접종균(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans, Aspergillus niger)을 액체배지 또는 고체배지에서 증식한 신선한 배양균으로 2~3일 연속적인 계대 후에 사용한다. 단일 균의 집락 1개를 루프로 취하여 세균(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli)은 Tryptic Soy Broth 에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양, 진균(Candida albicans, Aspergillus niger)은 YM Broth에 접종하여 25℃에서 72시간동안 배양하고, 배양액을 1ｘ10⁶ CFU/ml 로 포함되도록 균액을 배지에 접종한다. 제조예, 실시예 및 비교예의 추출물을 20㎕씩 filter paper disc(8mm인 paper disc(advantec, Toyo)에 2회 loading 한다. 각각의 혼합추출물의 농도는 2%로 샘플제조 후 loding 하였다. Disc 주위에 생긴 증식 저지환(Inhibition zone)의 유무 및 크기로 항균 활성을 검색한다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

구분	Inhibition zone size(mm)
	S.aureus	P.aeruginos	E.coli	C.albicans	A.niger
실시예 1	30mm	30mm	32mm	31mm	32mm
실시예 2	42mm	50mm	45mm	44mm	45mm
실시예 3	45mm	55mm	42mm	40mm	42mm
실시예 4	50mm	52mm	40mm	45mm	48mm
실시예 5	100mm	110mm	98mm	100mm	95mm
실시예 6	48mm	50mm	42mm	48mm	47mm
실시예 7	51mm	48mm	45mm	50mm	41mm
실시예 8	55mm	52mm	43mm	51mm	49mm
실시예 9	52mm	57mm	47mm	48mm	50mm
실시예 10	49mm	50mm	48mm	52mm	47mm
실시예 11	50mm	48mm	52mm	47mm	46mm
실시예 12	54mm	47mm	50mm	49mm	40mm
실시예 13	56mm	50mm	48mm	47mm	41mm
실시예 14	44mm	40mm	42mm	43mm	40mm
실시예 15	46mm	42mm	48mm	42mm	47mm
실시예 16	50mm	48mm	42mm	41mm	48mm
실시예 17	49mm	52mm	48mm	43mm	42mm
제조예 1	20mm	25mm	28mm	26mm	25mm
제조예 2	19mm	22mm	18mm	17mm	20mm
제조예 3	21mm	18mm	20mm	16mm	8mm
제조예 4	18mm	20mm	21mm	20mm	19mm
제조예 5	22mm	19mm	24mm	19mm	20mm
제조예 6	21mm	22mm	18mm	21mm	18mm
제조예 7	17mm	19mm	20mm	16mm	17mm
제조예 8	20mm	17mm	19mm	20mm	19mm
제조예 9	21mm	20mm	18mm	19mm	20mm
제조예 10	19mm	18mm	20mm	22mm	19mm
제조예 11	20mm	17mm	21mm	19mm	20mm
비교예 1	4mm	5mm	6mm	8mm	7mm
비교예 2	10mm	8mm	7mm	11mm	9mm
비교예 3	11mm	9mm	8mm	11mm	10mm
비교예 4	10mm	11mm	9mm	12mm	10mm
비교예 5	12mm	10mm	10mm	13mm	12mm
대조군 1,2-Hexanediol	45mm	38mm	32mm	40mm	25mm

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예의 각각의 꽃 추출물이나, 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물과 비교해 볼 때, 균 5종류에 대한 Inhibition zone의 크기가 크게 나타났으며, 항균력이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 5의 꽃 혼합추출물에서 가장 우수한 항균활성을 나타내었다.

시험예 5: MMP-1 생성 억제 효과

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1에서 제조한 혼합추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다.

MMP-1 생성 억제율(%)	시료 농도(㎍/㎖)
	50	100	500	1000
실시예 1	24.7	38.1	52.1	65.4
실시예 2	35.4	49.7	57.1	74.2
실시예 3	37.1	51.9	60.4	76.1
실시예 4	32.4	47.6	52.4	70.9
실시예 5	69.1	78.3	87.1	96.4
실시예 6	39.1	57.1	70.7	80.8
실시예 7	34.8	49.8	58.6	73.1
실시예 8	34.7	48.3	57.7	72.1
실시예 9	41.2	59.7	64.9	80.1
실시예 10	40.1	58.6	72.8	82.7
실시예 11	45.8	65.1	75.8	85.4
실시예 12	35.7	52.6	59.1	74.9
실시예 13	38.2	56.7	60.3	76.1
실시예 14	32.5	46.5	50.1	71.5
실시예 15	33.3	47.9	52.0	72.1
실시예 16	37.6	55.8	67.5	76.8
실시예 17	38.4	57.0	62.1	78.0
제조예 1	14.7	22.1	40.8	49.4
제조예 2	18.2	27.6	40.2	54.6
제조예 3	15.4	25.6	34.9	47.6
제조예 4	17.6	27.4	39.5	46.7
제조예 5	14.8	23.9	42.1	52.1
제조예 6	13.6	22.1	39.7	49.8
제조예 7	18.7	29.4	42.1	53.1
제조예 8	14.5	24.9	41.5	50.7
제조예 9	16.8	24.9	37.6	45.1
제조예 10	19.1	31.7	43.4	55.6
제조예 11	16.1	23.4	37.1	44.7
비교예 1	10.4	19.7	37.5	44.1
비교예 2	12.7	20.7	31.1	40.7
비교예 3	11.5	19.4	29.7	38.6
비교예 4	13.4	21.7	38.6	47.5
비교예 5	12.5	21.6	30.7	41.6
TGF-β	43.6	67.5	75.6	94.3

상기 표 7 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예의 각각의 꽃 추출물이나, 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물과 비교해 볼 때, MMP-1생성 억제율이 더 높았으며, 특히 실시예 5의 꽃 혼합추출물에서 가장 높은 억제율을 나타내었다.

시험예 6 : 염증 매개 인자 IL-1α 발현 억제효과 확인

각질형성세포 (HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 x 10⁵cells/well로 조절한 수 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 IL-1α의 발현 증가율을 확인 하였다. IL-1α 발현 억제율은 하기식에 의해 산출 되었고 그 결과는 하기 표2에 나타 내었다. 대조군은 덱사메타손dexamethasone)을 사용하였다.

IL-1α의 억제율(%) = 시료 IL-1a 발현양/대조군 IL-1α발현양 X 100

하기의 표 8과 같은 결과를 얻었다.

IL-1α 억제율(%)	시료 농도(㎍/㎖)
	100	500	1000
실시예 1	30.10	42.37	54.25
실시예 2	41.52	52.30	64.14
실시예 3	39.36	50.14	62.36
실시예 4	38.14	49.74	61.20
실시예 5	57.87	69.72	75.60
실시예 6	36.85	47.25	59.14
실시예 7	42.10	53.14	65.25
실시예 8	40.25	51.74	63.28
실시예 9	38.47	48.14	60.38
실시예 10	41.85	51.39	63.17
실시예 11	37.52	46.25	60.14
실시예 12	39.65	51.01	62.74
실시예 13	37.87	45.17	59.72
실시예 14	36.14	45.17	58.22
실시예 15	38.36	48.17	61.87
실시예 16	37.32	45.97	60.52
실시예 17	38.14	49.01	58.10
제조예 1	20.87	30.76	42.83
제조예 2	22.56	32.89	44.74
제조예 3	19.54	28.44	39.85
제조예 4	18.52	27.33	38.11
제조예 5	21.55	31.02	67.32
제조예 6	17.63	25.14	37.14
제조예 7	18.10	27.04	37.89
제조예 8	21.63	30.78	66.10
제조예 9	18.85	28.11	37.11
제조예 10	22.52	32.45	43.95
제조예 11	20.12	30.01	41.85
비교예 1	10.25	21.74	32.69
비교예 2	14.20	24.80	35.33
비교예 3	12.50	23.46	32.74
비교예 4	11.89	22.11	42.74
비교예 5	13.54	24.01	33.52
Dexamethason	60.28	72.56	75.62

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예의 각각의 꽃 추출물이나, 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물과 비교해 볼 때, IL-1α 억제율이 더 높은 것으로 확인되었다.

시험예 7: 상처 치유 효과 확인

피부 상처 치유 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성 세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 cell culture dish에 세포를 배양한다. 6 well plate에 5 x 10⁵cells/well의 세포를 분주 후 상기 제조예, 실시예 및 비교예의 추출물 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 18시간 배양하였다. 세포 재생율을 아래 식에 의하여 산출하였고 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.

세포재생율(%)= 시료 세포재생율/ 대조군 세포재생율 x 100

그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.

시료명	처리농도 (㎍/㎖)	피부세포 재생율(%)
실시예 1	1000	62.14
실시예 2	1000	75.21
실시예 3	1000	74.69
실시예 4	1000	72.63
실시예 5	1000	94.84
실시예 6	1000	79.52
실시예 7	1000	78.12
실시예 8	1000	75.36
실시예 9	1000	80.36
실시예 10	1000	81.24
실시예 11	1000	74.55
실시예 12	1000	82.74
실시예 13	1000	80.69
실시예 14	1000	75.22
실시예 15	1000	79.35
실시예 16	1000	76.14
실시예 17	1000	78.34
제조예 1	1000	50.24
제조예 2	1000	45.63
제조예 3	1000	42.10
제조예 4	1000	44.89
제조예 5	1000	46.32
제조예 6	1000	48.19
제조예 7	1000	46.52
제조예 8	1000	47.63
제조예 9	1000	48.96
제조예 10	1000	43.62
제조예 11	1000	47.99
비교예 1	1000	30.87
비교예 2	1000	35.87
비교예 3	1000	34.96
비교예 4	1000	32.14
비교예 5	1000	37.69
덱사메타손	500	86.30

상기 표 9의 결과에서 확인되는 바와 같이, 용매 추출후 다시 공융 용매로 추출하고, 이를 효소반응시켜 제조되는 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예 1 내지 11의 각각의 꽃 추출물이나, 용매추출 후 효소반응시켜 제조되는 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물에 비하여 우수한 피부세포재생율을 나타내어 상처치유 효과가 우수함을 확인 할 수 있었다.

시험예 8: 주름개선 효과

세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과

HaCaT와 CCD-986Sk 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존률 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

제조예, 실시예 및 비교예의 꽃 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 COL1A1, TIMP-1 및 Tropoelastin의 발현과 MMP-1의 발현 억제를 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 10에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
COL1A1	Forward : AGCCAGCAGATCGAGAACAT
	Reverse : TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG
TIMP-1	Forward : TGCTGGGTGGTAACTCTTTATTTCA
	Reverse : ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG
Tropoelastin	Forward : AAAGCAGCAGCAAAGTTCGG
	Reverse : ACCTGGGACAACTGGAATCC
MMP-1	Forward : AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT
	Reverse : CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA

그 결과는 각각 도 3 내지 6에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 용매 추출후 다시 공융 용매로 추출하고, 이를 효소반응시켜 제조되는 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예 1 내지 11의 각각의 꽃 추출물이나, 용매추출 후 효소반응시켜 제조되는 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물에 비하여 collagen 및 TIMP-1의 발현이 증가하였고, MMP-1의 발현은 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 대조군인 아데노신(Adenosine)과 비교해도 우수한 결과를 확인할 수 있었다. 또한 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 피부 탄력을 나타내는 탄력 섬유 중심의 엘라스틴을 형성하고 있는 인자로 추출물은 5%에서 대조군 Adenosine 0.1%보다 우수한 결과를 확인할 수 있었다.

시험예 9: 엘라스타제 제어 활성시험

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스테이즈 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul 씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스테이즈의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스테이즈 활성 저해 효과를 측정할 수 있다.

엘라스틴을 포함하는 한천배지에 엘라스타제만을 적가하는 한편, 상기 제조예, 실시예 및 비교예의 꽃 추출물의 농도가 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5%되는 용액을 시료로 하여 엘라스타제와 함께 적가하여 배지 상에 나타나는 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 retinol crystal을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다.

Halo diameter (cm)	시료 농도(%)
	0.01	0.05	0.10	0.50
실시예 1	2.5	2.2	2.1	2.0
실시예 2	1.8	1.7	1.6	1.5
실시예 3	1.7	1.6	1.5	1.4
실시예 4	1.6	1.5	1.4	1.3
실시예 5	1.0	0.98	0.90	0.85
실시예 6	1.8	1.6	1.5	1.4
실시예 7	1.7	1.6	1.4	1.3
실시예 8	1.9	1.8	1.7	1.5
실시예 9	1.8	1.5	1.4	1.3
실시예 10	1.6	1.4	1.2	1.1
실시예 11	1.5	1.4	1.3	1.2
실시예 12	1.8	1.7	1.5	1.4
실시예 13	1.7	1.5	1.3	1.2
실시예 14	1.6	1.5	1.4	1.2
실시예 15	1.9	1.8	1.5	1.4
실시예 16	1.5	1.4	1.3	1.1
실시예 17	1.6	1.4	1.3	1.1
제조예 1	2.7	2.6	2.5	2.4
제조예 2	2.6	2.4	2.3	2.2
제조예 3	2.7	2.5	2.3	2.1
제조예 4	2.8	2.7	2.5	2.4
제조예 5	2.7	2.4	2.3	2.2
제조예 6	2.8	2.5	2.4	2.3
제조예 7	2.6	2.4	2.3	2.1
제조예 8	2.8	2.7	2.5	2.2
제조예 9	2.7	2.6	2.4	2.2
제조예 10	2.6	2.5	2.2	2.1
제조예 11	2.8	2.7	2.6	2.2
비교예 1	2.9	2.8	2.7	2.6
비교예 2	2.8	2.6	2.5	2.2
비교예 3	2.7	2.5	2.4	2.3
비교예 4	2.9	2.5	2.4	2.2
비교예 5	2.8	2.7	2.6	2.2
Elastase	1.8
Retinol crystal	0.9

상기 표 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예의 각각의 꽃 추출물이나, 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물과 비교해 볼 때, 엘라스타제 제어활성이 높았으며, 특히 실시예 5의 꽃 혼합추출물에서 가장 높은 제어활성을 나타내었다.

시험예 10: 콜라겐 생합성 촉진효과시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 제조예, 실시예 및 비교예의 꽃 추출물을 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래식에 따라 계산하였으며 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A x 100(%)

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 량

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 량

상기 시험결과 하기의 표 12와 같은 결과를 얻었다.

procollagen 발현율(%)	시료 농도(㎍/㎖)
	0	50	100	500	1000
실시예 1	2.78	32.44	42.77	69.14	128.94
실시예 2	2.78	42.12	52.16	78.65	137.81
실시예 3	2.78	45.63	55.47	81.14	141.25
실시예 4	2.78	40.36	51.39	746.41	135.10
실시예 5	2.78	60.87	80.47	110.67	170.36
실시예 6	2.78	41.63	51.01	77.14	136.87
실시예 7	2.78	47.11	57.95	84.36	145.63
실시예 8	2.78	40.36	51.39	76.41	135.10
실시예 9	2.78	39.25	49.11	74.87	133.58
실시예 10	2.78	41.87	50.99	76.85	135.14
실시예 11	2.78	46.30	56.74	83.11	144.74
실시예 12	2.78	42.87	52.96	77.95	136.25
실시예 13	2.78	38.52	48.10	73.02	132.14
실시예 14	2.78	41.85	52.03	78.10	137.10
실시예 15	2.78	40.36	51.98	77.39	136.74
실시예 16	2.78	42.14	52.74	77.14	135.98
실시예 17	2.78	45.36	55.17	82.96	143.17
제조예 1	2.78	28.12	39.25	62.30	112.12
제조예 2	2.78	27.52	38.52	60.25	110.63
제조예 3	2.78	29.36	40.74	64.10	114.85
제조예 4	2.78	26.78	37.87	58.36	109.63
제조예 5	2.78	28.14	39.10	63.74	112.96
제조예 6	2.78	25.63	36.11	57.64	108.77
제조예 7	2.78	28.77	37.20	58.10	110.01
제조예 8	2.78	24.63	35.74	56.47	107.52
제조예 9	2.78	28.75	39.85	59.87	113.85
제조예 10	2.78	27.11	37.85	59.10	109.84
제조예 11	2.78	29.84	41.93	65.99	115.01
비교예 1	2.78	18.52	29.82	49.63	100.63
비교예 2	2.78	22.69	33.86	54.97	105.36
비교예 3	2.78	23.11	34.71	55.80	106.87
비교예 4	2.78	24.10	35.74	56.10	105.99
비교예 5	2.78	21.30	32.74	53.10	104.98

상기 표 12에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꽃 혼합추출물은 제조예의 각각의 꽃 추출물이나, 비교예 1 내지 5의 꽃 혼합추출물과 비교해 볼 때, 높은 프로콜라겐 발현율을 나타내었으며, 특히 실시예 5의 꽃 혼합추출물에서 가장 높은 발현율을 나타내었다.

제형 실시예 1: 스킨로션의 제조

하기 표 13의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합추출물을 함유한 스킨로션 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	꽃 혼합추출물(실시예 5)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 13에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제형 실시예 2: 영양로션의 제조

하기 표 14의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합추출물을 함유한 하이드로좀 영양로션 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	꽃 혼합추출물(실시예 5)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 14에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서, 80~85 ℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80~85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

Claims (9)

1. A)건조된 개나리꽃, 유채꽃, 수선화, 서양민들레꽃, 양지꽃, 목련꽃, 모란, 매실나무꽃, 동백나무꽃, 세룰라타벚나무꽃 및 푸르메리아 루브라꽃을 각각 1:3:3:3:1:1:1:1:3:1:1의 중량비로 혼합하여 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하는 단계;
   B)상기 단계에서 제조된 추출물을 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융 용매와 물을 각각 0.5~2:10의 중량비율로 혼합한 용매로 다시 추출하는 단계;
   C)상기 B)단계에서 제조된 추출물에 β-글루코시다아제 효소를 가하여 효소반응시키는 단계; 및
   D)상기 효소반응 완료 후 여과하는 단계를 포함하는 꽃 혼합추출물의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 A)단계에서 추출은 30% 에탄올을 추출용매로 하여 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하는 것임을 특징으로 하는 꽃 혼합추출물의 제조방법.
4. 삭제
5. 제1항 또는 제3항의 제조방법에 의하여 제조되는 꽃 혼합추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유하는 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부진정용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부재생용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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