KR102661161B1 - 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 이의 용도 - Google Patents

세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 상기 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 참깨에 물을 첨가한 다음 pH를 2~6으로 맞춘 후, 밀폐된 용기에서 50~160℃의 온도 조건으로 10~200분 동안 중탕하는 단계를 포함하는 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물은 직접적으로 열을 가해 추출한 참깨 열수 추출물에 비해 미백 및 주름 개선 효과가 현저히 증진되는 효과가 있으므로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물은 피부 미백 및 주름 개선용 화장품 또는 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 이의 용도{Sesame bath extract with increased sesaminol content and use thereof}
본 발명은 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 상기 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
참깨(Sesamum indicum L.)는 참깨과 참깨속에 속하는 1년생 초본으로 열대에서 냉온대에 걸쳐 재배되는 세계적인 유료작물이다.
참깨의 영양학적 성분을 살펴보면 지질 51%, 단백질 20%, 당질 15% 정도를 함유하고 있으며, 쌀과 소맥에 비하여 칼슘, 인, 아연, 철, 비타민 B1, B2, 불포화지방산 등이 풍부한 식품이다. 이와 더불어, 참깨에는 항산화 효과를 나타내는 세사민(sesamin) 0.1~1.0%와 세사미놀(sesaminol)이 0.3~0.7% 함유되어 있다.
그 중 세사미놀은 참깨에 들어있는 지용성 리그난 성분으로 세사몰 성분의 전구체이다. 강력한 항산화 작용을 가지고 있어 체내와 식품 속에 지질이 산화되어 생성되는 과산화 지질의 생성과 동맥경화의 원인이 되는 나쁜 콜레스테롤인 LDL이 생성되는 것을 방지하며 숙취의 원인인 아세트알데하이드의 분해속도를 빠르게 하는 효과가 있다.
한편, 피부는 외부 자극으로부터 우리 몸을 보호해주는 인체 최전방의 방어 장기이며, 미적인 관점에서도 그 관심이 점점 높아지고 있다. 이에 따라 다양한 기능성 화장품에 대한 연구가 활발한데, 그 중에서도 주름 완화 및 미백 기능에 대한 다양한 기능성 화장품들이 출시되고 있다.
주름의 생성 원인으로는 여러 가지가 보고되고 있는데, 우선 피부가 과다한 자외선에 노출되면 피부 구성 성분인 콜라겐(collagen)의 분해가 촉진되어 피부가 탄력을 잃고 주름이 생성될 수 있다. 또한, 피부가 과도한 온도 변화 및 습도 저하나 바람 등에 의해 지나치게 건조해지면 외부에 대한 방어벽으로서의 피부 기능이 저하되어 주름이 생기기도 한다. 그리고, 피부가 활성 산소종이나 자유 라디칼에 노출되면 산화 작용에 의해 과산화 지질이 생성되고 그로 인해 콜라겐 등의 피부 구성 단백질이 변형되어 주름이 생성될 수 있다. 이러한 외부적 요인과 내부적 요인에 의한 주름 발생을 억제하고자 다양한 화장품 조성물이 연구되고 있는 실정이다.
또한, 피부에 자외선이 조사되면 피부 중 멜라노사이트(melanocyte)가 활성화되어 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP1(tyrosinase related protein 1) 및 TRP2(tyrosinase related protein 2)의 작용에 의해 멜라닌 생성이 촉진된다. 생성된 멜라닌은 피부에 침착되어 검버섯 또는 주근깨로 발전하는데, 이것을 방지하기 위하여 다양한 조성물이 함유된 미백 화장품이 사용되고 있다.
자외선은 피지, 세포막 등의 산화를 촉진하여 각종 피부장애를 일으키는 것으로 밝혀지고 있으며, 특히 최근 오존층 파괴에 따른 자외선의 증가로 보다 효과적인 피부 산화 방지책이 요구되는 실정이다.
종래 알려진 미백 효과를 나타내는 성분은 아스코르브산, 인산 에스테르염, 하이드로퀴논 유도체, 태반 추출물, 코지산, 엘라그산 등이 있으며, 이들 성분을 배합한 화장품 조성물이 일반적이다. 최근에는 식물에 함유된 폴리페놀 등에 높은 미백 효과가 있는 것으로 보고되어 있으며, 이를 사용하는 화장품 조성물이 제안되고 있다. 또한, 플라바논류(flavanones) 및 하이드록시플라본류(hydroxyflavones)의 미백 효과에 대해서도 이미 개시되어 있다. 그러나, 이들 미백 성분은 그 효과가 다소 미비하고 보존시 문제점이 있으며, 미백 효과 이외에 주름 완화 효과 및 노화 방지 효과를 충분히 발휘하지 못하는 실정이다. 특히 화학 성분이 함유된 기능성 화장품의 경우 피부 자극을 유발하여 민감성 피부에 적합하지 않은 문제점이 있는바, 피부에 자극이 적고 친환경적인 천연 식물 유래의 기능성 화장품에 대한 관심이 집중되고 있다.
한편, 한국등록특허 제0239206호에는 참깨유와 참깨박으로부터 세사미놀 성분을 분리 및 정제하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0064848호에는 백수오 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2021-0044952호에는 대추씨 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 상기 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물에 관해 전혀 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 참깨에 물을 첨가한 다음 pH를 2~6으로 맞춘 후, 밀폐된 용기에서 50~160℃의 온도 조건으로 10~200분 동안 중탕하는 단계를 포함하는 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물의 제조방법을 제공하고, 상기 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물의 미백 및 주름 개선 효과가 직접적인 열을 가해 추출한 참깨 열수 추출물에 비해 현저히 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
1) 세척된 참깨에 물을 첨가한 후, pH를 2~6으로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 50~160℃의 온도 조건으로 10~200분 동안 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함하는 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 및 상기 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 참깨에 물을 첨가한 다음 pH를 2~6으로 맞춘 후, 밀폐된 용기에서 50~160℃의 온도 조건으로 10~200분 동안 중탕하는 단계;를 포함하는 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물은 직접적으로 열을 가해 추출한 참깨 열수 추출물에 비해 미백 및 주름 개선 효과가 현저히 증진되었다.
도 1은 본 발명의 참깨 중탕 추출물을 제조하는 과정을 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 참깨 중탕 추출물로부터 생성된 화합물의 분리 과정 흐름도이다.
도 3은 참깨 열수 추출물(A), 참깨 중탕 추출물(B) 및 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 단일물질(C)의 HPLC(high-performance liquid chromatography) 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 참깨 중탕 추출물의 미백 효과를 효소 유래 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성(A), 세포에서의 티로시나아제 저해 활성(B) 및 세포에서의 멜라닌 함량 분석(C)으로 확인한 결과이다. α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone)는 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성 유도 물질이다. 도면 내 서로 다른 문자 a~d는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 5는 본 발명의 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 세사미놀(SHP-1)의 미백 효과를 효소 유래 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성(A), 세포에서의 티로시나아제 저해 활성(B) 및 세포에서의 멜라닌 함량 분석(C)으로 확인한 결과이다. α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone)는 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성 유도 물질이다. STG는 참깨의 주요 성분인 (+)-sesaminol triglucoside이고, 비타민 C 및 알부틴(Arbutin)은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 6은 본 발명의 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 세사미놀(SHP-1)의 미백 효과를 TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2), 티로시나아제(tyrosinase) 및 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 단백질 발현 변화로 확인한 결과이다. (A)는 단백질 발현 양상을 확인한 필름 사진이고, (B)는 이를 정량한 결과이다. α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone)는 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성 유도 물질이고, 알부틴(Arbutin)은 양성 대조군으로 사용되었다. 도면 내 *, **은 양성 대조군 대비 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 7은 본 발명의 참깨 중탕 추출물의 주름 개선 효과를 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 함량 변화(A) 및 프로콜라겐(procollagen) 합성 정도(B)로 확인한 결과이다. UVB를 조사하여 MMP-1의 발현을 촉진하고, 프로콜라겐 합성을 저해하였다. 도면 내 서로 다른 문자 a~d는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 8은 본 발명의 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 세사미놀의 주름 개선 효과를 콜라게나아제 저해 활성(A), MMP-1 함량 변화(B) 및 프로콜라겐 합성 정도(C)로 확인한 결과이다. UVB를 조사하여 MMP-1의 발현을 촉진하고, 프로콜라겐 합성을 저해하였다. STG는 참깨의 주요 성분인 (+)-sesaminol triglucoside이고, EGCG(Epigallocatechin gallate)는 양성 대조군으로 사용되었다.
도 9는 본 발명의 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 세사미놀의 주름 개선 효과를 MMP-1 및 프로콜라겐 단백질 발현 변화로 확인한 결과이다. (A)는 단백질 발현 양상을 확인한 필름 사진이고, (B)는 이를 정량한 결과이다. UVB를 조사하여 MMP-1의 발현을 촉진하고, 프로콜라겐 합성을 저해하였다. STG는 참깨의 주요 성분인 (+)-sesaminol triglucoside이고, EGCG(Epigallocatechin gallate)는 양성 대조군으로 사용되었다. 도면 내 *, **은 양성 대조군 대비 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 10은 참깨 열수 추출물, 참깨 중탕 추출물 및 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 세사미놀의 세포 독성을 B16F10 세포(A, C) 및 CCD-986sk(B, D) 세포에서 확인한 결과이다. STG는 참깨의 주요 성분인 (+)-sesaminol triglucoside이고, EGCG는 양성 대조군으로 사용된 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate) 이다.
도 11은 SHP-1의 함량을 현저히 증가시키는 참깨 중탕 추출물의 최적 제조방법을 반응 시간(A), 참깨 비율(B), 반응 온도(C) 및 pH(D)로 나눠 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 세척된 참깨에 물을 첨가한 후, pH를 2~6으로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 50~160℃의 온도 조건으로 10~200분 동안 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함하는 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 제조방법은 구체적으로
1) 세척된 참깨 10g에 대하여 0.5~2L의 물을 첨가한 후, pH를 3.5~5.5로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 밀폐된 용기 내에서 100~150℃의 온도 조건으로 60~150분 동안 증기로 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함할 수 있고,
더 구체적으로
1) 세척된 참깨 10g에 대하여 0.8~1.2L의 물을 첨가한 후, pH를 3.5~5로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 밀폐된 용기 내에서 110~130℃의 온도 조건으로 110~130분 동안 증기로 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함할 수 있으며,
더욱더 구체적으로는
1) 세척된 참깨 10g에 대하여 1L의 물을 첨가한 후, pH를 4~5로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 밀폐된 용기 내에서 121℃의 온도 조건으로 120분 동안 증기로 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함할 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 제공한다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물은 직접적으로 열을 가해 추출한 참깨 열수 추출물 대비 세사미놀 함량이 현저히 증진되는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 상기 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 또는 주름 개선용 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부 미백 피부 미백 또는 주름 개선용 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 히드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부 미백 또는 주름 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 제형으로 제조할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 피부 미백 또는 주름 개선용 건강기능성 식품은 이너뷰티(inner beauty) 식품 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티(inner beauty) 식품은 '먹는 화장품 또는 뷰티 식품'으로 일컬어지는 식품으로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너뷰티 식품을 선택하여 섭취할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 참깨 중탕 추출물을 포함하는 화장품과 상기 추출물을 포함하는 이너뷰티 식품을 혼용할 경우, 화장품만 사용하는 것에 비해 티로시나아제 활성 및 멜라닌 합성을 저해하고, 콜라게나아제 활성 및 MMP-1 생성을 억제하는 효과가 월등히 높아져 더욱 효과적으로 피부 미백 및 주름 개선 효과를 볼 수 있는 장점을 가진다.
또한, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 상기 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배,포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다.
본 발명의 참깨 중탕 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양의로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위의 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 저해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 참깨 중탕 추출물의 제조
본 발명에 사용된 참깨(Sesamum indicum L.)는 2017년 10월 경상북도 예천군에서 수확 후 건조된 것을 사용하였다.
도 1에 개시된 바와 같이 세척된 참깨 250g에 대하여 25L의 물을 첨가한 후, pH를 4~5로 조정한 다음 밀폐된 용기 내에서 121℃의 온도 조건으로 120분 동안 증기를 쐬어 중탕하였다. 이 후, 5겹의 거즈를 이용하여 여과한 다음 여액을 획득함으로써, 참깨 중탕 추출물을 제조하였다. 상기 참깨 중탕 추출물은 저온감압 농축기를 이용하여 건조한 후, 실험의 시료로 사용하였다.
한편, 세척된 참깨 250g에 대하여 25L의 물을 첨가한 후 직접적으로 열을 가하여 70℃에서 90분 동안 열수 추출하여 참깨 열수 추출물을 제조하였고, 이를 실험의 비교예로 사용하였다.
실시예 1. 참깨 중탕 추출물로부터 신규 생성된 화합물의 분리 및 동정
1) 참깨 중탕 추출물로부터 신규 생성된 화합물의 분리
상기 제조예 1에서 제조한 참깨 중탕 추출물 및 참깨 열수 추출물의 성분 변화를 확인하기 위해, HPLC를 수행하였다. HPLC 분석 조건은 하기 표 1에 개시된 바와 같다. 이동상 용매 A로 0.1%(v/v) 포름산(formic acid, HCOOH)을 사용하였고, 용매 B로는 아세토니트릴(acetonitrile, MeCN)을 사용하였으며, 구배 용리(gradient elution)를 100% 용매 A로 분석을 시작하여 최종 100% 용매 B로 30분 동안, 이동상의 유속 1.0mL/min을 유지하며 280nm에서 화합물을 검출하였다.
매개변수 조건
기기 Shimadzu LC20AD
검출기 Shimadzu SPD-M20A photodiode-array detector(PDA)
파장 280nm
컬럼 YMC-Pack ODS A-302 컬럼(4.6mm i.d.x150mm)
오븐 온도 40℃
유속 1.0mL/min
주입 부피 5㎕
이동상 시간(분) 용매 A: 0.1% HCOOH 용매 B: MeCN
0 100 0
10 80 20
15 50 50
20 30 70
25 0 100
30 0 100-종료
그 결과, 도 3A 및 3B에 개시된 바와 같이 참깨 중탕 추출물에서 참깨 열수 추출물에서는 검출되지 않았던 성분이 검출된 것을 확인하였고, 이를 도 2의 화합물 분리 과정 흐름도에 개시된 바와 같이 순차적으로 분획한 결과, 3C에 개시된 바와 같이 참깨 중탕 추출물에서 신규 생성된 화합물을 분리할 수 있었다.
구체적으로, 상기 제조예 1에서 제조한 참깨 중탕 추출물 100g에 10%(v/v) MeOH를 2L 첨가하여 희석한 후, n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH을 이용하여 순차 분획하였고, 각 분획물을 저온 감압 농축하여 건조시켜 n-hexane 분획물(871.6 mg), EtOAc 분획물(36.4g), n-BuOH(42.6g) 및 물 분획물(19.8g)을 획득하였다.
HPLC 분석을 통해 상기 획득된 분획물 내 화합물을 확인한 결과, 참깨 중탕 추출물에서 생성된 화합물은 EtOAc 분획물에 모두 포함되어 있음을 확인하였고, EtOAc 분획물에 대하여 Toyopearl HW-40(2.5cm i.d.×42cm) 및 ODS AQ 120-50S(1.0cm, i.d.×45cm)를 충진제로 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 70%(v/v) MeOH 용출액으로부터 SHP-1(158.2 mg, t R 21.6min)을 수득하였다. 분리된 단일물질은 NMR 및 ESIMS 스펙트럼을 측정하여 화합물의 구조를 결정하였다.
2) 참깨 중탕 추출물로부터 신규 생성된 화합물의 동정
상기 참깨 중탕 추출물로부터 신규 생성된 화합물 SHP-1은 흰색의 무결정형 분말상 형태로 수득하였고, [α]D+736(c 0.1, MeOH)으로 측정되었다. HRESIMS 스펙트럼 측정결과 m/z 393.0943[M+Na]+의 base 피크를 확인하여 화합물의 분자량을 확인하였다. 1H NMR 스펙트럼 측정 결과 1,2,4,5-tetrasubstituted된 방향족 프로톤 시그널이 δ H 6.80(1H, s, H-6') 및 6.39(1H, s, H-3')로 측정되었고 ABX-type의 방향족 시그널이 δ H 6.89(1H, d, J=1.8Hz, H-2''), 6.86(1H, dd, J=7.8, 1.8Hz, H-6'') 및 6.79(1H, d, J=7.8Hz, H-5'')에서 측정되었다. 두 개의 methylenedioxy에 해당하는 프로톤 시그널이 δ H 5.94(2H, s, H-7'') 및 5.84(2H, s, H-7')에서 측정되었다. 또한 퍼퓨란(furfuran) 골격에 해당하는 시그널이 각 δ H 5.02(1H, d, J=4.8Hz, H-2), 4.70(1H, d, J=4.8Hz, H-6), 4.25(1H, dd, J=9.0, 7.2Hz, H-4), 4.28(1H, dd, J=9.0, 6.6Hz, H-8), 4.04(1H, dd, J=9.0, 3.6Hz, H-8), 3.88(1H, dd, J=9.0, 3.6Hz, H-4), 3.05(1H, m, H-5) 및 3.03(1H, m, H-1)에서 측정되었다. 13C NMR 및 HSQC 스펙트럼 해석에서도 세사몰(sesamol) 및 퍼퓨란(furfuran) 시그널이 관찰되었다. 2D NMR 스펙트럼 해석으로 SOP-1은 (+)-세사미놀(sesaminol)로 구조를 동정하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 참깨 중탕 추출물의 제조방법은 참깨의 주요 성분인 (+)-sesaminol triglucoside을 가수분해하여 아글리콘(aglycone)인 (+)-세사미놀을 생성시킨다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 참깨 중탕 추출물의 미백 효과
1) 효소 유래 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성 평가
본 발명의 제조예 1에서 제조된 참깨 중탕 추출물과 열을 직접 가해 추출한 참깨 열수 추출물의 미백활성과 관련된 티로시아나제(tyrosinase) 저해 활성을 평가하였다.
구체적으로, 67mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH 6.8) 50㎕, 10mM L-DOPA 80㎕ 및 제조예 1의 시료 40㎕의 혼합액에 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase, 110U/mL) 80㎕를 첨가한 다음 25℃에서 2분 동안 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA 크롬(chrome)을 475nm에서 측정하였다. 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성은 하기 식 1에 개시된 바와 같이 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타냈다.
[식 1]
티로시나아제 저해 활성(%)=(1-시료첨가군 흡광도/무첨가구 흡광도)×100
그 결과, 도 4A에 개시된 바와 같이 참깨 열수 추출물에 비해 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물의 티로시나아제 저해 활성이 현저하게 증진되는 것을 확인하였다.
2) 세포에서의 티로시나아제 저해 활성 및 멜라닌 함량 분석
참깨 열수 추출물 및 참깨 중탕 추출물의 미백 효과를 B16F10 멜라노마 세포를 이용하여 세포에서의 티로시나아제 저해 활성 및 멜라닌 함량을 분석함으로써 확인하였다.
구체적으로, B16F10(melanoma cell) 세포를 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, 100U/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbeco's modified eagle’medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에 적응시키며 계대 배양하였다. 안정화된 B16F10 세포를 12웰 플레이트에 웰당 1×105개의 세포를 접종한 후, 각 웰에 제조예 1의 시료 또는 양성 대조군을 1시간 동안 전처리한 다음 α-MSH(10nM/mL)를 처리하였고, 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 1%(w/v) 트리톤 X-100(triton X-100)을 함유한 10mM 인산 완충액(phosphate buffer, pH 6.8)을 250㎕ 가하고 5분 동안 교반한 후, 세포와 용액을 모두 e-tube로 이전시키고 10,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 획득한 다음, 획득한 상측액을 티로시나아제 활성 분석에 사용하고, 세포 펠렛(cell pellet)은 멜라닌 함량 분석에 사용하였다.
상기 원심분리 후 획득한 상층액 40㎕를 96웰 플레이트에 분주하고, 0.1M 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)에 녹인 2mg/mL L-DOPA 200㎕를 가한 다음 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 티로시나아제에 의해 생성된 DOPA 크롬은 475nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
세포 펠렛(cell pellet)은 1N NaOH 100㎕와 증류수 200㎕를 가하고 60℃에서 1시간 동안 방치하여 멜라닌(melanin)을 완전히 녹인 후, 96웰 플레이트에 200㎕를 옮긴 후 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 멜라닌 표준품으로 얻은 표준검량선을 이용하여 각 웰에 생성된 멜라닌 양을 산출하였다.
그 결과, 도 4B에 개시된 바와 같이 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물은 참깨 열수 추출물에 비해 세포의 티로시나아제 활성을 억제하는 효과가 우수하였고, 도 4C에 개시된 바와 같이 멜라닌 함량을 억제하는 효과 또한 현저히 우수하였다.
실시예 3. 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 미백 효과
1) 효소 유래 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성 평가
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1의 효소 유래 티로시나아제 저해 활성을 평가하였다. 양성 대조군으로는 비타민 C를 사용하였고, 비교군으로 참깨의 주요 성분인 STG[(+)-sesaminol triglucoside]를 사용하였다.
그 결과, 도 5A에 개시된 바와 같이 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1의 티로시나아제 저해 활성이 참깨 주요 성분인 STG 보다 현저히 우수한 것을 확인하였다.
2) 세포에서의 티로시나아제 저해 활성 및 멜라닌 함량 분석
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1의 세포에서의 티로시나아제 저해 활성 및 멜라닌 함량을 분석하였다. 양성 대조군으로는 알부틴(arbutin, 100㎍/mL)을 사용하였다.
그 결과, 도 5B에 개시된 바와 같이 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1의 세포의 티로시나아제 저해 활성이 참깨 주요 성분인 STG 보다 현저히 우수하였다.
또한, 도 5C에 개시된 바와 같이 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1의 멜라닌 함량이 참깨 주요 성분인 STG와 비교하여 감소한 것을 확인하였다.
3) 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 미백 관련 단백질 발현량 측정
미백 관련 인자인 MITF, TRP1, TRP2 및 티로시나아제 단백질 발현정도를 보기 위해, B16F10 세포를 2×104 cells/mL로 희석한 후, 100mm 배양 접시(culture dish)에 분주하고, 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 그 후, 배지를 제거하고, 제조예 1의 시료를 또는 양성 대조군을 1시간 동안 전처리한 다음 α-MSH(10nM/mL)를 처리하였고, 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거한 다음 PBS로 2번 세척하였고, 용해 버퍼(Lysis buffer) 100㎕를 첨가하여 용해한 다음 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 상층액의 단백질량은 브래드포드 분석법(Bradford assay)으로 정량하였고, 실험 시료별 동량의 단백질을 10%의 SDS-폴리아크릴아마이드(polyacryamide)에 로딩한 후, 전기 영동하여 단백질을 크기별로 분리하였다. 분리된 단백질은 전달 장치를 이용하여 PVDF 멤브레인(membrane)으로 옮긴 다음 실온에서 1시간 동안 블로킹 버퍼[blocking buffer, 5%(w/v) skim milk]에서 반응시켰다. 반응 후, TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척한 다음, MITF(Santacruz, 1:1000), TRP-1(Santacruz, 1:1000), TRP-2(Santacruz, 1:1000), 티로시나아제(Santacruz, 1:1000), β-액틴(Santacruz, 1:1000) 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후, 다시 TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척하고, 마우스 항-토끼 IgG HRP 또는 보바인 항-염소(bovine anti-goat) IgG HRP의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척한 다음 암실에서 ECL(Amersham Pharmacia, England) 용액으로 반응시키고, LAS4000 화학발광 검출기(LAS4000 chemiluminescence detection system, Fuji, Tokyo, Japan)를 이용하여 밴드를 확인한 후, 밀도(density)를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 α-MSH 처리에 의해 증가된 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제 및 MITF 단백질 발현이 SHP-1 처리에 의해 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 참깨 중탕 추출물의 주름 개선 효과
1) 참깨 중탕 추출물의 세포 내 MMP-1 저해 효과 측정
참깨 중탕 추출물의 주름 개선 효과는 CCD-986sk 세포(Human skin fibroblast cells)를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, CCD-986sk 세포는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, 100U/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbeco's modified eagle’medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에 적응시키며 계대 배양하였다. 안정화된 CCD-986sk 세포를 12웰 플레이트에 각 웰당 1×105개로 분주한 다음 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 무혈청 배양액을 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 20mJ/㎠의 자외선(UVB)을 전처리한 후, 제조예 1의 시료를 다양한 농도로 첨가한 다음, CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액을 수집하여 MMP-1 단백질 함량 측정에 사용하였다. MMP-1 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)의 MMP-1 표준 용액은 6.25-100ng/mL로 1/2 희석하였고, 표준 용액 100㎕와 시료 100㎕를 MMP-1 ELISA 키트의 마이크로 플레이트에 분주하고, 100㎕의 HRP 결합체(horseradish peroxidase conjugate)를 첨가한 후 2시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 후, 완충용액으로 각 웰을 5회 반복 세척하여 비결합 항원을 제거한 후, 100㎕의 크로모제닉 테트라메틸 벤지다인(chromogenic tetramethyl benzidine)을 넣어 30분 동안 반응시켰다. 그 후 100㎕의 정지 시약을 넣고 15분 후에 450nm에서 ELISA 플레이트 리더기(Tecan Austria GmBH)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7A에 개시된 바와 같이 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물은 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 농도의존적으로 저해하였고, 참깨 열수 추출물 대비 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물의 MMP-1 발현 저해 효과가 우수하였다.
3) 참깨 중탕 추출물의 세포 내 제1형 프로콜라겐 합성 측정
자외선이 조사된 CCD-986sk 세포에서 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물의 제1형 프로폴라겐 합성능을 측정하였다. 24웰 플레이트에 각 웰당 5×104개의 세포를 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척한 다음 무혈청 배양액을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 20mJ/㎠의 자외선(UVB)을 전처리하였고, 제조예 1의 시료를 첨가하여 48시간 동안 배양한 후, 배양액을 수집하여 제1형 프로콜라겐 합성량 측정에 사용하였다. 세포 배양액 내의 프로콜라겐 합성 정도는 제1형 프로콜라겐 C-펩타이드 어세이 키트(Takara Bio Inc., Japan)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 7B에 개시된 바와 같이 자외선 조사에 의해 감소된 제1형 프로콜라겐 합성량은 본 발명의 참깨 중탕 추출물 처리에 의해 현저히 증가하였고, 이는 참깨 열수 추출물과 비교하여서도 우수한 결과임을 확인하였다.
실시예 5. 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 주름 개선 효과
1) 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 콜라게나아제 저해 활성 평가
참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 콜라게나아제 저해 활성을 콜라게나아제 생합성량을 측정하여 평가하였다. 콜라게나아제 생합성량 측정하기 위해, 12웰 플레이트에 각 웰당 1×105개의 CCD-986sk 세포를 분주한 다음 각 웰에 실험의 시료 또는 양성 대조군(EGCG)을 첨가한 후, CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후 트립신을 처리한 다음 100mM Tris HCl(0.5mM MgCl2, 0.1% Triton X-100) 버퍼로 용해한 후, 상등액 50㎕를 96웰 플레이트에 넣고, 37℃에서 16시간 동안 반응한 후 건조기(dry oven)에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 증류수 200㎕를 이용하여 3번 세척하였고 0.1% 시리우스 레드 F3BA(Sirius Red F3BA)를 포함하는 포화 피코산(saturated picoric acid) 용액을 제조한 후, 각 웰에 100㎕씩 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 10mM HCl 용액을 각 웰에 200㎕씩 넣어 5회 세척하였다. 각 웰에 0.1N NaOH 200㎕를 넣고 5분 동안 반응시킨 후, 새로운 플레이트에 옮긴 다음 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8A에 개시된 바와 같이 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1는 콜라게나아제 저해 활성이 우수한 것을 확인하였고, 참깨 주요 성분인 STG와 비교하여도 콜라게나아제 저해 활성이 현저하다는 것을 확인하였다.
2) 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 세포 내 MMP-1 저해 효과 측정
상기 실시예 4에 개시된 방법과 동일한 방법으로 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 세포 내 MMP-1 저해 효과를 측정하였다.
그 결과, 도 8B에 개시된 바와 같이 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1 함량은 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였고, 참깨 주요 성분인 STG는 SHP-1에 비해 MMP-1 함량 감소효과가 적었다.
3) 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 세포 내 제1형 프로콜라겐 합성 측정
상기 실시예 4에 개시된 방법과 동일한 방법으로 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 세포 내 제1형 프로콜라겐 합성량을 측정하였다.
그 결과, 도 8C에 개시된 바와 같이 자외선 조사에 의해 감소된 제1형 프로콜라겐 합성량은 참깨 중탕 추출물로부터 분리한 화합물인 SHP-1 처리에 의해 증가하였고, 이는 참깨 주요 성분인 STG의 제1형 프로콜라겐 합성능에 비해 현저하게 우수한 결과였다.
4) 참깨 중탕 추출물로부터 분리된 화합물의 주름 개선 관련 단백질 발현량 측정
주름 개선 관련 인자인 MMP-1 및 프로콜라겐의 단백질 발현 정도를 확인하기 위해, 100mm 배양 접시에 2×104개/mL로 희석된 CCD-986sk 세포를 분주한 다음 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 무혈청 배양액을 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, 20mJ/㎠의 자외선(UVB)을 전처리하였고, 전처리 후, 실험의 시료를 첨가한 다음, CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거한 다음 PBS로 2번 세척하였다. 그 후, 용해 버퍼(Lysis buffer) 100㎕를 첨가하여 용해한 다음 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 상층액의 단백질량은 브래드포드 분석법(Bradford assay)으로 정량하였고, 실험 시료별 동량의 단백질을 10%의 SDS-폴리아크릴아마이드(polyacryamide)에 로딩한 후, 전기영동으로 단백질을 크기별로 분리하였다. 분리된 단백질은 전달 장치를 이용하여 PVDF 멤브레인(membrane)으로 옮긴 다음 실온에서 1시간 동안 블로킹 버퍼[blocking buffer, 5%(w/v) skim milk]에서 반응시켰다. 반응 후, TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척한 다음 MMP-1 및 프로콜라겐 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후, 다시 TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척하고, 1차 항체에 대응하는 2차 항체를 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척한 다음 암실에서 ECL(Amersham Pharmacia, England) 용액으로 반응시키고, LAS4000 화학발광 검출기(LAS4000 chemiluminescence detection system, Fuji, Tokyo, Japan)를 이용하여 밴드를 확인한 후, 밀도(density)를 측정하였다.
그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 단백질 발현량은 SHP-1 처리에 의해 감소하였고, 자외선 조사에 의해 감소된 프로콜라겐 단백질 발현량은 SHP-1 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 참깨 중탕 추출물 및 이로부터 분리한 화합물의 세포 독성 평가
MTT 분석을 통해 세포 독성을 확인하였다. MTT 분석은 탈수소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움(tetrazolium)을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포르마잔[formazan, (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide]으로 환원시키는 미트콘드리아의 능력을 이용한 검사법으로, MTT 포르마잔의 농도를 540nm에서 ELISA 플레이트 리더기(Tecan Austria GmBH, Grodig, Austria)를 이용하여 측정하였다.
B16F10 또는 CCD-986sk를 96웰 플레이트에 각 웰당 5×104개가 되도록 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02mL를 첨가하여 4시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 각 웰당 DMSO 0.15mL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 리더기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료 용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이 본 발명의 참깨 중탕 추출물, 참깨 열수 추출물, STG, SHP-1 및 EGCG는 미백 및 주름 개선 효과를 나타내는 농도에서 세포 독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다.
실시예 7. 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물 제조방법 최적 조건 확립
상기 실시예를 통해 본 발명의 제조방법으로 제조된 참깨 중탕 추출물의 참깨 열수 추출물 대비 증가된 미백 및 주름 개선 효과는 중탕 추출과정에서 생성된 SHP-1에 의한 것으로 판단되어, SHP-1의 함량을 현저히 증가시키는 최적 제조방법을 확인하고자 하였다.
최적 조건의 확인을 위해, 도 11에 개시된 바와 같이 반응 시간, 참깨 중탕 비율, 반응 온도 및 pH를 조절하여 SHP-1의 함량을 확인하였다.
그 결과, 참깨 1g에 대하여 100mL의 물을 첨가한 후, pH를 4~5로 조정한 다음 밀폐된 용기 내에서 121℃의 온도 조건으로 120분 동안 증기로 중탕한 경우, SHP-1의 함량이 가장 증가하는 것을 확인하였다.

Claims (7)

1) 세척된 참깨에 물을 첨가한 후, pH를 2~6으로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 50~160℃의 온도 조건으로 10~200분 동안 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함하는 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
1) 세척된 참깨 10g에 대하여 0.5~2L의 물을 첨가한 후, pH를 3.5~5.5로 조정하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 밀폐된 용기 내에서 100~150℃의 온도 조건으로 60~150분 동안 증기로 중탕하는 단계; 및
3) 상기 단계 2) 이후에, 여과하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 제조방법으로 제조된 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물.
제3항의 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
제3항의 세사미놀 함량이 증진된 참깨 중탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 이너뷰티(inner beauty) 식품인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
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