KR102017132B1 - 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 원재료로서, 실론시나몬나무껍질 및 구릿대를 각각 세척하여 준비하는 단계, (b) 상기 원재료를 혼합한 후 용매로 추출하여 혼합추출물을 제조하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 제조된 혼합추출물에 균주를 접종하여 저온에서 발효시키는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 발효된 혼합추출물에 효소를 첨가하여 효소 반응시키는 단계 및 (e) 상기 (d)단계에서 효소 반응이 완료된 혼합추출물을 여과 및 농축하는 단계를 포함하는 구성을 마련한다.
상기와 같은 제조방법에 의해 제조된 혼합발효추출물은 피부 안전성을 확보하면서도 피부개선활성이 증대될 수 있으며, 피부보습 또는 피부주름개선에 탁월한 효능이 있다.

Description

실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising a mixed fermentation extract of cinnamomum verum and angelica dahurica}

본 발명은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 실론시나몬나무껍질(Cinnamomum verum) 및 구릿대(Angelica dahurica) 혼합추출물에 백국균을 접종하여 저온발효 시킨 후, 이를 다시 효소 처리하여 얻은 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 이와 같은 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부 미용 면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부지질 중에서도 피부장벽기능을 담당하는 주된 지질은 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되면서 생성되는 지질로서, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes) 사이의 공간을 채우고 있어서 세포간의 결합력을 부여하는 역할도 하고 있는데, 이러한 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되어 있고 이들은 각각 지질층 지질 전체의 약 40~65%, 10% 및 25%를 차지한다. 또한 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재하는 조성을 가진다.

세라마이드는 스핑고신에 지방산이 연결되어 있는 구조를 가지고 있는 스핑고지질의 일종이다. 세라마이드는 피부각질층을 구성하는 각질세포간지질 중 약 40% 이상을 차지하며, 수분증발을 억제하는 방어벽 역할과 각질층의 정연한 구조를 유지하게 하는 기능을 가지고 있다. 피부 각질층은 각화된 세포가 벽돌모양의 다층구조로 구성되어 있으며 이러한 각화세포는 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리 지방산에 의해 견고히 결합되어 있어 피부 장벽기능 및 피부보습에 도움이 된다.

최근 노화의 원인으로 밝혀진 활성산소종은 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화현상을 촉진한다. 그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며, MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다. MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-acroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

발효는 미생물을 발효시키는 과정에서 발효 균을 제거하는 동시에 효소 외에 유효성분들을 함께 추출함으로써 기존 효소 하나만의 갖는 효능을 배가시키고 함유 성분들을 피부에 빠르게 흡수되도록 한다. 우유, 채소, 한방 성분 등 각 종 화장품의 원료들은 발효 과정을 거치면 영양소가 증가한다. 아미노산류, 비타민류, 각 종 기능성 물질이 생성되고 합성되는 과정에서 영양소의 파괴는 거의 일어나지 않으며 발효 산물들은 효모가 먹고 배설한 물질이므로 분자구조가 작아져 피부에 흡수가 용이다.

저온발효의 경우 발효속도는 느리지만 균에 가해지는 스트레스가 적고 부산물이 적게 생성되어 유해세균이 번식하기 어렵고 유효성분의 손실을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 백국균(Aspergillus kawachii) 누룩균의 한 종류로 탁주제조에 많이 사용되는 균이다. 백국균은 발효 중 다량의 유기산(pyruvic acid, malic acid, succinic acid)과 아미노산을 생성하며 인체에 무해한 균주이다.

본 발명자들은 발효추출물 중에서도 저온추출 및 혼합추출물을 삼나무통에서 저온 발효하여 피부 안전성이 확보된 새로운 천연 화장료를 개발하고자 하였으며, 상기 발효법을 활용하여 본 발명의 혼합추출물을 제조하는 경우 그 활성이 증대되어 우수한 피부보습 및 주름개선 효능을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0070610호 대한민국 공개특허 제10-2013-0120597호

본 발명은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 유효성분으로 포함한다.

상기 혼합발효추출물은 전체 중량%에 대하여, 0.001~10중량%로 포함될 수 있다.

상기 실론시나몬나무껍질 및 구릿대는 1~2:1~2의 중량비로 혼합될 수 있다.

상기 혼합발효추출물은 균주에 의해 발효될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부보습용 또는 피부주름 개선용일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 군으로부터 선택되는 제형일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 혼합발효추출물의 제조방법은 (a) 원재료로서, 실론시나몬나무껍질 및 구릿대를 각각 세척하여 준비하는 단계, (b) 상기 원재료를 각각 혼합한 후 용매로 추출하여 혼합추출물을 제조하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 제조된 혼합추출물에 균주를 접종하여 저온에서 발효시키는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 발효된 혼합추출물에 효소를 첨가하여 효소 반응시키는 단계 및 (e) 상기 (d)단계에서 효소 반응이 완료된 혼합추출물을 여과 및 농축하는 단계를 포함한다.

상기 (b)단계에서 실론시나몬나무껍질 및 구릿대는 1~2:1~2의 중량비로 혼합될 수 있다.

상기 (b)단계에서 용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린 및 이들의 혼합용매로부터 선택되는 적어도 1종일 수 있다.

상기 (b)단계에서 추출은 30~60℃의 온도로 2~5시간 동안 실시되되, 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출 및 중탕추출로부터 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 실시될 수 있다.

상기 (b)단계 이후에 120~130℃의 온도로 10~20분 동안 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 (c)단계에서 균주는 백국균일 수 있다.

상기 (c)단계에서 발효 반응은 15~25℃의 온도 하에서 3~4일 동안 실시될 수 있다.

상기 (d)단계에서 효소는 β글루코시다아제일 수 있다.

상기 (d)단계에서 효소 반응은 50~60℃의 온도 하에서 90~110rpm의 속도로 4~5시간 동안 실시될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 따르면, 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 유효성분으로 포함함으로써 피부보습 및 피부주름개선에 탁월한 효능이 있다.

또한, 본 발명의 혼합발효추출물의 제조방법에 따르면, 발효 및 효소 반응을 실시함으로써 반응과정 중 그 활성이 증대되어 피부 안전성은 확보하면서도 피부개선활성이 더욱 우수하다.

도 1은 본 발명의 혼합발효추출물의 제조방법을 설명하기 위한 공정도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 혼합발효추출물의 피부장벽 강화 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 혼합발효추출물의 보습 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4 내지 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 혼합발효추출물의 주름개선 효과를 나타내는 그래프이다.

이하에서 본 발명에 대하여 첨부된 도면에 도시된 실시 예에 따라 구체적으로 설명하기는 하나, 본 발명이 도시된 실시 예만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 및 그 밖에 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

이하, 본 발명의 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물의 제조방법을 도면에 따라 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 혼합발효추출물의 제조방법을 설명하기 위한 공정도이다.

도 1을 참조하면, 우선, 원재료로서, 실론시나몬나무껍질 및 구릿대를 각각 세척하여 준비한다(S10).

실론시나몬나무껍질 및 구릿대는 직접 재배하여 건조시킨 것을 사용하거나 인터넷, 국내 시장 또는 한약방에서 구입하여 흐르는 정제수에 수차례 세척한 후 용기에 삽입 가능한 크기로 각각 절단하였다.

상기에서는 일 예로 원재료를 절단하여 적용한 경우에 대해 기재하였으나 이에 한정되는 것은 아니고 하기 후술할 추출방법에 따라 분말, 슬러리 등 다양한 형태로 적절하게 변경하여 적용 가능하다.

그 후, 원재료를 각각 혼합한 후 용매로 추출하여 혼합추출물을 제조한다(S20).

상기 S10단계에서 준비된 실론시나몬나무껍질 및 구릿대를 1~2:1~2, 바람직하게는 1:2의 중량비로 각각 혼합한 다음 원재료의 총 중량에 대하여 1~80배 부피의 물(증류수), C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 증류수를 가한 후, 30~60℃, 바람직하게는 40~50℃의 온도로 2~5시간, 바람직하게는 3~4시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출 및 중탕추출로부터 선택되는 적어도 하나의 방법, 바람직하게는 중탕추출 방법으로 추출하여 혼합추출물을 제조할 수 있다.

이는 추출온도가 30℃ 미만이면, 원재료의 유효성분을 제대로 추출하기 어려울 수 있고, 60℃를 초과하면, 원재료의 유효성분이 파괴될 수 있다. 상기 추출 시간이 2시간 미만이면, 추출이 완료되기에는 시간이 부족할 수 있고, 5시간을 초과하면, 과도한 추출시간으로 인해 업무 지연이 초래될 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명은 일 예로 원재료를 혼합한 후 추출하였으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 각각의 원재료의 추출물을 제조한 후 혼합하여도 무방하다.

상기 혼합추출물 내에 존재하는 균이 사멸될 수 있도록 120~130℃의 온도로 10~20분 동안 멸균하는 단계를 추가로 실시한 후 하기 후술할 삼나무통에서 저온 발효시킬 수 있다. 상기 멸균 온도가 120℃미만이면, 미생물 등의 잡균의 생존으로 번식의 우려가 있고, 130℃를 초과하면, 안전성은 확보될 수 있으나 본 발명에서 필요로 하는 유효성분이 파괴될 수 있다. 상기 멸균 시간이 10분 미만이면, 멸균 효율이 떨어지고, 20분을 초과하면 필요이상의 멸균으로 추출물의 물성이 변할 수 있다.

그 다음 혼합추출물에 균주를 접종하여 저온에서 발효시킨다(S30).

혼합추출물을 삼나무통에 삽입 후 백국균을 1x10⁶CFU/ml 접종하여 균에 가해지는 스트레스가 적도록 15~25℃의 저온에서 3~4일간 천천히 발효시킨다. 이는 발효 온도가 15℃미만이면, 아미노산, 비타민 등 각종 기능성 물질이 생성되고 합성되기 어려울 수 있고, 25℃를 초과하면, 부산물의 생성이 증가되어 유해세균의 번식이 활발하여 기능성 물질이 손실될 수 있다. 발효 기간이 3일 미만이면, 효모에 의한 발효산물 생성이 저조할 수 있고, 4일을 초과하면, 필요 이상의 발효로 인해 유효성분 또는 기능성 물질이 손실될 수 있다.

따라서, 발효 균이 제거되면서 유효성분이 함께 추출되어 피부의 흡수가 용이하도록 15~25℃의 저온에서 3~4일간 천천히 발효시키는 것이 바람직하다.

그 후 효소를 첨가하여 효소 반응시킨다(S40).

상기 S30단계에서 발효가 완료된 혼합추출물에 β글루코시다아제 효소를 첨가한 후, 효소 반응에 의해 본 발명의 유효성분이 더욱 효율적으로 추출될 수 있도록 50~60℃, 바람직하게는 50~55℃의 온도 하에서 90~110rpm의 속도로 4~5시간 동안 교반 및 반응시킨다. 그리고, 90~100℃에서 30~90분 동안 가온하여 효소 반응을 정지시킨다. 상기 효소 반응의 온도가 50℃미만이면, 유효성분의 추출이 어려울 수 있고, 60℃를 초과하면, 추출물의 전분 또는 단백의 분해도가 낮아져 악영향을 미칠 수 있다.

마지막으로 여과 및 농축하여 혼합발효추출물을 제조한다(S50).

상기 S40단계에서 효소 반응이 완료된 혼합추출물을 적어도 1회, 바람직하게는 3회 여과하는 과정을 반복 실시하고, 감압농축기를 이용하여 농축한다. 상기 여과는 200~400메쉬의 체를 이용하여 1회 여과한 뒤 100~300mm 여과지로 1~3회 정도 추가로 여과를 더 실시한다. 여과를 1회만 실시하면 입자크기가 불균일하고 고형의 침전물이 발생될 가능성이 높아 화장료 조성물에 적용 시 품질 저하가 초래될 수 있다.

상술한 바와 같은 여과 및 감압 농축하는 단계가 완료되면, 본 발명의 혼합발효추출물(S60)이 수득된다. 상기 제조방법에 의해 제조된 혼합발효추출물은 저온 발효 및 효소 반응을 실시함으로써 그 상승작용에 의해 피부 안전성을 확보하면서도 피부개선활성을 증대시킬 수 있으며, 피부보습 또는 피부주름개선에 더욱 탁월한 효능이 있다.

이하, 상술한 바에 따라 제조된 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 포함하는 화장료 조성물의 성분 및 각 성분의 제한사유를 상세히 설명한다.

실론시나몬나무껍질(Cinnamomum verum)은 녹나무과 녹나무속의 상록수로 주산지는 스리랑카이고, 주로 나무 껍질을 말려서 향신료로 쓴다. 나무의 크기는 10~15 미터까지 자라며, 잎은 길쭉한 달걀 모양으로 7~18 센티미터이다. 꽃은 원추꽃차례이고, 녹색을 띠며, 독특한 향이 나며, 열매는 자주빛깔이고, 1센티미터이다. 배꼽에서 생식기나 항문까지의 내장 기관이 허약하고 찬 것에 효능이 있어서 설사, 구토, 소화불량, 월경불순, 팔다리가 나른한 증상에 좋다. 어린가지를 계지라고 하는데, 감기초기에 땀을 내어 열을 내리게 하고 목 언저리, 등, 팔다리가 쑤시는 증상에 좋다. 이 나무의 줄기껍질은 혈액순환을 도와주고 항균작용, 항염증 및 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

구릿대(ngelica dahurica)는 산형과에 속하는 여러해살이풀로 동북아시아 지역에 분포해 있으며 주로 산과 계곡의 가장자리에서 자란다. 높이는 1~1.5m 정도이고 살이 찐 뿌리줄기에는 수염뿌리가 많이 돋아 있으며, 잎은 여러 갈래로 갈라져나오며 타원형으로 길이는 5~10cm 정도이다. 6~8월에 흰색 꽃이 피며 타원형의 열매는 10월을 전후하여 결실한다. 한방에서 뿌리를 백지(白芷)라 하고 angelical, edultin, phellopterin등이 함유되어 있어 진정제·진통제·지혈제로 이용한다.

백국균은 누룩균의 한 종류로 누룩균은 곰팡이류의 사상균에 해당하는데, 황록색의 포자를 형성하는 황누룩균과 흑갈색의 포자를 형성하는 흑누룩균으로 나뉜다. 전분을 분해하여 포도당, 과당 등 단당류로 저분자하고 단백을 분해한다. 상기 누룩균이 생성한 단당류를 다른 균들이 먹이로 하여 활성화되도록 하는 역할을 수행한다. 백국균은 흑누룩균의 분생자가 검정색에서 흰색으로 변한 것을 의미한다.

이러한 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대가 1~2:1~2, 바람직하게는 1:2의 중량비로 혼합되어 추출된 혼합발효추출물로 화장료 조성물의 전체 중량%에 대하여, 0.001~10중량%, 바람직하게는 0.01~5중량%로 포함될 수 있으며, 이때, 혼합발효추출물은 액상 또는 감압 증류, 농축, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 또한, 혼합발효추출물은 균주, 바람직하게는 백국균으로 저온발효된 것일 수 있으며, β-글루코시다아제와 같은 효소로 효소 반응된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획한 분획물도 포함할 수 있다. 즉, 혼합발효추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 수득된 것뿐만 아니라 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 수득되는 것도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 혼합발효추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수득된 분획, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 수득된 분획도 본 발명의 혼합발효추출물에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 "유효성분으로 포함하는"이란 하기 후술할 혼합발효추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 천연식물재료인 실론시나몬나무껍질 및 구릿대로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용 및 독성이 없으므로 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 필수 성분으로 포함하는 것뿐만 아니라 화장품 제조 시에 첨가되는 피부학적으로 허용 가능한 부형제 성분을 포함하며, 이러한 부형제로는 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 혼합발효추출물 이외에 피부보습, 항균, 진정, 재생 및 주름개선 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 적어도 1종 이상 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1. 실론시나몬나무껍질추출물 제조

실론시나몬나무(Cinnamomum verum)껍질 100.0g에 10배 중량의 정제수(1kg)를 투입하고, 55℃에서 4시간 동안 중탕 추출한 다음 45℃에서 감압 농축하여 30g의 추출물을 수득하였다. 그리고, 추출물(30g)을 121℃에서 15분 동안 멸균시켜 삼나무통에 넣고, 백국균 1x10⁶ CUF/ml를 접종한 다음 20℃에서 발효시킨 후, 121℃에서 15분간 멸균하였다. 이후 β-글루코시다아제 효소 3g을 첨가하고, 55℃에서 100rpm의 속도로 4시간 동안 반응 시켰다. 그 다음 95℃로 1시간 동안 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 각각 여과하여 3g의 실론시나몬나무껍질발효추출물을 제조하였다.

제조예 2. 구릿대추출물 제조

실론시나몬나무(Cinnamomum verum)껍질 대신에 구릿대(Angelica dahurica)를 원재료로 적용한 것을 제외하고는 제조예 1의 제조방법과 동일한 방법으로 구릿대발효추출물을 제조하였다.

실시예 1 내지 3. 혼합추출물의 제조

하기 표 1에 개시된 각 성분의 중량비로 혼합한 원재료(100g)를 적용한 것을 제외하고는 제조예 1의 제조방법과 동일한 방법으로 혼합발효추출물을 제조하였다.

표 1은 실시예 1 내지 3의 혼합추출물의 원재료 각각의 성분을 중량비로 나타낸 표이다.

성분(중량비)	실시예 1	실시예 2	실시예 3
실론시나몬나무껍질	1	2	1
구릿대	1	1	2

비교예 1. 저온발효, 효소 공법 무 처리 혼합추출물 제조

상기 실시예 1과 동일한 중량비로 각 성분을 혼합한 원재료에 10배 중량의 정제수(1kg)를 투입하고, 55℃에서 4시간 동안 중탕 추출한 후, 45℃에서 감압 농축하여 혼합추출물을 제조하였다.

비교예 2. 효소 공법 무 처리 혼합물 제조

상기 실시예 2와 동일한 중량비로 각 성분을 혼합하고, 효소단계를 실시하지 않은 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 혼합추출물을 제조하였다.

비교예 3. 저온발효 공법 무 처리 혼합추출물 제조

상기 실시예 3과 동일한 중량비로 각 성분을 혼합하고, 발효단계를 실시하지 않은 점을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 혼합추출물을 제조하였다.

제제예 1. 스킨로션 제조

실시예 3의 혼합발효추출물을 함유한 스킨로션 1kg을 하기 표 2의 조성에 따라 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	혼합발효추출물(실시예 3)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 2를 참조하여 설명하면, 반응용기에 11번을 투입한 다음 2, 3, 4 및 8번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시켰다. 그리고, 5번을 60℃의 온도로 가열하여 용해시킨 다음 10번을 투입하여 용해시킨 후, 반응용기에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 및 9를 반응용기에 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제제예 2. 영양로션의 제조

실시예 3의 혼합발효추출물을 함유한 영양로션 1kg을 하기 표 3의 조성에 따라 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	혼합발효추출물(실시예 3)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 3을 참조하여 설명하면, 10, 11, 13, 16번을 80~85℃의 온도에서 혼합 및 교반하여 유화시켰다. 그리고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 12번을 80~85℃의 온도로 가열하여 용해 및 유화시켰다. 이들을 교반기를 이용하여 50℃까지 교반 및 냉각시킨 다음 15번을 투입하고, 45℃까지 냉각시켰다. 그 후, 14번을 투입하고 마지막으로 35℃에서 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

실험예 1. 세포 생존율 측정 시험

본 발명의 혼합추출물의 세포 독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

세포 배양

트랜스글루타미네이즈-1(transglutaminase-1, Tgase-1)은 각질형성세포가 각질 생성 또는 각질 분화시에 증가하는 대표적인 각질분화인자이다. 각질형성세포의 Tgase-1 발현량이 증가하면, 각질형성촉진에 따른 피부장벽이 강화되는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 혼합추출물의 효능을 확인하기 위해 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과는 각질형성세포 HaCaT Cell을 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과는 CCD-986Sk 세포를 사용하였다. 또한, 세포 내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과도 HaCaT와 CCD-986Sk 세포를 사용하였다.

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다

각각의 유전자 발현을 확인 하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO_2, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 하기 식 1로 세포 생존율을 계산한 후, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

세포 생존율(%)= 시료 첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 X 100 …식(1)

구분	세포 생존율(%)
	0.1 %	0.5 %	1 %	5.0 %
실시예 1	101	100	100	101
실시예 2	101	101	100	100
실시예 3	101	100	101	100
비교예 1	101	101	100	100
비교예 2	100	101	100	101
비교예 3	100	100	101	101
대조군Adenosine	100	100	101	101
구분	세포 생존율(%)
	0.001 %	0.005 %	0.01 %	0.05 %
대조군 Hyaluronic Acid	100	100	101	101

그 결과, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3뿐만 아니라 비교예 1 내지 3도 모두 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과

제조예 1, 2, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10 ㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 측정하였다. 도 2는 그 결과를 나타낸 도이다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
Tgase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

그 결과, 실시예 3이 제조예 1, 2 및 비교예 1 내지 3보다 Transglutaminase-1의 유전자 발현이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 피부보습 효과

Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과

제조예 1, 2, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 6에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 하였다. 도 3은 그 결과를 나타낸 도이다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
HAS-3	Forward : ACTGCCTTCAAGGCCCTTGG
	Reverse : AATGTTCCAGATGCGGCCAC

그 결과, 실시예 1 내지 3은 제조예 1, 2 및 비교예 1 내지 3에 비하여 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 주름개선 효과

세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과

HaCaT와 CCD-986Sk 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존률 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

제조예 1, 2, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 COL1A1, TIMP-1 및 Tropoelastin의 발현과 MMP-1의 발현 억제를 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 7에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다. 도 4 내지 도 7은 그 결과를 나타낸 도이다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
COL1A1	Forward : AGCCAGCAGATCGAGAACAT
	Reverse : TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG
TIMP-1	Forward : TGCTGGGTGGTAACTCTTTATTTCA
	Reverse : ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG
Tropoelastin	Forward : AAAGCAGCAGCAAAGTTCGG
	Reverse : ACCTGGGACAACTGGAATCC
MMP-1	Forward : AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT
	Reverse : CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA

그 결과, 실시예 3은 제조예 1, 2 및 비교예 1 내지 3에 비하여 collagne 및 TIMP-1의 발현이 증가하였고, MMP-1의 발현은 감소함을 확인할 수 있었다. 대조군인 아데노신(Adenosine)과 비교해도 실시예 3이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 피부 탄력을 나타내는 탄력 섬유 중심의 엘라스틴을 형성하고 있는 인자로 추출물 5%에서 대조군 Adenosine 0.1%보다 우수함을 알 수 있었다.

이상 본 발명자에 의하여 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.

<110> LYM, SEUNG HO SHIN, HYOUNG SEOK <120> Cosmetic composition comprising a mixed fermentation extract of cinnamomum <130> P18-0173 <150> KR 10-2018-0120814 <151> 2018-10-11 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(forward primer) <400> 1 ggcattgctc tcaatgacaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(reverse primer) <400> 2 tgtgagggag atgctcagtg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tgase-1(forward primer) <400> 3 tgatcgcatc acccttgagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tgase-1(reverse primer) <400> 4 gtagatctca ttgcgggggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-3(forward primer) <400> 5 actgccttca aggcccttgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-3(reverse primer) <400> 6 aatgttccag atgcggccac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1(forward primer) <400> 7 agccagcaga tcgagaacat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1(reverse primer) <400> 8 tcttgtcctt ggggttcttg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP-1(forward primer) <400> 9 tgctgggtgg taactcttta tttca 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP-1(reverse primer) <400> 10 atcctgttgt tgctgtggct gatag 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tropoelastin(forward primer) <400> 11 aaagcagcag caaagttcgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tropoelastin(reverse primer) <400> 12 acctgggaca actggaatcc 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1(forward primer) <400> 13 aaggttagct tactgtcaca cgctt 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1(reverse primer) <400> 14 cgactctaga aacacaagag caaga 25

Claims (15)

1. 실론시나몬나무껍질 및 구릿대의 혼합발효추출물을 포함하되,
   상기 혼합발효추출물은 실론시나몬나무껍질 및 구릿대가 1~2:1~2의 중량비로 혼합 추출된 추출물을 멸균한 후 백국균으로 발효한 것인 피부 보습 및 주름 개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 혼합발효추출물은 전체 중량%에 대하여, 0.001~10중량%로 포함되는 피부 보습 및 주름 개선용 화장료 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 군으로부터 선택되는 제형인 피부 보습 및 주름 개선용 화장료 조성물.
   
7. (a) 원재료로서, 실론시나몬나무껍질 및 구릿대를 각각 세척하여 준비하는 단계;
   (b) 상기 원재료를 각각 혼합한 후 용매로 추출하여 혼합추출물을 제조하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계에서 제조된 혼합추출물에 균주를 접종하여 15~25℃의 온도에서 3~4일 동안 발효시키는 단계;
   (d) 상기 (c)단계에서 발효된 혼합추출물에 효소를 첨가하여 효소 반응시키는 단계; 및
   (e) 상기 (d)단계에서 효소 반응이 완료된 혼합추출물을 여과 및 농축하는 단계를 포함하고,
   상기 (b)단계와 상기 (c)단계 사이에 120~130℃의 온도로 10~20분 동안 멸균하는 단계를 더 포함하는 혼합발효추출물의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 (b)단계에서 실론시나몬나무껍질 및 구릿대는 1~2:1~2의 중량비로 혼합되는 혼합발효추출물의 제조방법.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 (b)단계에서 용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린 및 이들의 혼합용매로부터 선택되는 적어도 1종인 혼합발효추출물의 제조방법.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 추출은 30~60℃의 온도로 2~5시간 동안 실시되되, 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출 및 중탕추출로부터 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 실시되는 혼합발효추출물의 제조방법.
    
11. 삭제
12. 제7항에 있어서,
    상기 (c)단계에서 균주는 백국균인 혼합발효추출물의 제조방법.
    
13. 삭제
14. 제7항에 있어서,
    상기 (d)단계에서 효소는 β글루코시다아제인 혼합발효추출물의 제조방법.
    
15. 제7항에 있어서,
    상기 (d)단계에서 효소 반응은 50~60℃의 온도 하에서 90~110rpm의 속도로 4~5시간 동안 실시되는 혼합발효추출물의 제조방법.

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